美国国家科学院院刊。1998年4月14日；95(8): 4386–4391.
密件抄送-XL（左）与Apaf-1相互作用并抑制Apaf-1依赖性胱天蛋白酶9的激活
密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院东医学中心路1500号病理与综合癌症中心系，邮编：48109
由马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院H.Robert Horvitz编辑，1998年2月17日批准
摘要
最近的研究表明秀丽隐杆线虫CED-4与死亡蛋白酶CED-3相互作用并促进其活化，CED-9可抑制其活化。在这里，我们表明，CED-4的哺乳动物同源物Apaf-1可以与几种死亡蛋白酶相关，包括哺乳动物细胞中的caspase-4、caspase-8、caspase9和线虫CED-3。与caspase-9的相互作用由Apaf-1的N末端CED-4样结构域介导。Apaf-1的表达增强了需要Apaf-1 CED-4样结构域的caspase-9的杀伤活性。此外，Apaf-1促进caspase-9的加工和激活体内.Bcl-X型L（左）是Bcl-2家族的抗凋亡成员，在哺乳动物细胞中与Apaf-1和caspase-9发生物理相互作用。Apaf-1与Bcl-X的相关性L（左）通过其CED-4样结构域和包含WD-40重复序列的C末端结构域介导。Bcl-X的表达L（左）抑制哺乳动物细胞中Apaf-1与caspase-9的结合。值得注意的是，重组Bcl-XL（左）纯化自大肠杆菌或昆虫细胞抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9依赖性的Apaf-1处理。此外，Bcl-XL（左）未能抑制组成活性Apaf-1突变体介导的caspase-9处理，表明Bcl-XL（左）通过Apaf-1调节caspase-9。这些实验证明Bcl-XL（左）与caspase-9和Apaf-1相关，并显示Bcl-XL（左）抑制由Apaf-1介导的caspase-9的成熟，这是一个从线虫进化到人类的保守过程。
关键词：凋亡，细胞死亡
程序性细胞死亡或凋亡是一种形态上不同的细胞死亡形式，对多细胞生物的发育和组织稳态至关重要(1,2). 凋亡机制在进化上是由遗传程序保守和控制的(1–三). 线虫的遗传学研究秀丽隐杆线虫已经确定了三个在程序性细胞死亡的诱导和执行中起关键作用的基因(三). 两个线虫基因，第三阶段和塞得-4执行细胞死亡程序所需的。这个塞得-3产品与哺乳动物白细胞介素1β转化酶同源(4). 这个塞得-9基因功能上游塞得-3和塞得-4并保护在蠕虫发育过程中正常存活的细胞(5,6). 对CED-3、CED-4和CED-9的生化分析揭示了线虫细胞程序性死亡的调控机制。CED-4与CED-3和CED-9相互作用形成多聚体蛋白复合物(7–9). 此外，CED-4促进了死亡蛋白酶CED-3的激活，而这种激活被CED-9抑制(10–12).
发现的几个凋亡调节基因秀丽线虫有哺乳动物的同类。一个与秀丽线虫CED-3似乎代表了凋亡程序的效应臂(13). 每个半胱天冬酶都含有对天冬氨酸残基后特定蛋白水解活性裂解很重要的保守残基(13). 一些半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，包括半胱氨酸蛋白酶-4、-8和-9，在结构上与CED-3相似，因为它们含有长前体蛋白，似乎在半胱氨酸水解酶级联反应中起上游作用(13,14). 通过多种刺激激活下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶导致靶蛋白断裂和执行凋亡程序(13). Bcl-2和Bcl-XL（左），Bcl-2家族的两个成员，作为凋亡抑制剂，被认为是线虫CED-9的同源物(15). 一些研究表明，这些凋亡抑制剂调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活(16,17). 然而，Bcl-2和Bcl-X的精确机制L（左）控制caspase激活和凋亡仍存在争议。
最近的研究已经鉴定并部分表征了Apaf-1，一种哺乳动物的同源物秀丽线虫CED-4号机组(18). Apaf-1的N末端区域与CED-4、CED-3的前体蛋白以及一些具有长前体蛋白的CED-3样蛋白酶具有氨基酸同源性。Apaf-1和CED-3样蛋白酶前体之间共享的同源区域被称为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶募集域(19). Apaf-1的C末端区域与CED-4缺乏同源性，由12个WD重复序列组成(18). 存在dATP和细胞色素c（c）Apaf-1是一种在细胞凋亡过程中从线粒体释放的分子，它与caspase-9结合并诱导下游死亡蛋白酶caspase-3的激活(20).
