Transcriptional activation triggers deposition and removal of the histone variant H3.3

doi:10.1101/gad.1259805

.2005年4月1日；19(7):804-14.

doi:10.1101/gad.1259805。 Epub 2005年3月17日。

转录激活触发组蛋白变体H3.3的沉积和去除

布莱恩·施瓦茨¹, 卡米·艾哈迈德

附属公司

PMID： 15774717
预防性维修识别码：下午074318
内政部： 10.1101/gad.1259805

转录激活触发组蛋白变体H3.3的沉积和去除

布莱恩·施瓦茨等。基因开发. 2005.

.2005年4月1日；19(7):804-14.

doi:10.1101/gad.1259805。 Epub 2005年3月17日。

作者

布莱恩·施瓦茨¹, 卡米·艾哈迈德

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院生物化学和分子药理学系，邮编：02115。

PMID： 15774717
预防性维修识别码：项目编号：1074318
内政部： 10.1101/gad.1259805

摘要

真核细胞中的DNA被包装成核小体，核小体是染色质的结构单位。DNA和大块组蛋白的寿命都非常长，因为当染色质重复时，旧的DNA链和组蛋白会被保留。相反，我们发现果蝇HSP70基因在诱导过程中迅速失去组蛋白H3并获得变异的H3.3组蛋白。组蛋白替换在人工HSP70启动子阵列中没有发生，表明H3.3沉积需要转录。H3.3组蛋白富含所有活性染色质和整个大转录单位，这意味着沉积发生在转录延长期间。引人注目的是，我们观察到染色质结合的H3.3的稳定性在不同的基因座之间存在差异：H3.3在持续活跃的rDNA基因处翻转，但在已关闭的诱导HSP70基因处变得稳定。我们得出结论，H3.3沉积与转录耦合，并在基因激活时继续。重复的组蛋白替换提示了一种既能维持染色质结构又能获得活性基因DNA的机制。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
活性染色质中H3.3的RI沉积。含有组成性表达H3-GFP的幼虫唾液多烯染色体(*A、 B类*)，H3.3-GFP(*C、 D类*)，或H3.3^核心-GFP公司(*E、 F类*)融合基因。(*A、 C、E*)整体展开合并图像；箭头表示异色色心。(*B、 D、F*)用组蛋白-GFP拆分和合并染色体尖端的高倍视图；箭头表示压缩的DAPI带，箭头表示带间。(*A、 B类*)H3-GFP定位于DAPI染色带和色心。(*C、 D类*)H3.3-GFP主要局限于银行同业，但偶尔也会标记银行同业。H3.3-GFP也会对色心进行染色。(*E、 F类*)H3.3小时^核心-GFP对带间蛋白具有特异性，对色心几乎没有可检测的染色。DAPI染色的DNA为红色，组蛋白-GFP为绿色。

**图2。**
基因诱导触发组蛋白替换。热休克诱导引发快速喘息和转录*热休克蛋白70*多烯带87A和87C的基因。含有组成性表达的H3-GFP结构的幼虫的多烯染色体(A类–*D、 J、K*)或组成性表达的H3.3^核心-GFP构造(E类–我)诱导指定时间（分钟），并用磷酸化RNA聚合酶II（蓝色）抗体染色，标记激活的烟团。箭头在A类和E类指示*热休克蛋白70*诱导前87A和87C位点，而(B类–*D、 F类*–*H（H）*)括号中。星号表示染色体带，用作定量烟团中组蛋白-GFP信号总强度的内部标准。(*B、 C类*)在诱导的前5分钟，泡芙中含有一些H3，但当泡芙达到最大尺寸时，H3含量要少得多(D类). (F类–*H（H）*)H3.3段^核心-膨胀泡芙中的GFP迅速增加。(我)热冲击诱导20分钟后，许多*热休克蛋白*烟（箭）含有大量H3.3^核心-GFP，而整个手臂的染色没有减少。(*J、 K（K）*)组蛋白H3修饰标记热休克泡芙，与H3-GFP不重叠。DNA呈红色，组蛋白GFP呈绿色。

**图3。**
蜕皮激素诱导的基因被广泛标记为H3.3。(*A、 B类*)组成性表达H3.3的幼虫蜕皮激素应答大基因E74和E75的染色体分裂^核心-之前的GFP(A类)以及之后(B类)诱导。(*C、 D类*)在从组成型表达H3-GFP的幼虫诱导之前和之后的相同染色体区域。这两个区域都显示有适量的H3.3^核心-诱导前GFP和H3-GFP，但H3.3^核心在转录期间H3耗尽时增加。线显示了侧翼E74和E75基因的标志性DAPI带的位置。DNA为红色，组蛋白-GFP为绿色，RNA聚合酶II为蓝色。(*E、 F类*)DNA探针（蓝色）到3′端的荧光原位杂交(E类)和5′端(F类)诱导的E75基因。括号表示基因。H3.3段^核心-GFP（绿色）在基因的干预体中富集。

