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.2012年8月15日；32(33):11356-64.
doi:10.1523/JNEUROSCI.6265-11.2012。

钙激活蛋白酶钙蛋白酶介导的K-Cl共转运蛋白KCC2的活性依赖性裂解

马丁·普斯卡尔乔夫 1, 法拉斯·艾哈迈德, 凯凯拉, 彼得·布莱塞
附属公司

钙激活蛋白酶钙蛋白酶介导的K-Cl共转运蛋白KCC2的活性依赖性裂解

马丁·普斯卡尔乔夫等。 神经科学. .

摘要

K-Cl共转运体KCC2在神经元氯离子调节中起着关键作用。在成熟的中枢神经元中，KCC2负责低细胞内Cl（-）浓度（[Cl（-）]（i）），形成GABA（A）受体介导的超极化反应的基础。在各种生理和病理生理条件下，KCC2功能和表达发生了快速变化。在这里，我们表明，在急性大鼠海马脑片上应用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺和依米汀对KCC2总蛋白水平和K-Cl协同转运蛋白功能没有影响。此外，用leupeptin阻断组成溶酶体降解并没有引起KCC2蛋白水平的显著变化。这些发现表明KCC2总蛋白库的基本周转率较低。在存在谷氨酸受体激动剂NMDA的情况下，KCC2总蛋白水平在4小时内下降到约30%，这种作用被钙激活蛋白酶钙蛋白酶抑制剂钙肽和MDL-28170阻断。海马脑片在无镁溶液中孵育诱导的类间质活动导致CA1锥体神经元中KCC2介导的Cl（-）转运效率快速降低，与之平行的是总KCC2蛋白和质膜KCC2蛋白的降低。这些作用被钙蛋白酶抑制剂MDL-28170阻断。综上所述，这些发现表明钙蛋白酶激活导致KCC2断裂，从而调节GABA能信号。