在目前的研究中，我们试图评估抗凋亡Bcl-X的相互作用L（左）带有Apaf-1和CED-3样半胱天冬酶的蛋白质，以确定死亡机制的调节在线虫和哺乳动物中是否进化上保守。分析表明，Apaf-1与几种含有长前结构域的胱天蛋白酶相互作用，包括胱天蛋白酶-4、-8、-9和CED-3。此外，Bcl-XL（左）与Apaf-1和caspase-9物理结合，并抑制Apaf-1介导的caspase-8成熟。
材料和方法
质粒构建。
含有Apaf-1 cDNA的表达质粒(18)来自X.Wang（达拉斯德克萨斯大学西南医学中心）。以Apaf-1 cDNA为模板，通过PCR扩增Apaf-1、突变体N-Apaf-1和C-Apaf-1，并克隆到表达载体pcDNA3-Myc中，产生C末端标记的Apaf-1蛋白。人caspase-3、caspase-4、野生型和突变型（C287S）caspase-9 cDNA被克隆到巴姆HI和Xho公司pcDNA3-血凝素（HA）或-标记载体的I位点产生C末端标记蛋白。质粒pcDNA-3-Flag-Bcl-XL（左）先前描述了pcDNA3-β-半乳糖苷酶、pcDNA3-Ced-3-HA（C360S）、pcDNA-casase-8-HA和pcDNA3-casase-8-AU1突变株（C377S）(10,21,22). pcDNA-p35质粒是来自V.Dixit（Genentech，South San Francisco，CA）的礼物。
转染、免疫沉淀和Western Blot分析。
人胚胎肾293T细胞（2-5×106)用磷酸钙法分别转染5μg所示质粒DNA。用相关抗体进行蛋白质免疫沉淀和Western blot分析，如下所述(7). 兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9抗体是X.Wang赠送的，抗聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抗体购自Enzyme Systems Products（加利福尼亚州利弗莫尔）。使用增强化学发光系统（Amersham）检测蛋白质。
细胞凋亡检测。
293T电池（1×105)在12孔板的每个孔中播种。12小时后，用0.25μg报告pcDNA3-β-半乳糖苷酶质粒和以下质粒的各种组合瞬时转染细胞：0.1μg caspase-9、0.4μg Apaf-1-Myc（WT）、N-Apaf-1（N）、C-Apaf-1。pcDNA3用于将总质粒DNA调整到相等数量。如前所述，在转染三份培养基18小时后测定凋亡细胞的百分比(10).
重组Bcl-X的制备L（左）蛋白质。
人类Bcl-XL（左）从pSFFV-Bcl-X中切除cDNAL（左）(21)并克隆到pET30a（+）质粒（Novagen）中。Bcl-X公司L（左）从大肠杆菌表达（His）的BL21（DE3）6-Bcl-X公司L（左）作者：Ni2+-树脂柱色谱法。Bcl-X的纯度L（左）考马斯蓝染色法测定，制备物至少为95%。重组Glu-Glu标记的Bcl-XL（左）由pAcoG-human-Bcl-X产生L（左）在杆状病毒感染的Sf9细胞中构建（M.J.Fernandez Sarabia的礼物，Onyx Pharmaceuticals，Richmond，CA）并通过亲和层析纯化(23). （他的）6-标记的重组Bad蛋白由大肠杆菌携带pET30a（+）的BL21（DE3）-描述的坏质粒(24).
