Development of a high-resolution NGS-based HLA-typing and analysis pipeline

doi:10.1093/nar/gkv184

.2015年6月23日；43（11）：e70。

doi:10.1093/nar/gkv184。 Epub 2015年3月9日。

基于NGS的高分辨率HLA分型分析流水线的研制

附属公司

¹德国基尔大学临床分子生物学研究所m.wittig@mucosa.de。
²挪威PSC研究中心，移植医学部，癌症医学、手术和移植科，奥斯陆大学医院，奥斯陆Rikshospitalet，挪威K.G.Jebsen炎症研究中心，奥斯陆奥斯陆大学临床医学研究所，挪威内科研究所，挪威奥斯陆奥斯陆大学医院癌症医学、手术和移植科。
^三Christian-Albrechts-University of Kiel，计算机科学系，德国基尔。
⁴德国基尔Muthesius美术与设计学院。
⁵基尔大学，临床分子生物学研究所，德国基尔。
⁶挪威PSC研究中心，移植医学部，癌症医学、手术和移植科，奥斯陆大学医院，奥斯陆Rikshospitalet，挪威K.G.Jebsen炎症研究中心，奥斯陆奥斯陆大学临床医学研究所，挪威内科研究所，挪威奥斯陆奥斯陆大学医院癌症医学、外科和移植科，奥斯陆奥斯陆大学医院消化科，移植医学科，癌症医学、手术和移植科。
⁷马克斯·普朗克分子遗传学研究所，德国柏林。
⁸吕贝克大学，德国吕贝克输血医学研究所。
⁹挪威PSC研究中心，移植医学部，癌症医学、手术和移植科，奥斯陆大学医院，奥斯陆Rikshospitalet，挪威K.G.Jebsen炎症研究中心，奥斯陆奥斯陆大学临床医学研究所，挪威内科研究所，挪威奥斯陆奥斯陆奥斯陆大学医院癌症医学、手术和移植科奥斯陆大学医院移植医学科癌症医学、外科和移植科消化科t.h.karlsen@medisin.uio.no。
¹⁰德国基尔大学临床分子生物学研究所a.franke@mucosa.de。

PMID： 25753671
PMCID公司：项目经理4477639
内政部： 10.1093/nar/gkv184

基于NGS的高分辨率HLA分型和分析流水线的开发

迈克尔·维蒂格等。核酸研究. 2015.

.2015年6月23日；43（11）：e70。

doi:10.1093/nar/gkv184。 Epub 2015年3月9日。

附属公司

¹德国基尔大学临床分子生物学研究所m.wittig@mucosa.de。
²挪威PSC研究中心，移植医学部，癌症医学、手术和移植科，奥斯陆大学医院，奥斯陆Rikshospitalet，挪威K.G.Jebsen炎症研究中心，奥斯陆奥斯陆大学临床医学研究所，挪威内科研究所，挪威奥斯陆奥斯陆大学医院癌症医学、手术和移植科。
^三Christian-Albrechts-University of Kiel，计算机科学系，德国基尔。
⁴德国基尔Muthesius美术与设计学院。
⁵基尔大学，临床分子生物学研究所，德国基尔。
⁶挪威PSC研究中心，移植医学部，癌症医学、手术和移植科，奥斯陆大学医院，奥斯陆Rikshospitalet，挪威K.G.Jebsen炎症研究中心，奥斯陆奥斯陆大学临床医学研究所，挪威内科研究所，挪威奥斯陆奥斯陆大学医院癌症医学、外科和移植科，奥斯陆奥斯陆大学医院消化科，移植医学科，癌症医学、手术和移植科。
⁷马克斯·普朗克分子遗传学研究所，德国柏林。
⁸吕贝克大学，输血医学研究所，吕贝克，德国。
⁹挪威PSC研究中心，移植医学部，癌症医学、手术和移植科，奥斯陆大学医院，奥斯陆Rikshospitalet，挪威K.G.Jebsen炎症研究中心，奥斯陆奥斯陆大学临床医学研究所，挪威内科研究所，挪威奥斯陆奥斯陆奥斯陆大学医院癌症医学、手术和移植科奥斯陆大学医院移植医学科癌症医学、外科和移植科消化科t.h.karlsen@medisin.uio.no。
¹⁰德国基尔Christian Albrechts大学临床分子生物学研究所a.franke@mucosa.de。

