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.2015年7月10日；10（7）：e0132680。
doi:10.1371/journal.pone.0132680。 2015年电子收集。

突变研究揭示HDAC4和-5催化进入位点的边缘是SMRT辅表位的主要结合面

Gwang Sik Kim先生 1, 哈恩·郑 1, 金正顺（Jeong-Sun Kim） 2, 李英哲 1
附属公司

突变研究揭示HDAC4和-5催化进入位点的边缘是SMRT辅表位的主要结合面

Gwang Sik Kim先生等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）通过调节染色质和相关转录因子的乙酰化水平，在真核基因表达中发挥着关键作用。与I类HDACs（HDAC1、-2、-3和-8）相比，IIa类HDAC（HDAC4、-5、-7和-9）具有隐性脱乙酰酶活性，并招募SMRT-HDAC3复合物抑制体内靶基因。在这方面，已知IIa类HDAC的HDAC结构域与SMRT阻遏结构域3（SRD3c）的C末端区域之间的特定相互作用至关重要，但这种相互作用的分子基础尚未解决。在这里，我们使用了一个广泛的突变体筛选系统，命名为“分区一加二杂交系统”，在HDAC4（HDAC4c）和-5的整个催化结构域上分离SRD3c相互作用缺陷（SRID）突变体。HDAC4c结构上SRID突变的表面呈现显示，大多数突变定位于催化进入位点的边缘表面，强烈表明该突变热点区域是SRD3c的主要结合表面。值得注意的是，在SRD3c结合所需的HDAC4c表面残基中，一些残基（C667、C669、C751、D759、T760和F871）仅存在于IIa类HDAC中，为SRD3c和IIa类酶之间的特定相互作用提供了分子基础。为了研究SRID突变的功能后果，测定了从HEK293细胞中免疫纯化的HDAC4突变体的体外HDAC活性。与野生型相比，HDAC4c突变体的HDAC活性水平显著降低。与此相一致，HDAC4c的SRID突变阻止了HDAC4c与体内SMRT-HDAC3复合物的关联。我们的发现可能为HDAC4和-5与SRD3c的结合界面提供结构上的见解，作为设计这些酶特异性调节剂的新靶点。

