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.2013年12月23日；8（12）：e82944。
doi:10.1371/journal.pone.0082944。 2013年电子收集。

抗体介导靶向Orai1钙通道抑制T细胞功能

詹妮弗·考克斯 1, 斯科特·哈塞尔 1, 亨里克·瑟恩德加德 2, 基斯汀·罗普斯托夫 三, John-Vu Bui公司 1, 珍跑鹿 4, 张军 5, 詹国丽 6, 卡斯珀·兰伯斯 7, 彼得·海尔丁·克维斯特 三, 瑟伦·帕德克杰 8, 克劳斯·哈斯 2, 斯特凡·扎恩 9, 瓦莱丽·奥德加 1
附属公司

抗体介导靶向Orai1钙通道抑制T细胞功能

詹妮弗·考克斯等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

尽管离子通道作为治疗靶点具有吸引力，但在临床开发中还没有针对离子通道的单克隆抗体的例子。抗体介导的离子通道抑制可以提供一种定向、特异的治疗方法。为了研究抗体抑制离子通道功能的潜力，我们重点研究了Orai1，即T细胞中负责储存操作钙进入（SOCE）的钙通道孔亚单位。效应T细胞是自身免疫性疾病发病机制的关键驱动因素，钙信号对T细胞激活、增殖和细胞因子产生至关重要。我们在这里展示了针对血浆跨膜蛋白细胞外环的特异性抗人Orai1单克隆抗体（mAb）的产生。抗Orai1单克隆抗体与淋巴细胞上的天然Orai1结合，导致通道的细胞内化。因此，T细胞增殖和细胞因子的产生在体外受到抑制。在体内，抗Orai1单克隆抗体在人类T细胞介导的移植物抗宿主病（GvHD）小鼠模型中有效。本研究证明了抗体介导的Orai1功能抑制的可行性，更广泛地说，揭示了用生物制剂靶向离子通道治疗自身免疫和其他疾病的可能性。

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利益冲突声明

竞争利益：资金来自商业来源Novo Nordisk，所有作者都是Novo Nodisk的现任员工或合作者，没有其他相互冲突的财务利益。这并不会改变作者对所有PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

