淋巴高内皮微静脉中表达的趋化因子促进原始T淋巴细胞的粘附和趋化性

摘要

在免疫监测期间，原始淋巴细胞优先进入次级淋巴器官，在那里采集隔离抗原，然后再返回循环。在淋巴结和派尔氏结中，它们通过特殊的高内皮微静脉（HEV）迁移离开血液(1). 在缺乏HEV的脾脏中，它们从边缘区的血液中流出，并通过一条尚未明确定义的途径进入白髓(2). 离开血液后，原始B淋巴细胞和T淋巴细胞分别迁移到淋巴器官、滤泡和T细胞区域内的不同隔间，在那里它们遇到抗原呈递的树突状细胞。这些受抗原刺激的淋巴细胞被保留并增殖，而大多数则返回循环。通过这种方式，对稀有抗原反应的淋巴细胞克隆被迅速选择，被刺激分化为效应细胞或记忆细胞，并被扩增。与原始淋巴细胞不同，记忆淋巴细胞优先迁移到外周非淋巴样器官。虽然这些细胞从血液中的迁移已经被广泛研究(三,4)关于它们重返循环的机制，人们知之甚少。

淋巴细胞被认为通过一系列步骤进入次级淋巴器官(5). 在该模型中，细胞最初通过选择素介导的相互作用（步骤1）在内皮细胞上系留和滚动，然后经历整合素活性的刺激性增加（步骤2），使其通过整合素与Ig超家族粘附分子的结合牢固地粘附到内皮细胞上（步骤3）。牢固附着的细胞随后跟随趋化剂梯度进入组织（步骤4）。该过程第一步和第三步所需的选择素和整合素已经确定(三,4). 在步骤1中，淋巴细胞上表达的L-选择素与外周节点寻址蛋白相互作用，外周节点地址蛋白是一种包含CD34的糖蛋白复合物(6). 在第3步中，淋巴细胞整合素α_L（左）β₂（LFA-1，CD11/CD18）通过与HEV表达的反受体、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）或ICAM-2结合来调节牢固黏附(7,8). 在淋巴细胞归巢于肠道相关淋巴组织（如派尔氏结）的情况下，α₄β₇（LPAM-1），可通过与HEV上的MadCAM-1的相互作用调节淋巴细胞的滚动和减慢(9,10).

尚待确定的是提供增强整合素粘附性刺激的分子（上述步骤2），以及在淋巴细胞归巢过程中作为化学引诱剂（步骤4）的分子。迄今为止，执行这些功能的最佳候选者是趋化因子，这是一个快速增长的小分子碱性蛋白家族，可指导白细胞的迁移(11,12). 趋化因子与一级结构和特性有关，如与肝素结合的能力。根据其保守半胱氨酸的排列，它们可分为四组。迄今为止研究的所有趋化因子都通过与七跨膜域G蛋白偶联受体结合来发挥作用。趋化因子已被证明能激活β₁或β₂单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞上的整合素，并在炎症期间作为这些细胞的化学引诱剂(13–15). 间接证据表明，它们在淋巴细胞归巢过程中可能发挥类似的功能。百日咳毒素治疗淋巴细胞可抑制α_L（左）β₂（LFA-1）介导的HEV粘附和淋巴细胞进入次级淋巴器官，与G_αi-这些过程中连接的趋化因子受体(16–18). 尽管有这些证据，但尚未证明趋化因子具有介导原始淋巴细胞向次级淋巴器官归巢所需的表达模式或活性(19).

最近，一些淋巴细胞特异性趋化因子被描述在次级淋巴器官中表达(20–22). 在这里，我们研究了其中一种次级淋巴组织趋化因子（SLC），它可能参与淋巴细胞归巢。我们证明SLC在HEV和脾脏、派尔氏结和淋巴结中T细胞聚集区表达。SLC是一种高效的淋巴细胞化学吸引剂，对原始T细胞具有优先活性。最后，SLC通过β2整合素与反受体ICAM-1结合，诱导原始T淋巴细胞的牢固粘附。