PMID： 25753671
PMCID公司：项目经理4477639
内政部： 10.1093/nar/gkv184

摘要

人类白细胞抗原（HLA）复合体包含人类基因组中最多的多态性基因。经典的HLA I类和II类基因定义了适应性免疫反应的特异性。HLA基因的遗传变异与自身免疫和感染性疾病的易感性有关，在移植医学和免疫学中起着重要作用。目前，HLA基因的特征是使用有限扩增子序列的桑格或下一代测序（NGS）或标记的寡核苷酸用于等位基因特异性序列。基于NGS的高质量方法是专有的，不公开。在这里，我们介绍了第一种用于NGS的高度自动化的开放套件/开源HLA分型方法。该方法采用溶液中靶向捕获经典的I类（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和II类HLA基因（HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DWB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1）。调用算法允许高度自信的等位基因调用到三场分辨率（cDNA核苷酸变体）。该方法在357份具有已知HLA等位基因的商用DNA样本上进行了验证，这些样本是通过经典分型获得的。我们的结果显示，在完全自动化的方式下，平均准确的等位基因调用率为0.99，同时识别了参考数据中的错误。最后，我们的方法提供了添加进一步浓缩目标区域的灵活性。

©作者2015。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
分析软件。该图显示了分析软件GUI（图形用户界面）的屏幕截图。对于此图，我们合并了两个不同数据视图的两个屏幕截图，由白色对角线分隔。图的左侧显示了实现的单起点覆盖率（有关更多详细信息，请参见图2）。右侧部分显示了相同路线的相应单起点映射。用户界面的不同部分如下：左侧的列表视图显示了添加用于分析的示例。此示例列表由示例名称后跟一个彩色矩形组成。颜色是样本状态的编码，分别是白色（添加用于分析）、黄色（分析运行）、绿色（分析完成）和红色（分析失败）。中间部分分为三个部分。在顶部，用户可以为所选样本选择轨迹。右侧的“更改视图”按钮在覆盖范围和阅读视图之间切换。下面，用户找到确定HLA类型的NGS数据可视化。底部的表格显示了不同可能的HLA类型的排序列表。最顶层的HLA类型最有可能由算法确定。用户可以更改该顺序以手动更正可能的错误。在GUI的右侧，用户可以找到另外两个表。上表包含未通过初始QC的等位基因的排序列表（参见材料和方法）。“error”列显示核苷酸位置的数量，计算出QC失败值。下表显示了未100%覆盖的前50个等位基因。该表按未覆盖的基数按升序排序。这两个表中的等位基因可以手动包含在基因型调用中。另一方面，用户可以将等位基因从等位基因调用移动到这些表中的一个。这允许手动评估调用算法。可以添加未通过初始预过滤步骤的低覆盖等位基因。还可以分析未100%覆盖的降解DNA。在应用程序窗口的顶部，用户会发现一个小的灰色条。当鼠标指针悬停在该区域时，带有用于添加样本、启动分析和分析报告的按钮的工具箱向下移动（显示在状态栏下方的底部）。在我们的在线资源中可以找到包含更多详细信息和工作流示例的教程http://www.ikmb.uni-kiel.de/resources/download-tools/software/hlassign.

**图2。**
错误参考HLA等位基因的示例。图中显示了三种不同基因外显子2的独特起始点覆盖率（顶部）和相应的短测序读数（底部）*HLA-B型*IHW0994等位基因。顶部的红色背景显示了理想的理想覆盖范围，即具有100 bp读数的完美单起始点映射和外显子边界处70 bp的最小截断映射长度。黑色曲线显示样本的唯一起始点覆盖率，相应的读数显示在图的下面板中*HLA-B型*如商业提供商所列，此示例的值为38:01/51:06。如上所示，当考虑38:01作为候选等位基因时，该外显子的3'部分没有被均匀覆盖，因此显示出异常的读取分布（见紫色线）。由于38:01:01和38:02:01之间的唯一区别是位于外显子2的3'端上游32和34个碱基的核苷酸，因此很可能参考数据集是错误的。这里我们可以证明*HLA-B型*在6位数水平上，IHW0994的基因型为38:02/51:06或38:02:01/51:06:01。后来在另一个实验室通过Luminex®HLA分型证实了这一点。

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1. Thorsby E.，Lie B.A.HLA相关的自身免疫性疾病遗传易感性：涉及的基因和可能的机制。运输。免疫学。2005;14:175–182.-公共医学
1. Traherne J.A.人类MHC结构和进化：疾病关联研究的意义。国际免疫学杂志。2008;35:179–192.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Flomenberg N.、Baxter-Lowe L.A.、Confer D.、Fernandez-Vina M.、Filipovich A.、Horowitz M.、Hurley C.、Kollman C.、Anasetti C.、Noreen H.等人。HLA I类和II类高分辨率匹配对无关供体骨髓移植结果的影响：HLA-C不匹配与移植结果的强烈不良影响有关。鲜血。2004;104:1923–1930.-公共医学

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