Cloning and characterization of osteoclast precursors from the RAW264.7 cell line

doi:10.1290/0510075.1

.2006年7月至8月；42(7):182-8.

doi:10.1290/0510075.1。

RAW264.7细胞系破骨细胞前体的克隆和鉴定

Bethany L V库塔拉¹, 塔妮娅·克罗蒂, 安东尼·奥多诺休, 凯文·麦克休

附属公司

PMID： 16948499
预防性维修识别码：项目经理2883882
内政部： 10.1290/0510075.1

RAW264.7细胞系破骨细胞前体的克隆和鉴定

Bethany L V Cuetara公司等。体外细胞开发生物动画. 2006年7月至8月.

.2006年7月至8月；42(7):182-8.

doi:10.1290/0510075.1。

作者

Bethany L V Cuetara公司¹, 塔妮娅·克罗蒂, 安东尼·奥多诺休, 凯文·麦克休

附属

¹哈佛医学院儿童医院矫形外科，美国马萨诸塞州波士顿02115。

PMID： 16948499
预防性维修识别码：项目经理2883882
内政部： 10.1290/0510075.1

摘要

破骨细胞是一种骨吸收细胞，在NF-kappaB配体受体激活剂（RANKL）的作用下，与巨噬细胞前体分化。破骨细胞分化的体外模型主要基于原代细胞培养，由于原代巨噬细胞的使用受到限制，这不适合分子和转基因研究。RAW264.7是一种可转染的巨噬细胞细胞系，具有形成破骨细胞样细胞的能力。在本研究中，我们在RAW264.7细胞克隆中鉴定了破骨细胞前体。通过限制稀释法克隆RAW264.7细胞，并通过重组RANKL处理诱导破骨细胞分化。单个RAW264.7细胞克隆经RANKL处理后，不同程度地形成了抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的多核细胞。所有受试克隆均表达RANKL受体RANK。每一克隆均表达破骨细胞标记基因TRAP和组织蛋白酶K mRNA。然而，我们注意到只有选择的克隆才能形成大的、分布良好的TRAP阳性多核细胞。能够形成大的TRAP阳性多核细胞的克隆也表达β3整合素和降钙素受体mRNAs，并且能够重新吸收矿化基质。所有克隆都通过RANKL治疗检测活化的NF-kappaB。破骨细胞前体RAW264.7细胞克隆的cDNA表达谱表明，破骨细胞分化前后有大量基因表达。这些破骨细胞前体RAW264.7细胞克隆为剖析破骨细胞分化和活化的细胞和分子调控提供了一个有价值的模型。

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数字

图1
**RAW264.7细胞克隆中的破骨细胞形成。**RAW264.7细胞克隆在6孔培养皿中以1X10的速度培养⁵细胞/孔，用RANKL（20ng/ml）或不加RANKL（对照）培养5天。细胞固定并染色以检测TRAP活性。显示了具有代表性的形态范围的克隆（原始放大倍数40X）。

图2
**RAW264.7克隆破骨细胞标记基因表达。**从12个克隆中纯化总RNA，用（+）或不用（-）20ng/ml RANKL生长，如图1所示。总RNA作为RT-PCR反应的模板，使用破骨细胞基因标记、TRAP、CTR、Cath-K、β3的引物。对照组包括使用来自原代骨髓巨噬细胞（Mφ）的RNA和通过RANKL治疗（Oc）从其衍生的破骨细胞进行RT-PCR。

图3
**RAW264.7细胞克隆对羟基磷灰石的吸收。**RAW264.7细胞克隆C1-C12（编号1-12）生长在含有20 ng/ml RANKL或不含RANKL（未显示）的骨科载玻片（合成磷酸钙薄膜）上。去除细胞，用Von Kossa染色法对矿物质进行染色。表型类似破骨细胞的克隆（图1和图2）能够再吸收（原始放大10倍）。

图4
**RAW264.7细胞克隆中通过RANKL激活NF-κB。**无（-）或（+）RANKL处理的克隆C1-C12核提取物的EMSA分析（100ng/ml，15分钟）。用放射性标记的NF-κB寡核苷酸探针在冰上孵育相同体积的处理样品和对照样品的核提取物30分钟。在1X TBE中用5%聚丙烯酰胺电泳分离结合络合物。箭头指示含NF-κB复合物的位置。所有克隆都能激活RANKL依赖的NF-κB。

图5
**原代细胞与RAW267.4细胞克隆中的基因表达。**（A）将密集阵列与RAW264.7克隆和小鼠原代骨髓基质细胞RNA的cDNA探针杂交。扫描放射自显影并测定相关基因表达水平。取3个RAW264.7克隆（C3、C6和C11）的相对表达水平的平均值。绘制了相对表达水平高于100的初级巨噬细胞和RAW细胞基因（约712个基因）。带圆圈的点对应于c-myc。（B）来自原始破骨细胞和RAW264.7细胞衍生破骨细胞的cDNA探针。如上所述对阵列进行杂交和分析。取3个克隆（C3、C6和C11）的相对表达水平的平均值，绘制相对表达水平高于100的原始破骨细胞和RAW264.7破骨细胞基因（约405个基因）。

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