体外试验半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9分析。
从293T细胞中提取的S-100提取物基本上按照刘的描述制备等。(25)并在−80°C下冻结。Caspase-9被翻译在体外来自pcDNA-3-caspase-9质粒[35S] 蛋氨酸（Amersham），使用Promega TNT转录/翻译试剂盒。将50或20微克S-100细胞提取物与dATP（1mM）或牛细胞色素一起或不与dATP（1mM）或牛细胞色素一起孵育c（c）（0.4μg，Sigma）在1μl存在下在体外翻译后的caspase-9最终体积为25μl。将混合物在37°C下孵育30 min，并通过添加5×SDS加载缓冲液停止，煮沸5 min。为了测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9激活对Apaf-1的依赖性，向S-100提取物中添加0.5μl正常兔血清或兔抗Apaf-1血清（X.Wang的礼物）。重组Bcl-XL（左）或Bad在添加dATP和细胞色素之前与S-100提取物预孵育30分钟c（c）.
结果
Apaf-1与含有长前域的多个半胱氨酸蛋白酶相互作用，但不与半胱氨酸酶-3相互作用。
为了确定Apaf-1是否与半胱天冬酶相互作用，我们进行了体内使用分别包含Apaf-1的CED-4样区和C末端区的全长Apaf-1或两个Apaf-1、N-Apaf-1（残基1-559）和C-Apaf-1缺失突变体（残基468-1194）进行相互作用分析（图。A类). 我们用产生caspase-3，-4，-9，秀丽线虫CED-3，或控制空载体和Myc-tagged Apaf-1。用抗Myc抗体免疫沉淀蛋白复合物的Western blot分析表明，caspase-4、-9和CED-3与Apaf-1共免疫沉淀，而caspase-3没有共免疫沉淀（图。 B–D类). Apaf-1与caspase-9的相互作用证实了一项最近发表的研究，而这份手稿正在准备中(20). 对Apaf-1突变体的分析表明，Apaf-1通过其N末端CED-4样结构域与caspase-9相互作用（图。C类). 然而，Apaf-1的CED-4样和C末端区域都与秀丽线虫CED-3蛋白酶（图。D类).
Apaf-1与哺乳动物细胞中具有长前体蛋白的几种半胱氨酸蛋白酶相互作用。(A类)本研究中使用的Apaf-1结构示意图。(B–D类)Apaf-1与caspase-4、caspase-9和CED-3的相互作用。293T细胞与标记的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和对照载体或标记的Apaf-1、N末端或C末端Apaf-1结构体（分别为Apaf-1-Myc、N-Apaf-1-Mic和C-Apaf-1-Myc）共转染。(上部)免疫沉淀蛋白复合物与指示抗体的Western blot分析。(下部)caspase-3和-4的表达(B类)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(C类)，以及CED-3和Apaf-1蛋白(D类). 第3车道的前半胱氨酸-9水平降低C类是由于N-Apaf-1介导的蛋白酶-9的高效处理。IP：免疫沉淀，WB：蛋白质印迹分析。星号表示非特定带。
Apaf-1与Caspase-8的死亡效应域相互作用。
由于caspase-8含有一个长的前体结构域，其中两个死亡效应域在结构上与CED-3的前体有关(19)接下来，我们确定Apaf-1是否也与caspase-8相互作用。免疫沉淀与抗Myc抗体复合物的Western blot分析表明，caspase-8与Apaf-1在293T细胞中共免疫沉淀（图。A类). 对Apaf-1突变体的分析表明，半胱天冬酶-8与Apaf-1的CED-4样和C末端区域都相关（图。A类). 为了进一步分析Apaf-1-caspase-8的相互作用，我们设计了两个缺失突变体来表达caspase-8的N末端前体（残基1–215）或C末端催化结构域（残基216–479）。免疫沉淀分析表明，Apaf-1与含有死亡效应域的前体蛋白相互作用，但与caspase-8的催化域没有相互作用（图。B类).