方法

结果

SLC在HEV、T细胞区和淋巴内皮中表达。

由就地杂交后，我们发现SLC在淋巴结HEV中以惊人的高水平表达（图。​（图11 A、 E类)和派尔斑（数据未显示）。SLC在淋巴结的T细胞区表达较低水平（图。​（图11A类)，脾脏（图。​（图11B类)和派尔斑（数据未显示），但在这些器官的B细胞区（卵泡）中未检测到。信号在T细胞区的分布暗示了基质细胞而不是淋巴细胞的表达。SLC也表达于多器官小血管内皮。这些血管在肝脏中的特征解剖位置被确定为淋巴管（图。​（图11F类)和小肠（图。​（图11G公司). 在大脑（数据未显示）或动脉或静脉中未检测到SLC表达。在对照实验中，使用SLC感测探针未发现杂交现象（图。​（图11 C、 D、H).

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图1

小鼠组织中SLC mRNA的检测就地杂交。切片与反义杂交(A、 B、E–G)或感觉(C、 D、H)³⁵S标记的SLC核糖探针。(A类)淋巴结SLC反义探针杂交的暗场显微照片。信号被视为白点。HEV用箭头表示。(B类)脾中SLC反义探针杂交。SLC感测探针未与淋巴结杂交(C)或脾脏(D类). (E类)HEV的大功率视图A类显示在明亮的区域，显示典型的形态。信号被视为黑点。(F类)SLC与肝脏小淋巴管内皮细胞的杂交（箭头所示）。(G公司)将SLC与小肠内中心乳汁衬里的内皮细胞杂交（用星号表示）。(H（H）)小肠中缺乏与SLC感测探针的杂交。确定的结构有：F、卵泡；T、 T细胞面积；ca，中央小动脉；A、 动脉；V、 静脉；bd，胆管。[棒材=100μm(A–D)和50微米(E–小时).]

为了证实原位杂交的结果，我们对人类和小鼠组织的mRNA印迹进行了Northern分析。将人类SLC与人类多组织点杂交显示，该mRNA在淋巴结和阑尾中最为丰富，在脾脏、小肠、甲状腺、胰腺、气管和唾液腺中含量适中（图。​（图22A类). 多个组织显示低水平杂交。在大脑的任何区域（数据未显示）或外周血淋巴细胞中均未观察到信号。在小鼠组织中，SLC在外周和肠系膜淋巴结中表达最强，在派尔氏结、脾脏和胸腺中表达较低（图。​（图22B类). 新分离的小鼠B细胞、T细胞和巨噬细胞呈阴性。

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图2

通过Northern分析检测组织和纯化细胞中的SLC mRNA。(A类)hSLC的放射自显影³²P探针杂交到人类多问题斑点杂交。从左到右，所示组织为：第一排，心脏，主动脉，骨骼肌，结肠，膀胱，子宫，前列腺，胃。第二排，睾丸、卵巢、胰腺、垂体、肾上腺、甲状腺、唾液腺、乳腺。第三排，肾脏、肝脏、小肠、脾脏、胸腺、外周白细胞、淋巴结、骨髓。第四排，阑尾，肺，气管，胎盘。(B类)mSLC的放射自显影³²P探针杂交到小鼠northern blot。EF-1α杂交显示了每条车道上mRNA的装载量。

SLC刺激天然T淋巴细胞的趋化性。

由于SLC在T淋巴细胞进入和聚集区域表达，我们研究了其对淋巴细胞亚群的趋化活性。我们发现小鼠SLC对小鼠脾T淋巴细胞是一种高效的化学吸引剂，能够刺激70%以上的输入T细胞的迁移（图。​（图3三A类). 在次最大浓度下，SLC对CD4表现出更强的活性⁺比CD8⁺T细胞。它对B细胞的活性较低。SLC比SDF-1α吸引更多的T细胞，具有更大的T细胞特异性，SDF-1曾被描述为对静止淋巴细胞最有效的趋化因子(25). SLC对CD4具有优先活性⁺表达高水平L-选择素和低水平CD44的T淋巴细胞（图。​（图3三B类). 在小鼠中，这种细胞表面标记的模式指示了原始淋巴细胞(26,27). 淋巴细胞与百日咳毒素的预培养抑制了对SLC的趋化反应（图。​（图3三C)，与通过G发出的信号一致_αi-耦合受体。为了研究SLC对那些通常被招募到次级淋巴器官的细胞的影响，我们测量了小鼠外周血淋巴细胞的趋化反应。SLC是这些细胞的强化学引诱剂，对CD4的活性最大⁺和CD8⁺T细胞（图。​（图3三D类).