**图4。**
组蛋白替换使用新生产的H3.3。将含有热休克诱导组蛋白-GFP构建物的晚三龄幼虫热休克1h，诱导构建物和内源性HSP基因，然后恢复4h(A类–C类)DNA（红色）和组蛋白-GFP（绿色）图像在左边，组蛋白-GFP信号单独显示在*正确的*. (A类)全长H3.3-GFP特地沉积在热冲击位点（箭头表示87A、87C、95D、63E和67F位点）。(B类)H3-GFP未并入染色质。诱导后，H3-GFP填充未固定唾液腺细胞核内的染色质间隙，但仍呈弥漫状态(插入). (C类)使用H3.3-GFP和两个*热休克蛋白70*启动子转基因阵列在HSP位点上显示出强烈的H3-GFP信号，但在阵列上几乎没有信号。箭头在A类和C类指示不带阵列的43E区域(A类)和一个数组(C类). (插图)显示了43E的放大图像。(D类)携带P[H3.3-GFP]B6和*热休克蛋白70*在20分钟的热休克诱导过程中，在位置30A和43E处的启动子转基因阵列。内源性*热休克蛋白70*位点（箭头）结合适量的HSF激活物（绿色），而数组（箭头）则结合大量。相反，*热休克蛋白70*基因座有大量参与的RNA聚合酶II（蓝色），而阵列几乎没有。

**图5。**
染色质结合的H3.3在有丝分裂后细胞中不稳定。(A类–C类)携带热休克诱导H2B-GFP的成虫(A类)，H3-GFP(B类)，或H3.3-GFP(C类)构建物在无热休克的情况下或诱导后的指定时间（以小时为单位）冷冻。用400 mM NaCl提取样品并离心分离可溶性组蛋白和颗粒染色质结合组蛋白。用SDS-PAGE分离10%的上清液和20%的颗粒组分，用抗GFP抗体检测GFP标记的组蛋白。使用抗-H2A抗体作为每个时间点（诱导后小时）核小体总含量的内部对照。每个组蛋白-GFP蛋白的染色质结合（黑条）和可溶性形式（空条）以GFP信号与H2A信号的比率（任意单位）绘制。(A类)H2B-GFP脉冲迅速进入染色质，几乎所有可溶的H2B-GFP在生产后8小时内用完。H2B-GFP的大部分在染色质中是稳定的。(B类)产生可溶性H3-GFP，但未检测到染色质掺入。(C类)H3.3-GFP的脉冲并入染色质，并在产生后8小时达到最大值。可溶性H3.3-GFP在16小时内消失，大部分染色质结合标记蛋白在48小时内消失。

**图6。**
H3.3迅速从高活性染色质中被取代。(A类–D类)转染HS-H3.3-GFP构建物的Kc细胞经热休克诱导构建物。采集样品2小时(A类)，8小时(B类)，14小时(C类)、和20小时(D类)然后用Triton X-100轻轻提取，以在固定前去除可溶性蛋白质。核仁的位置通过核仁蛋白纤维蛋白（红色）的抗体检测来标记。箭头表示H3.3-GFP核仁病灶的位置。线条轮廓显示通过细胞核的GFP信号（任意单位）的像素强度。核仁内H3.3-GFP斑点强度与常染色质最亮部位的比值被用作活性rDNA基因沉积组蛋白量的单细胞测量。(A类)诱导两小时后，许多细胞有强烈标记的rDNA病灶。(B类–D类)H3.3-GFP信号在核仁中随时间变暗，到20小时核仁病灶罕见。全色信号在产生后8小时达到最大值，然后缓慢减弱。(E类)H3.3-GFP核模式和强度随时间变化的定量。每个样本中计数了25个GFP阳性细胞。随着时间的推移，带有核仁焦点的核的频率和这些焦点的强度都会下降。焦点强度的降低具有统计学意义(*P（P）*<0.001，平均值比率的比较）。(F类)Kc细胞中H3.3-RFP（红色）的组成性表达在核仁病灶和常染色质中的强度相似。在相同的细胞中，2小时前的H3.3-GFP（绿色）脉冲强烈标记相同的核仁病灶。(*G公司*)20小时后，核仁H3.3-GFP信号比组成型H3.3-RFP信号更暗。

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