Apaf-1与caspase-8的前体相互作用。(A类)Apaf-1与caspase-8的相互作用。(B类)Apaf-1与caspase-8的前体相互作用。免疫沉淀分析如图所示。. (上部)免疫沉淀蛋白复合物与指示抗体的Western blot分析。(A类和B类,下部)显示caspase-8的表达(A类)或Apaf-1(B类)Western blot分析的总裂解物。IP：免疫沉淀，WB：蛋白质印迹分析。星号表示非特定带。
Apaf-1促进哺乳动物细胞中Caspase-9和Caspase-9-介导的凋亡的激活。
Apaf-1与caspase-9的相互作用促使进一步的实验评估Apaf-1是否可以调节caspase-8的激活。在这些实验中，293T细胞瞬时转染产生Myc-tagged全长或截短突变Apaf-1和caspase-9的构建物。野生型Apaf-1或N末端突变体（CED-4样）的表达而非Apaf-1的C末端突变体的表达增强了caspase-9的杀伤活性（图。A类). Apaf-1和caspase-9诱导的细胞凋亡被caspases抑制剂杆状病毒p35抑制（图。A类). 未标记的Apaf-1也增强了caspase-9的杀伤活性，排除了因Myc标记而产生的任何伪影（图。A类). 我们进行了进一步的分析，以确定caspase-9的蛋白水解过程是否是激活caspase所需的步骤(13)，受Apaf-1调节体内Apaf-1的表达增强了caspase-9（p35）主要裂解产物的形成，该产物是在其蛋白水解激活过程中形成的（图。B类). 为了评估半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的激活，用抗PARP抗体对相同的细胞裂解物进行免疫印迹，PARP是一种在半胱氨酸蛋白酶-9激活后裂解的蛋白质(20,25). Western blot分析显示，Apaf-1促进caspase-9激活，这是通过检测p85（PARP的蛋白水解片段，由caspases裂解产生）而确定的（图。B类).
全长和N末端Apaf-1对caspase-9的调节。(A类)Apaf-1增强caspase-9诱导的细胞凋亡。293T细胞用报告基因pcDNA3-β-半乳糖苷酶和所示质粒瞬时转染。WT，全长Apaf-1-Myc；N、 N-末端Apaf-1-Myc；C、 C-末端Apaf-1-Myc；UT，无标签全长Apaf-1。结果表示显示凋亡形态学特征的蓝色细胞百分比，并以三倍培养物的平均+/-SD表示。(B类)Apaf-1促进caspase-9活化体内用抗caspase-9免疫印迹转染所示质粒的细胞裂解液(上部)或抗PARP抗体(下部). 箭头表示全长和处理过的caspase-9和PARP片段。星号表示非特定带。
Bcl-X公司L（左）与哺乳动物细胞中的胱天蛋白酶-9和Apaf-1相关。
接下来我们检查了Bcl-X是否L（左）能与caspase-9结合。分析表明Bcl-XL（左）和caspase-9共免疫沉淀体内（图。A类). 作为线虫CED-9蛋白，哺乳动物Bcl-X的同源物L（左），通过CED-4与CED-3互动(8,10)，我们确定Bcl-XL（左）可能与Apaf-1相关。Bcl-X的Western blot分析L（左）抗Myc抗体复合物显示Apaf-1与Bcl-X共免疫沉淀L（左）（图。B类). 为了验证这些结果，我们进行了交互实验，用抗Myc抗体免疫沉淀野生型Apaf-1和Apaf-1缺失突变体。Western blot抗Flag分析证实Apaf-1与Bcl-X共免疫沉淀L（左）并透露Bcl-XL（左）与CED-4样结构域和包含Apaf-1 WD重复序列的C末端区域相关（图。C类).