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数字

图1。
图1。
阻断蛋白质合成不会影响KCC2蛋白水平。A类，应用100μ米环己酰亚胺（CHX）或100μ米依米汀抑制了[35S] 海马脑片中的蛋氨酸（放射自显影图，上图）。SDS-PAGE显示装载了类似数量的蛋白质（考马斯染色凝胶，底部）。B类、海马脑片匀浆在CHX和依米汀中孵育的免疫印迹。微管蛋白信号（55 kDa）证实，装载了类似数量的蛋白质。在蛋白质合成停滞4小时后，KCC2信号（～140 kDa）与相应的对照组（ctrl）没有显著差异（ctrl:90.3±5.2%；CHX:85.3±8.4%；催吐素：90.6±8.0%；第页=0.824）。通过Kruskal–Wallis单因素方差分析（ANOVA）和Mann–Whitney的排名评估统计显著性临时的测试。C类，涂抹50μ米leupeptin（leu）作用4h后，海马脑片KCC2蛋白水平无明显变化（105.1±10.6%）。通过单因素方差分析评估统计显著性。的值n个如条形图所示。误差条表示SEM。
图2。
图2。
阻断蛋白质合成不会影响KCC2功能。A类——F类，全细胞，膜片钳记录的未老化诱导的GABAA类-介导电流(我GABA公司)和E类GABA公司在CA1锥体神经元中人工施加体细胞氯负极负荷显示CA1锥体神经元能够产生速尿敏感的体脂蛋白ΔE类GABA公司在控制条件下稳定至少4h。CHX（100μ米)未引起Δ变化E类GABA公司.A类——D类，示例E类GABA公司在体细胞和树突顶端50μm处进行记录。I–V型曲线基于我GABA公司在不同的保持电位下(V（V）小时).A类，0–2小时控制；B类，3-4小时控制；C类，瑞士；D类，愤怒。由水平条指示的未老化闪光。E类，Δ的散点图E类GABA公司随着时间的推移，在对照组和CHX治疗的CA1神经元中。该线表示控制单元的线性拟合。F类，Δ的量化E类GABA公司在控制条件下（0–2小时：−6.05±0.31 mV/50μm；3–4小时：–6.28±0.28 mV/50微米），随时间变化显示出稳定的梯度。ΔE类GABA公司不受CHX影响（−5.52±0.36 mV/50μm），但对速尿敏感（0-4小时：−3.03±0.30 mV/50微米；第页< 0.001). 实验是在10μ米布美他尼。使用Scheffe’s单因素方差分析评估统计显著性临时的测试。的值n个在条形图中给出。误差条表示SEM。
图3。
图3。
KCC2是钙蛋白酶底物。A类当大鼠脑匀浆暴露于31.5 U/ml重组大鼠钙蛋白酶-2时，免疫印迹中的KCC2信号降低。30分钟后观察到KCC2免疫信号几乎完全丢失。钙蛋白酶抑制剂MDL-28170（MDL）阻断了KCC2信号的减少。B类，使用针对KCC2 N末端表位（抗NTD-KCC2）的抗体进行免疫印迹，显示KCC2的截短N末端片段，分子量（Mw）为～100 kDa。C类，D类，离子霉素触发KCC2蛋白水平下降。C类，在钙存在下孵化脑片2+离子载体离子霉素（50μ米; 4小时）导致KCC2蛋白水平明显降低，当离子霉素与MDL-28170一起应用时，这种作用被阻断。D类定量免疫印迹信号的平均值显示，离子霉素治疗后KCC2显著降低（39.6±2.6%；第页< 0.05). 离子霉素加MDL-28170样品的平均值与对照组无差异（Ctrl；86.6±8.3%；第页= 0.477). 使用Scheffe's的单向方差分析评估统计显著性临时的测试。的值n个如条形图所示。误差条表示SEM。
图4。
图4。
NMDA诱导的兴奋毒性导致钙蛋白酶介导的KCC2降解。A类，实验设计方案。在存在不同抑制剂组合的情况下预孵育冠状脑片（详细信息请参见材料和方法）。预培养结束时，NMDA（100μ米)添加30分钟。NMDA培养结束时间定义为0小时。B类NMDA孵育诱导KCC2蛋白水平快速下降。Tubulin被用作负荷控制。C类NMDA孵育后，定量免疫印迹信号的平均值显示KCC2信号显著降低（1 h后0 h对照组KCC2蛋白水平的80.6±7.0%；2 h后55.1±9.8%；4 h后36.6±3.4%），而信号在对照条件下保持稳定（4 h后98.7±5.0%）。D类，E类，NMDA在NMDAR拮抗剂AP5和MK-801（100和10μ米)阻断KCC2降解（89.0±12.1%）。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺对NMDA诱导的KCC2降解没有影响（38.5±6.3%）。蛋白酶体抑制剂乳酸菌素（1μ米)未阻止KCC2的下调（24.3±5.7%）。溶酶体降解抑制剂leupeptin（50μ米)阻断KCC2蛋白下降（115.3±8.8%）。两种钙蛋白酶抑制剂MDL-28170（MDL）（30μ米)和钙蛋白酶肽（30μ米)二者均阻断NMDA诱导的KCC2降解（102.9±5.7%和107.3±9.2%）。通过Kruskal–Wallis单因素方差分析（ANOVA）和Mann–Whitney的排名评估统计显著性临时的测试。的值n个如条形图所示。误差条表示SEM。
图5。
图5。
间质样活性导致KCC2的钙蛋白酶依赖性功能失活。A类，电流钳记录显示海马脑片在镁中孵育诱导CA1锥体细胞神经元活性增加2+-游离生理溶液。钙蛋白酶抑制剂MDL-28170并未阻止活性增加。B类，电流箝位记录的量化。镁的峰值频率增加2+-自由生理溶液显著（0-Mg为2.77±0.57 Hz vs 0.032±0.03 Hz2+和控制（ctrl）；第页< 0.01). 当生理溶液中存在MDL-28170（MDL）时，频率也会增加（2.2±0.43 Hz；与0-Mg相比没有显著差异2+和第页与对照组相比<0.01）。C类——E类，无鞘诱导I的样本记录GABA公司在胞体和顶端树突50μm处。I–V型曲线基于IGABA公司在不同的保持电位下(V（V）小时)在控制条件下(C类)，单位：Mg2+-游离生理溶液(D类)、和（单位：Mg）2+-MDL-28170存在下的游离生理溶液(E类).F类，Δ的散点图E类GABA公司随着时间的推移，保存在镁中的神经元2+-含或不含MDL-28170的自由生理溶液。为了进行比较，图2中包含了表示控制单元线性拟合的线。G公司，Δ的量化E类GABA公司显示Cl中MDL-28170敏感性降低负极镁孵育切片中神经元的挤压2+-游离生理溶液（0-Mg2+：−2.33±1.62 mV/50μm；MDL-28170:5.44±0.40 mV/50μm；第页< 0.001). 图2中所示的合并对照数据用于比较。统计学显著性通过单因素方差分析和谢夫氏分析进行评估临时的测试。的值n个如条形图所示。误差条表示SEM。
图6。
图6。
间质样活性导致KCC2总蛋白水平和表面表达的钙蛋白酶依赖性降低。省略镁可诱导类干预活性2+来自细胞外溶液。切片保存在Mg中2+-释放生理溶液，直到将其用于实验。A类，B类用从成对对照切片（ctrl）和在Mg中孵育的切片中分离的CA1区蛋白样品在免疫印迹中定量和归一化KCC2免疫反应2+-游离生理溶液（0-Mg2+). 0-Mg中KCC2蛋白水平2+组与对照组相比显著降低（76.7±6.0%；第页= 0.038). NMDAR拮抗剂AP5（114.4±9.4%的对照；第页与0-Mg相比=0.0012+)以及钙蛋白酶抑制剂MDL-28170（MDL）（对照组的106.0±5.2%）；第页与0-Mg相比=0.0102+)，阻止了0-Mg2+-诱导KCC2下调。微管蛋白信号证实装载了类似数量的蛋白质。C类，D类，用鳕鱼胰蛋白酶对海马脑片进行蛋白酶处理后，从0-Mg分离的CA1区样本中显示出较低的表面KCC2水平2+片。D类，KCC2的表面/细胞内（裂解/未裂解）比率归一化为对照组的相应值。KCC2表面/细胞内比率较低（75.7±8.0%；第页=0.021），0-Mg2+片。当存在钙蛋白酶抑制剂MDL-28170时，KCC2的表面表达没有显著变化（对照组的112.2±11.1%；第页=0.0037（与0-Mg相比）2+). 通过Kruskal–Wallis单因素方差分析（ANOVA）和Mann–Whitney的排名评估统计显著性临时的测试。的值n个如条形图所示。误差条表示SEM。
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