图1
图1。特异性抗人Orai1单克隆抗体的制备。
A类)人类Orai1四膜跨膜蛋白分别具有约20和40个氨基酸的两个细胞外环。B类)ELISA测定中纯化的单克隆抗Orai1抗体与环2肽结合的滴定。C类)Ba/F3细胞过度表达人（h）Orai1、Orai2或Orai3或天)用Orai1-targeting shRNAi或scramb control转导的Jurkat细胞与指定浓度的纯化抗Orai1孵育，并用荧光结合山羊抗鼠IgG检测。MFI表示荧光强度中值。图B中的实验重复进行，代表三个单独的实验。面板C来自一个实验的单井，面板D来自单井，代表两个单独的实验。
图2
图2。抗Orai1抗体与原代免疫细胞上的天然Orai1结合。
A类)代表性直方图显示αOrai1或同型对照物与原代免疫细胞（CD3）结合+CD4细胞+，CD3+CD8（CD8）+和CD19+)使用12.5µg/mL抗体从健康人的外周血中提取。B类)αOrai1和mIgG1控制结合记忆（IgD）的中值荧光强度（MFI）负极CD27型+)和幼稚（IgD+CD27型负极)CD19编号+B细胞；抗体用量为12.5µg/mL。C类)αOrai1和mIgG1对照与幼稚（CD45RA）的结合+)和存储器（CD45RO+)CD3（CD3）+CD4细胞+和CD3+CD8（CD8）+T细胞。天)aOrai1与非淋巴细胞NK细胞（CD3）的结合负极CD19编号负极CD14号机组负极CD56型+)，CD86+和CD86负极树突状细胞（CD3负极CD19编号负极CD14号机组负极CD11c公司+人类白细胞抗原-DR+)，CD14+单核细胞和粒细胞。所有数据均代表至少三个独立捐助者。
图3
图3。抗Orai1抗体抑制钙流并诱导T细胞内吞。
A类)αOrai1抑制thapsigargin诱导的Jurkat细胞钙通量。数据计算为在不添加抗体的情况下钙内流后ΔRFU的百分比。B类)用50µg/mLαOrai1或mIgG1对照品处理的Jurkat细胞中，具有代表性的thaspigargin（TG）诱导的钙内流。C类)纯化人CD4中的αOrai1内化+细胞在37°C孵育后，通过流式细胞仪使用2µg/mLαOrai1-AF647进行测量，并使用生物素化抗Cy5和链霉亲和素BV421进行细胞表面检测。将4°C下的样品平行分析，作为内化的阴性对照。数据以CD4总量的百分比计算+是三个捐赠者的平均值。天)表面结合αOrai1与总内化和表面αOrai的代表性流式细胞术图。面板A和B代表三个独立实验，面板C和D代表两个实验。
图4
图4。抗Orai1抗体抑制T细胞反应和增殖。
A类)在有对照mIgG1、αOrai1或环孢素A（CsA）的情况下，用αCD3/αCD28处理的PBMC的增殖。数据以不含抑制剂的CFSE稀释细胞的百分比计算。B类)不含抑制剂或含有333 nM CsA或αOrai1（相当于50µg/mL）的αCD3/αCD28处理PBMC的代表性CFSE稀释痕迹。FACS图在可行CD5上设置门控+T细胞。C类)在用αCD3/αCD28刺激后，分别在16和72小时用20.8 nM CsA或αOrai1（相当于3.1µg/mL）处理对IL-2和IFN-γ产生的影响。天)破伤风类毒素诱导PBMC增殖的典型CFSE稀释痕迹。FACS图在可行CD3上设置门控+CD4细胞+T细胞**P<0.01，***P<0.001。面板A-C代表三个独立实验（每个实验至少有两个捐赠者），面板D来自一个实验。
图5
图5。类风湿关节炎患者的滑膜组织中富含Orai1表达细胞。
用兔抗Orai1（Sigma）通过免疫组织化学对类风湿性关节炎患者或健康对照的滑膜组织切片进行Orai1染色，并通过给每个染色的组织切片分配0–4的半定量评分来评估Orai1阳性免疫细胞的数量。A类)类风湿关节炎滑膜组织的Orai1免疫组化。B类)A的放大倍数。C类)正常滑膜组织的Orai1免疫组化。天)直方图显示了类风湿关节炎患者（RA）（n=24）或正常滑膜组织（n=11）滑膜组织中Orai1-阳性细胞数量的平均半定量分数。误差条，+/-SEM。比例尺，100µm。
图6
图6。抗Orai1减少RA滑液细胞产生细胞因子。
A类)滑液细胞（SFCs）的典型正向和侧向散射，淋巴细胞（lym）、单核细胞（mono）和中性粒细胞（neuto）的门控以及CD4上Orai1的表面染色+，CD8+和CD19+淋巴细胞，CD14+单核细胞和CD66b+RA滑液中性粒细胞。B类)IL-2和C类)在mIgG1同型对照、αOrai1或环孢素A（CsA）存在下培养40小时后，αCD3/αCD28共刺激SFC分泌IFN-γ。天)在含有对照mIgG1、抗Orai1、CTLA4-Ig或环孢素A（CsA）的情况下，SEB治疗RA患者PBMC的增殖。数据以不含抑制剂的CFSE稀释细胞的百分比计算。电子)在333nM抑制剂存在下，SEB诱导RA PBMC增殖的典型CFSE稀释痕迹。所有面板都是两个独立实验的代表。
图7
图7。抗人Orai1抗体在人源化小鼠中减弱异种GvHD。
在整个研究过程中，各组人源化NOG小鼠每周接受3次10/kgαOrai1（N=11）或mIgG1同型对照（N=12）治疗。未转移PBMC的小鼠作为对照组（N=3）。A类)Orai1在人CD4上的染色+和CD8+GvHD发病后人源化小鼠脾脏的T细胞。B类)Kaplan-Meier曲线描述了无GvHD小鼠的百分比，定义为体重减轻<20%。C类)人CD4绝对数+和CD8+在PBMC注射后的指定天，用流式细胞仪对血液中的T细胞进行定量。天)用ELISA测定血浆中的人干扰素-γ，水平虚线表示检测范围。电子)肝和肺石蜡包埋切片用抗人CD8免疫组织化学染色，并用自动图像分析软件（VIS）分析CD8密度（用CD8染色的组织面积%）。数据为单个或平均+/-SEM，代表两个单独的实验**Mantel-Cox对数秩检验与PBMCs+mIgG1相比P<0.01（B）*Mann-Whitney U检验（B-D）显示，p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。在（D）中，为高于范围的样品提供了最大分析值，并将其纳入统计数据，而低于检测值的样品则用值1绘制，但未纳入统计数据。
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