Bcl-X公司L（左）与caspase-9和Apaf-1相互作用。(A类)Bcl-X公司L（左）与caspase-9相互作用。(上部)免疫沉淀Bcl-X的Western blot分析L（左）共免疫沉淀原-9和处理型（p35）。(下部)caspase-9在总裂解物中的表达。(B类和C类)Bcl-X公司L（左）与Apaf-1相互作用。用指示的质粒转染293T细胞，用抗Flag免疫沉淀的裂解物(B类)或抗Myc(C类)抗体。WT，全长Apaf-1-Myc；N、 N-末端Apaf-1-Myc；C、 C端Apaf-1-Myc。面板显示共免疫沉淀Apaf-1和Bcl-X的Western blot分析L（左）蛋白质。星号表示非特定带。
Bcl-X公司L（左）抑制Apaf-1与Caspase-9的结合。
因为Bcl-XL（左）与哺乳动物细胞中的Apaf-1和caspase-9相关，我们测试了Bcl-X是否L（左）可能影响Apaf-1-caspase-9相互作用。在Bcl-X存在或不存在的情况下，用产生Apaf-1和胱天蛋白酶9（C287S）的质粒共转染293T细胞L（左）用抗HA抗体免疫沉淀caspase-9复合物。Western blot分析显示Bcl-XL（左）抑制Apaf-1与caspase-9的结合（图。). 对相同免疫复合物和裂解物的Western blot分析显示caspase-9和Apaf-1的水平相当（图。)表明结果并非由于这些蛋白的差异表达所致。
Bcl-X公司L（左）抑制Apaf-1与caspase-9的结合。用指示质粒转染293T细胞，用抗HA抗体免疫沉淀裂解物。(上部)免疫沉淀caspase-9和共免疫沉淀Apaf-1的Western blot分析。(下部)用抗Myc和抗Flag抗体对总裂解产物进行Western blot分析。
净化Bcl-XL（左）抑制Apaf-1介导的Caspase-9成熟。
确定Bcl-X是否L（左）为了调节caspase-9的活性，我们利用外源性添加dATP和细胞色素的无细胞系统进行了生化实验c（c）诱导caspase-9的活化(20). 细胞提取物中caspase-9转化为p37、p35和p10-12形式的过程依赖于dATP和细胞色素c（c）如报告所示(20). 然而，我们观察到部分细胞色素c（c）我们系统中的依赖性可能是由于细胞色素泄漏c（c）在提取物制备过程中（图。A类). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的激活被兔抗Apaf-1抑制，但未被对照血清抑制，这证实了细胞溶质提取物对半胱氨酸蛋白酶-9激活依赖于Apaf-1（图。A类). 与半胱天冬酶-9相比，我们没有观察到使用此方法可以增强半胱氨酸蛋白酶-4或半胱蛋白酶-8的处理在体外系统（未显示数据）。值得注意的是，Apaf-1的N末端突变（残基1-559）独立于dATP和细胞色素促进了caspase-9的激活c（c）（图。B类).