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图1
图1。通过分区OPTHiS获得的HDAC4c和-5c的SRID突变体。
（A）用分区OPTHiS筛选SRID突变株的缺口质粒和HDAC4c和-5c靶区的示意图。分别使用间隙质粒G4N和G4T筛选针对HDAC4c的HDAC4cN（氨基酸651-865）和HDAC4cT（氨基酸865-1055）区域的SRID突变体。对于HDAC5c，分别使用间隙质粒G5N和G5M分离HDAC5c的HDAC5cN（氨基酸680至831）和HDAC5cM（氨基酸829至1010）区域中存在的SRID等位基因。分别使用指示的限制性内切酶（顶部）和指示的引物集（箭头）制备线性化的间隙质粒和诱变PCR产物。（B）HDAC4c（上部）或HDAC5c（下部）的SRID等位基因列表。基于序列比对，在HDAC4c和-5c的SRID突变体之间普遍存在灰色盒中的残基。HDAC4c表面存在的残留物以粗体显示，IIa类HDAC特定残留物则以红色显示。
图2
图2。GST下拉分析中SRD3c与分离的HDAC4c和-5c突变体的缺陷相互作用。
纯化GST-SRD3c蛋白并测试其与野生型（WT）和突变型35S标记的HDAC4c（A）或-5c（B）蛋白。GST蛋白作为阴性对照。输入表示10%的在体外下拉分析中使用的翻译HDAC蛋白。
图3
图3。SRD3c与HEK293细胞中HDAC4c和-5c的SRID突变体的缺陷相互作用。
（A）共聚焦激光扫描显微镜图像，通过BiFC分析说明SRD3c和HDAC4c或-5c之间的相互作用。荧光信号主要定位于细胞核内，呈散斑状。放大倍率：180 X。（B） ，（C）BiFC分析中荧光信号的定量测量，由SRD3c与HDAC4c（B）或-5c（C）的指示SRID突变体关联产生。将KGN-SRD3c的表达构建物（1μg）和指示的KGC-HDAC4c或-5c突变体（1μg）瞬时共转染到HEK293细胞中。转染48小时后，用荧光分光光度计测量全细胞裂解液的荧光信号。将E.V（空载体）和N.T（无转染）样本作为阴性对照。这个第页-野生型和突变型之间所有比较组的值均小于0.01。RFU：相对荧光单位。
图4
图4。HDAC域MSA上SRID突变的位置。
使用ESScript 3.0程序建立了从HDAC1到HDAC11的催化结构域的基于结构的MSA，并显示了抑制剂结合HDAC4c结构的二级结构元素（PDB代码2VQJ）。粉红色和蓝色的残基分别代表在HDAC4c和-5c突变体中特异发现的SRID等位基因。带黄色阴影的残基表明，在MSA的基础上，SRID等位基因通常位于HDAC4c和-5c序列的相同位置。红色三角形：HDAC4c突变体的残基位于HDAC4c结构的表面区域。蓝色方框表示SRID突变的热点区域，这些突变在HDAC家族的所有类别中普遍存在。红色方框表示SRID突变的热点区域，对应于IIa类HDAC特异性区域。
图5
图5。HDAC4c结构上SRID突变的表面呈现。
（A）HDAC4c结构的功能区图（PDB代码2VQJ）[40]。结构锌结合域用品红表示。两个锌离子及其螯合残基分别被绘制为球体和棒状。（B）HDAC4c的SRID突变位置显示在HDAC4c结构的表面（PDB代码2VQJ）。在HDAC4c的SRID突变体中，有21个残基位于表面，它们的表面位置以橙色显示。（C）HDAC5c的SRID突变在HDAC4c结构相应位置的表面呈现。根据MSA数据，HDAC5c的SRID突变位置被改变为HDAC4c的位置，并以橙色显示在HDAC4c结构的表面。IIa类HDAC特有的残留物以黄色表示。
图6
图6。损失在体外免疫纯化HDAC4c突变体的HDAC活性，因为不能与内源性SMRT-HDAC3复合物结合。
（A） 体外HDAC分析和（B）免疫纯化HEK293细胞HDAC4c SRID突变蛋白的联合免疫沉淀分析。通过瞬时转染在HEK293细胞中与HDAC3共表达所示HDAC4c蛋白的HA标记版本，并使用琼脂糖珠和抗-HA抗体从细胞裂解液（300μg）中纯化。（A） 免疫复合物随后受到在体外以荧光偶联Lys乙酰胺为底物的HDAC分析。HeLa核提取物（1μg）作为阳性对照。这个第页-野生型和突变体之间的所有比较组的值都小于0.0001。RFU：相对荧光单位。（B） 对于联合免疫沉淀分析，从1 mg全细胞裂解液中制备免疫沉淀，并通过免疫印迹分析HA-HDAC4c和HDAC3的存在。
图7
图7。HDAC4c Gal4N融合SRID突变体的转录抑制活性。
（A） HDAC4c突变体的哺乳动物单杂交检测。用Gal4-tk-luciferase报告质粒（200 ng）和野生型（WT）或Gal4N-HDAC4c质粒的指示突变体（50和100 ng）以及pCMV-β-gal载体（100 ng）共同转染HEK293细胞。转染48小时后，测量荧光素酶活性并将其归一化，如材料和方法部分所述。折叠抑制表示从至少两个重复进行的独立实验中获得的平均±S.E.值。这个第页-野生型和突变型之间所有比较组的值均小于0.05。RLU：相对荧光素酶活性。（B）使用抗Gal4N小鼠单克隆抗体（Santa Cruz，sc-510；1:3000稀释）对全细胞裂解物（15μg）进行免疫印迹分析，以检测Gal4N-HDAC4c蛋白的野生型（WT）或指示突变体的表达水平。
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出版物类型

赠款和资金

这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，由韩国政府资助（NRF 2011-0029484）。