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图3

SLC对小鼠淋巴细胞亚型的趋化活性。小鼠淋巴细胞通过5μm孔Transwell过滤器进行趋化。通过免疫染色和流式细胞术测定每个亚型的输入和迁移细胞数。结果表示为迁移到下腔的每种亚型输入细胞的百分比。(A类)B细胞迁移，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞至SLC。为了进行比较，显示了相同细胞向SDF-1α的峰值迁移。(B类)针对SLC，比较原始细胞迁移和记忆细胞迁移。幼稚CD4+细胞是指那些表达L-选择素（LSEL）的细胞⁺)并且CD44（CD44-lo）水平较低。存储单元则相反（LSEL⁻和CD44 hi）。(C)用百日咳毒素（PTX）预处理细胞2小时，抑制SLC诱导的迁移。(D类)小鼠外周血淋巴细胞迁移。数据点表示一式三份实验的平均值±SD。

SLC激活T淋巴细胞上的β2整合素。

由于SLC在HEV中表达，可以刺激原始淋巴细胞的趋化性，我们预测它也会激活T细胞上的β2整合素。为了验证这一假设，我们在平行板流动室中通过生理剪应力测量了人类淋巴细胞对分离的抵抗力(19). 当流动剪切增加时，SLC刺激T淋巴细胞与ICAM-1底物粘附的百分比增加（图。​（图44A类). 幼稚T淋巴细胞也有类似的反应，这种反应可以被抗α_L（左）抗体（图。​（图44B类).

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图4

SLC诱导总T淋巴细胞和原始T淋巴细胞与固定化ICAM-1的抗剪切结合。在平行板流动室中的静态条件下，允许按指示处理的T淋巴细胞与ICAM-1粘附6分钟。每10秒启动流量并以2倍的增量增加。结果表示为在每个流速下保持束缚的输入细胞的百分比。(A类)SLC处理、未处理和佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯刺激T淋巴细胞的粘附。(B类)与未经处理的细胞和经SLC和抗α_L（左）抗体。数据点表示至少三个单独实验的平均值±SD。使用配对双尾学生模型进行分析t吨试验表明，SLC诱导两个总T淋巴细胞的结合具有统计学意义(对<0.01）和原始T淋巴细胞(对<0.05）至ICAM-1。

讨论

在这项研究中，我们证明SLC满足一种趋化因子的许多重要标准，该趋化因子介导淋巴细胞归巢到次级淋巴器官。首先，SLC在淋巴结和派尔氏结的HEV中表达，后者是淋巴细胞进入这些器官的主要部位，在T细胞区内，淋巴细胞首先聚集在脾、淋巴结和佩尔氏结中。据我们所知，这种表达模式是SLC独有的。其次，SLC是迄今为止对幼稚T淋巴细胞最有效的化学引诱剂，该细胞类型主要被募集到次级淋巴器官。最后，SLC是第一个在生理剪切条件下刺激淋巴细胞与ICAM-1粘附的趋化因子，这是淋巴细胞渗入淋巴结和派尔氏结所需的步骤。综上所述，这些发现强烈表明SLC作为淋巴细胞的淋巴归巢趋化因子发挥作用。

我们的发现为SLC的作用提供了新的信息。我们发现，在次级淋巴器官中发现的SLC mRNA可归因于其在HEV和T细胞区的表达。我们发现SLC的表达比报道的更广泛(21,23,24)并证明这是由于其在淋巴管内皮上的表达。SLC在淋巴管内皮中的作用尚不清楚，但我们假设它可能会将组织中的淋巴细胞募集到引流淋巴管中。SLC的内皮表达可能解释了在该分子上发现的保守的高度碱性C末端延伸。该基序可能通过与内皮细胞糖萼上的特定阴离子分子结合，将SLC锚定在血管内。