纯化Bcl-XL（左）抑制Apaf-1依赖的caspase-9成熟在体外. (A类)Apaf-1对caspase-9的依赖性加工在体外在最后两条通道中，在反应前30分钟加入正常兔血清（对照）或抗Apaf-1血清。(B类)N-末端Apaf-1突变体（残基1-559）独立于细胞色素激活caspase-9c（c）和dATP。分析中使用了转染pcDNA3（对照提取物）或pcDNA3-N-Apaf-1（N-Apaf-1提取物）的293T细胞提取物。(C类)重组Bcl-X对caspase-9成熟的调控L（左）.细胞提取物与指定量的重组Bcl-X孵育L（左）或者Bad然后是细胞色素c（c）将dATP添加到反应中。(赖特)将表达N-末端Apaf-1突变体（残基1-559）的细胞提取物与指定量的重组Bcl-X孵育L（左）.原型和处理过的半胱天冬酶-9用箭头表示。
我们纯化了Bcl-XL（左）从大肠杆菌测试Bcl-X的能力L（左）调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的Apaf-1依赖性激活。重组Bcl-XL（左）纯化自大肠杆菌以剂量依赖的方式抑制caspase-9的成熟（图。C类). 在对照实验中，重组Bad从大肠杆菌没有抑制caspase-9的处理（图。C类). 此外，重组Bcl-XL（左）从SF9昆虫细胞中纯化的半胱天冬酶-9也抑制了在这个无细胞系统中的成熟（数据未显示）。因为Bcl-XL（左）结合caspase-9和Apaf-1，我们使用组成活性的Apaf-1突变体（残基1-559）来评估caspase-8活化直接受其与Bcl-X相互作用调节的可能性L（左）.图。C类显示Bcl-XL（左）不能抑制N-Apaf-1突变体介导的caspase-9激活。这些结果表明Bcl-XL（左）需要野生型Apaf-1来抑制caspase-9的激活。因此，Bcl-X不太可能L（左）仅通过与caspase-9的直接相互作用抑制caspase-8。
讨论
在目前的研究中，我们发现Apaf-1是一种哺乳动物的同源物秀丽线虫CED-4与哺乳动物细胞中的几种半胱氨酸蛋白酶，包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4、-8、-9和线虫CED-3蛋白酶相互作用。这些结果表明，Apaf-1与半胱氨酸蛋白酶的关联并不局限于半胱氨酸酶-9(20). 所有这些相互作用的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶都包含长前体蛋白，并被认为在半胱氨酸蛋白酶级联中起上游作用(14). 胱天蛋白酶-9和CED-3的前结构域包含胱天蛋白酶募集结构域，该结构域在包括Apaf-1，R（右）知识产权-一有关联的我CHi/CED-3同源蛋白d日以斯d日域（RAIDD）和蜂窝我抑制剂应用程序视力下降（IAP）(19,20,26). Caspase-8是一种近端Caspase，通过死亡受体途径的肿瘤坏死因子家族介导凋亡(27,28). 半胱天冬酶-8在其前体域中包含两个死亡效应域(27,28). 我们在这里展示了caspase-8通过其包含死亡效应域的前体区域与Apaf-1相互作用。相反，caspase-3是一种在caspase-9下游起作用的死亡蛋白酶，缺乏长前体蛋白(20)，未能与Apaf-1进行交互。这些结果表明，除了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9外，Apaf-1还可以与其他几种上游半胱氨酸蛋白酶相互作用。然而，Apaf-1与caspase-4或caspase-8之间相互作用的相关性尚不清楚。与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9相比，Apaf-1并没有促进我们体内其他半胱氨酸蛋白酶的加工在体外系统。Apaf-1可能仍在caspase-4和/或caspase-8的激活中发挥作用，但调控可能需要与caspase-9不同的因素。
以前的研究表明Bcl-XL（左）能与哺乳动物细胞中的caspase-1和caspase-8结合(8). 这里我们展示了Bcl-XL（左）与caspase-9相关。我们进一步证明Apaf-1与Bcl-X相互作用L（左）此结果与之前的观察结果一致秀丽线虫CED-9和CED-4调节器，其中CED-4与CED-9以及人类Bcl-X相关L（左）(7,10). 然而，尚不清楚Bcl-X的相互作用L（左）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9直接或通过内源性Apaf-1或另一种CED-4同源物，因为半胱氨酸蛋白酶-9和Apaf-1可以在哺乳动物细胞中形成二聚体复合物（图。). 由于Apaf-1在293T细胞中表达（Y.H.和G.N.，未发表的观察结果），可以想象Apaf-1或其他Apaf-1样分子可以介导caspase-9与Bcl-X的相互作用L（左）.
