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.2015年2月；13(2):358-67.
doi:10.158/1541-7786.MCR-14-0333。 Epub 2014年10月10日。

DAPK3抑制腺泡形态发生，是小鼠发育所必需的

布兰登·A·科赫 1, 林恩·S·怀特 1, 大卫·皮尼卡·沃姆斯 2
附属公司

DAPK3抑制腺泡形态发生，是小鼠发育所必需的

布兰登·A·科赫等。 摩尔癌症研究. 2015年2月.

摘要

死亡相关蛋白激酶（DAPK3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与对组织稳态和哺乳动物生物学重要的各种信号通路。DAPK3被认为是一种假定的肿瘤抑制因子，其发挥抑制作用的分子机制尚不完全清楚，该领域缺乏合适的小鼠模型。为了解决这些空白，使用了体外三维肿瘤发生模型，并生成了一个组成性DAPK3基因敲除小鼠。在3D形态发生模型中，DAPK3通过慢病毒介导的敲除而丢失，通过加速腺泡增殖和凋亡而增大腺泡大小，同时保持腺泡极性。DAPK3的耗竭增强了生长因子依赖性mTOR的激活，此外，增大的DAPK3腺泡结构对低剂量雷帕霉素具有独特的敏感性。同时敲除RAPTOR，一个关键的mTORC1成分，逆转了DAPK3缺失结构中增加的腺泡大小，表明存在上位性相互作用。使用一种有效的基因陷阱策略来生成一个组成型DAPK3敲除小鼠，证明DAPK3对小鼠早期发育至关重要。Dapk3启动子在发育中的小鼠中表现出时空活性，并在成年小鼠的正常乳腺上皮中积极表达。重要的是，根据Oncomine临床乳腺癌标本数据库的观察，DAPK3表达减少与导管原位癌（DCIS）和更具侵袭性乳腺癌的发生相关。

启示：DAPK3的新型细胞和小鼠模型研究揭示了其抑瘤机制，并提供了DAPK3与早期发育相关的直接证据。

PubMed免责声明

利益冲突声明

COI声明：作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
DAPK3的缺失增强了MCF10A腺泡的形态发生。（A） 稳定表达shNeg或两个独立基因的MCF10A细胞Dapk3型发夹（sh1，sh2）在Matrigel上培养12天。Brightfield图像显示特定时间点的典型结构。比例尺，100μm。（B） 在不同时间点稳定表达各自发夹的MCF10A腺泡的平均直径。这里描述了三个独立实验的代表性数据。误差条表示95%置信区间。*，相对于对照组，P<0.005。（C） DAPK3的缺失显著增加了Matrigel上生长的第6天腺泡中的细胞数量。误差线表示三个组合独立实验的95%置信区间。*，相对于对照组，P<0.003。（D） DAPK3缺失的腺泡（sh1）继续显示顶端基底外侧标记物的正确定位。分析第6天腺泡的基底外侧标记整合素α6（红色，顶面）和高尔基顶端标记giantin（红色，底面）的正确定位以及DNA染色（TOPRO3，蓝色）。比例尺，100μm。
图2
图2
缺乏DAPK3的腺泡增殖和凋亡增加。（A） 腺泡Ki67（绿色）和DNA（TOPRO3，蓝色）染色的荧光共聚焦显微镜分析。这里描述的是两个独立实验的代表性图像。误差条表示95%置信区间。*，P<0.001。比例尺，100μm。（B） 腺泡的荧光共聚焦显微镜分析，用于裂解半胱天冬酶3（CC3，绿色）和DNA（TOPRO3，蓝色）染色。这里描述的是三个独立实验的代表性图像。误差条表示95%置信区间。*，相对于对照组，P<0.0001。比例尺，100μm。
图3
图3
DAPK3的稳定过表达抑制腺泡形态发生。（A） 荧光显微镜观察第8天稳定过度表达GFP或GFP-DAPK3的活腺泡。比例尺，100μm。（B） GFP或GFP-DAPK3稳定腺泡第8天GFP+腺泡直径分析。误差线表示三个组合独立实验的95%置信区间。*，相对于对照组，P<0.0001。
图4
图4
稳定MCF10A细胞和腺泡中DAPK3缺失后，mTOR特异性S6K-S6通路的激活增加。（A） 对在2D培养基中生长并用培养基、EGF（10ng/mL）或胰岛素（10ug/mL）处理24小时的过夜缺血清MCF10A稳定细胞进行Western blot分析。这里显示的是三个独立实验的代表性印迹。标准化密度计分析显示在每个面板下方。（B） Matrigel培养6天的MCF10A腺泡的Western blot分析。这里显示的是两个独立实验的代表性斑点。
图5
图5
DAPK3通过mTORC1/RAPTOR抑制腺泡形态发生。（A） MCF10A腺泡生长4天，然后用100nM雷帕霉素处理4天的分析。这里显示的是两个独立实验的代表性数据。误差条表示95%置信区间。**，P<0.0001.*，P<0.005。（B） 分析MCF10A腺泡生长4天，然后用不同浓度的LY294002（载体，100nM，10μM或50μM）处理额外4天。误差条表示三个组合独立实验的95%置信区间。*，P<0.026。（C） 稳定表达各种shRNA发夹组合的MCF10A细胞第4天腺泡分析。MCF10A与指示的shRNA-尿霉素（shNeg）同时转导P（P），第1页P（P）)和shRNA-羟基霉素（shRAPTORH、，骗子H（H）)慢病毒。这里显示的是两个独立实验的代表性数据。误差条表示95%置信区间。*，P<0.01。（D） DAPK3对mTOR-S6K-S6信号负调控的拟议模型。
图6
图6
DAPK3基因敲除小鼠的产生和鉴定。（A） 的示意图Dapk3型Gt（YTA407）比格描述Southern杂交探针（A，B）位置以及剪接受体位点（SA，绿色）、β-半乳糖苷酶-新霉素融合的位点(β地缘，蓝色）和聚A尾部(pA型，红色）。（B） Southern印迹评估Dapk3型Gt（YTA407）比格YTA407 ES系和小鼠的基因座以及代表性PCR动物基因分型。（C） 从杂合杂交中分离出的经基因型确认的囊胚的Brightfield图像。（D） 从杂合子杂交（顶部）与野生型X杂合子杂种（底部）提取的子宫中出现增加的吸收E10.5胎儿（红色箭头）。（E） E8.5（顶部）和E10.5（底部）经基因型确认的杂合子胚胎发育中心脏和脊索（红色箭头）中的独特和局部β-半乳糖活性。
图7
图7
Dapk3型在小鼠乳腺上皮和DAPK3型与正常对照组相比，侵袭性人类乳腺癌样本中的mRNA下调（Oncomine数据库）。（A） 小鼠处女成年窝友乳腺脂肪垫的全场免疫荧光，DNA（蓝色）、LacZ（绿色）和E-cadherin（红色）染色；左，野生型；右，杂合子Dapk3。（B）DAPK3型人导管癌mRNA显著降低就地（DCIS）样本相对于正常患者样本。*，P<0.002。（C）DAPK3型与DCIS患者样本相比，侵袭性乳腺癌患者样本中的mRNA显著降低。*，P<0.04。
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