我们观察到的SLC对T和B淋巴细胞的趋化活性与Hromas发现的最相似等。(24). 然而，与该组不同，我们发现SLC对幼稚淋巴细胞而非记忆淋巴细胞最为活跃。这可能反映了所研究细胞的物种差异。我们的结果与Hedrick和Zlotnik的结果不同，他们发现未经刺激的小鼠脾细胞对SLC无反应(23). 这种差异可能是由于他们使用了细菌产生的SLC，这种SLC的活性可能与真核细胞中的蛋白质不同。

以往对趋化因子激活淋巴细胞β2整合素能力的研究得出了相互矛盾的结果。劳埃德等。(28)发现几种趋化因子可以刺激外周血淋巴细胞粘附在ICAM-1涂层载玻片上。然而，通过使用平行板流动室，Carr等。(19)没有观察到这样的效果。我们用于证明SLC激活β2整合素的条件与后面的研究类似。唯一被证明能激活淋巴细胞β的其他分子₂整合素是GlyCAM-1，一种由HEV内皮细胞表达的分泌型L-选择素配体(29). SLC和GlyCAM可能协同作用，刺激淋巴细胞与HEV的牢固粘附。这种相互作用应在今后的研究中进行调查。此外，由于SLC在派尔氏结HEV中表达，因此研究SLC激活α₄β₇整合素，是淋巴细胞归巢到该组织所必需的。

我们的结果没有完全解决的一个重要问题是SLC作用于淋巴细胞的亚群体内虽然我们强调了SLC对幼稚T淋巴细胞的影响，但我们的研究结果表明，SLC也可能能够招募其他类型的淋巴细胞进入次级淋巴器官。有人建议只有原始淋巴细胞直接从血液进入淋巴结(30). 然而，最近的研究表明，记忆淋巴细胞也遵循这一途径，尽管效率较低(31,32). 因此，有可能在体外SLC对记忆T细胞的趋化作用代表了刺激这些细胞归巢的能力体内在证明记忆淋巴细胞归巢的研究中，这些细胞进入淋巴结和派尔氏结的能力被认为部分取决于其L-选择素的表达(32). 确定记忆淋巴细胞归巢的程度与这些细胞上SLC受体的表达是否相关将是很有意义的。

与公布的结果一致(24)，我们证明B淋巴细胞也被SLC吸引，尽管其效率远低于T细胞。与T细胞一样，B淋巴细胞通过穿过HEV进入淋巴结和派耶斑，并在转移到卵泡之前，最初在SLC也表达的T细胞区域积累(33). 鉴于这些结果，SLC可能刺激B细胞进入次级淋巴器官，然后这些细胞被B细胞特异性趋化因子（如BLR1配体）吸引到卵泡(34). 然而，鉴于B细胞相对于T细胞对SLC的反应性较低，我们发现另一种趋化因子负责B细胞归巢到次级淋巴器官也是同样合理的。

第二个尚未解决的问题是在脾脏、淋巴结和派尔氏结的T细胞区表达SLC的细胞类型。Northern杂交未在淋巴细胞中检测到SLC mRNA，Hedrick发现SLC未在淋巴细胞或树突状细胞的cDNA文库中表达(23)这表明这些细胞类型不太可能是来源。与后来的结果一致，我们无法通过以下方法在纯化的交叉指状树突状细胞中检测到SLC信息就地杂交（数据未显示）。高内皮细胞和淋巴管内皮细胞表达SLC表明，T细胞区域内的内皮细胞也可能是来源。然而，巨噬细胞或纤维母细胞网状细胞也可能表达。

总之，我们的发现表明SLC具有淋巴器官归巢趋化因子的特征。符合当前白细胞贩运的多步骤模型(三,4)我们可以预测，定位于HEV局部高浓度的SLC与滚动淋巴细胞上的G蛋白偶联受体相互作用。受体占用，可能与L-选择素介导的信号有关(29)刺激β2整合素介导的对ICAM-1等反受体的粘附增加。紧贴的淋巴细胞随后可能会出现趋化性或单向性(35)梯度进入T细胞区。我们最近发现了一种能刺激B细胞迁移到淋巴滤泡的趋化因子（M.D.G.、V.N.Ngo、K.M.Ansel、E.H.Eckland、J.G.C.和L.T.W.；未发表的手稿），支持新出现的观点，即趋化因子是控制淋巴细胞进入淋巴器官和在淋巴器官内迁移的主要线索。

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