已经提出了几个模型来解释Bcl-2家族成员的凋亡抑制作用。据推测，这些蛋白质通过阻止细胞色素的释放发挥抗凋亡功能c（c）从线粒体到细胞质(29,30). 为了支持该模型，Bcl-XL（左）和Bcl-2，存在于外线粒体和其他细胞膜中，据报道可以阻止细胞色素的释放c（c），一种与Apaf-1结合并参与caspase-9激活的分子(29–33). 这种机制可能由Bcl-X的能力介导L（左）通过形成离子通道或其他机制维持线粒体膜的完整性(33). 然而，一些观察结果与抗凋亡Bcl-2家族成员主要调节细胞色素的假设不一致c（c）释放。首先，在某些系统中，细胞色素c（c）释放到胞质溶胶中不是由已知被Bcl-X抑制的凋亡刺激诱导的L（左）(34). 第二，Bcl-XL（左）抑制对微量注射细胞色素诱导的凋亡有抵抗力的细胞的凋亡c（c）表明Bcl-X的能力L（左）抑制细胞死亡不能仅仅因为抑制细胞色素c（c）线粒体释放(35). 最后，靶向内质网的突变型Bcl-2和腺病毒Bcl-2相关的E1B-19K蛋白（主要排除在线粒体之外）都可以抑制细胞凋亡(36,37)表明抗凋亡Bcl-2家族成员即使不存在于线粒体中也具有活性。
我们的结果表明，Bcl-X是另一个模型L（左）能抑制凋亡细胞的死亡。该机制涉及Bcl-X的结合L（左）Apaf-1和胱天蛋白酶-9以及可能的其他死亡蛋白酶如胱天蛋白酶-4和胱天蛋白酶-8。重组Bcl-XL（左）纯化自大肠杆菌或者昆虫细胞可以抑制依赖Apaf-1的caspase-9的激活。这些结果表明，与其线虫同源物CED-9一样，Bcl-XL（左）可以通过Apaf-1控制caspase-9的激活来调节细胞凋亡。因为重组Bcl-XL（左）抑制Apaf-1介导的caspase-9成熟，这些结果表明Bcl-XL（左）可以独立于与细胞膜的结合调节caspase-9的激活。在完整细胞中，Bcl-X的能力L（左）抑制caspase-9激活可以通过插入细胞膜来增强或进一步调节。我们观察到Bcl-XL（左）抑制Apaf-1与caspase-9的相互作用表明Bcl-X的作用机制L（左）能抑制caspase-9的激活。这可能是Bcl-X之间直接竞争的结果L（左）和caspase-9用于Apaf-1和/或Bcl-X对Apaf-1的细胞内隔离L（左）这些结果并不排除Bcl-X的其他机制L（左）如改变Apaf-1与细胞色素的相互作用c（c）和/或Bcl-X对Apaf-1/caspase-9复合物构象变化的抑制L（左）(20). 显然需要进一步的研究来充分了解Apaf-1在半胱氨酸蛋白酶激活中的作用以及Bcl-2家族成员对其的调节。
致谢
作者感谢L.del Peso提供重组Bad蛋白；S.Chen、L.Ding和T.Hlaing寻求技术帮助；以及L.del Peso、D.Ekhterae、M.Gonzalez-Garcia和T.Koseki对手稿进行批判性审查。我们还感谢E.Alnemri博士、C.Distelhorst博士、V.Dixit博士，特别是X.Wang博士慷慨提供试剂。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）CA64556和CA64421以及美国陆军医学研究与材料司令部（U.S.Army Medical Research and Material Command）的资助。Y.H.得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）T32A107413-03博士后免疫病理学培训基金的资助。M.A.B.得到了美国陆军医学研究与材料司令部的博士前奖学金的支持。G.N.获得了美国国立卫生研究院颁发的研究职业发展奖K04 CA64421-01的支持。
脚注
本文直接（轨道II）提交给诉讼办公室。
缩写：HA，血凝素；PARP，聚ADP-核糖聚合酶。
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