早期紧密连接屏障功能需要阻塞蛋白的COOH端子爪蟾胚胎

抗氧化酶和抗ZO-1血清的生产

利用pGEX-3载体构建了含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和鸡闭塞素COOH末端（250个氨基酸）的融合蛋白(史密斯和约翰逊，1988). 在含有0.01%氨苄西林的Luria-Bertani培养基中稀释过夜细菌培养物，并在37°C下培养2-3小时。通过添加0.2 mM IPTG诱导融合蛋白的合成。诱导4-5小时后，于2100年通过离心法收集细胞克将细胞悬液在含1%Triton X-100的冰上超声处理1分钟，并在5100℃下离心克将上清液与谷胱甘肽-琼脂糖珠培养15分钟(西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯市）在4°C下洗涤30分钟，用PBS洗涤三次，然后通过添加5 mM谷胱甘肽释放结合的融合蛋白。全长融合蛋白在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离并通过电洗脱纯化。

向两只兔子注射纯化的融合蛋白以提高多克隆抗体（宾夕法尼亚州加拿大人Pocono兔子农场和实验室）。在含有1 mg纯化融合蛋白的Sepharose 4B柱上亲和纯化得到的11350和11351抗血清。这种抗鸡闭塞素抗体与爪蟾免疫印迹和免疫组织化学中的闭塞素。

通过GST-ZO-1融合蛋白免疫制备抗-ZO-1抗血清。构建了一个由pGEX-1表达载体组成的结构，该表达载体包含1.8 kb跨越选择性剪接位点的人类ZO-1序列（这是耶鲁大学纽黑文分校J.Anderson的慷慨捐赠）。GST–ZO-1抗血清的制备和亲和纯化过程与上述GST–occludin构建体相同。

爪蟾卵母细胞和胚胎中mRNA的体外转录和微量注射

含有野生型或突变型鸡闭塞素的SP64T载体用BamHI线性化，并用SP6 RNA聚合酶体外转录（Ambion Inc.，德克萨斯州奥斯汀）。成年女性非洲爪蟾从部门青蛙设施（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院细胞生物学系）获得。根据公布的方案收集卵母细胞并进行去绒毛处理(Swenson等人，1989年). 卵母细胞在其植物半球微量注射40 nl（～100 pg）RNA或水，并在17°C下培养过夜，以进行免疫印迹或免疫沉淀实验。

如前所述获得受精胚胎(Paul等人，1995年). 将4 nl（～10 pg）FLAG标记的全长或截短的鸡闭塞素RNA注射到八细胞胚胎的前、背卵裂球中。注射后6–8 h，胚胎直接嵌入TISSUE-TEK包埋介质中（Miles Inc.，Elkhart，in）不固定，在液态丙烷中快速冷冻或用于表面生物素化实验（见下文）。

细胞培养和代谢标记

A6爪蟾肾上皮细胞（由纽约斯隆-凯特琳研究所的B.Gumbiner善意提供）在61%Leibovitz L15培养基中生长(GIBCO巴西雷亚尔（马里兰州盖瑟斯堡）补充5%FCS（犹他州洛根Hyclone实验室）、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素以及45 mM NaHCO_三pH 7.3，27°C，在含5%CO的增湿培养箱中₂细胞在27°C下用150μCi/ml Tran进行代谢标记20 h³⁵S标签([³⁵S] 满足/[³⁵S] 半胱氨酸；ICN Radiochemicals，克利夫兰，俄亥俄州）在70%无蛋氨酸介质中(GIBCO巴西雷亚尔)补充5%透析FCS(西格玛化学公司。). 在标记期结束时，将细胞在冰镇的0.65×PBS中冲洗三次，并用与爪蟾胚胎（见下文）。

免疫沉淀

RNA注入爪蟾卵母细胞或胚胎用PBS冲洗三次，然后通过22号针头在溶解缓冲液（5 mM EDTA、5 mM EGTA、5 M M Tris、pH 8.0）中用10μg/ml的凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑素a、0.01%二异丙基氟磷酸和20μM PMSF分别将其均匀化。匀浆在3000℃下离心克在4°C下放置10分钟，将蛋黄颗粒制成颗粒。然后将上清液在100000下离心克在4°C下悬浮30分钟。将膜颗粒重新悬浮在裂解缓冲液和SDS-PAGE样品缓冲液中，使其达到每10μl两个卵母细胞的最终浓度，以进行免疫印迹。对于免疫沉淀实验，将膜颗粒重新悬浮在IP缓冲液中（1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸、0.2%十二烷基硫酸钠、150 mM NaCl、10 mM Hepes、2 mM EDTA、10 KIU/ml Trasylol、10μg/ml凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑素A以及0.01%二异丙基氟磷酸），在冰上培养30分钟，然后在100000下离心克在4°C下保持1小时。上清液要么与一级抗体直接孵育，要么与³⁵首先是S标记的A6细胞裂解物，然后与一级抗体在4°C下孵育过夜。样品与蛋白质A–Sepharose CL-4B或蛋白质G–Sephalose 4B孵育(西格玛化学公司。)在4°C下再保持2小时。在IP缓冲液中进行三次洗涤后，一次在高盐（0.5 M NaCl，10 mM Tris）中洗涤，另一次在10 mM Tris缓冲液中洗涤，样品在SDS-PAGE样品缓冲液中溶解。

SDS凝胶电泳和免疫印迹

样品在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸3分钟，并在10%或12%的SDS-聚丙烯酰胺微凝胶上分离。然后将蛋白质转移到Immobilon膜上(Millipore公司。，马萨诸塞州贝德福德）。室温下用5%低脂牛奶在TBS中加0.1%吐温20封闭膜1小时，然后用1:1000稀释的抗闭塞素抗体或10μg/ml使用的抗FLAG单克隆抗体在室温下孵育2小时。用碱性磷酸酶结合羊抗兔IgG检测一级抗体(Promega公司。威斯康星州麦迪逊）或山羊抗鼠IgG(博林格曼海姆生物化学公司印第安纳波利斯，印第安纳州），1:5000或1:1000使用。为了降低背景，二级抗体用粗品预先吸收爪蟾卵母细胞在与Immobilon膜反应之前进行匀浆。在室温下用二级抗体孵育1小时后，用TBS将斑点清洗三次，然后根据制造商的说明进行显色反应。

表面生物素化-紧密连接渗透性测定

RNA注射后6小时，爪蟾将胚胎冷却至10°C 5分钟，然后转移到新制备的1 mg/ml NHS LC生物素中(皮尔斯化学公司。，Rockford，IL）在0.1×MMR溶液中（0.1 M NaCl，2 mM KCl，1 mM MgSO₄，2 mM氯化钙₂·2小时₂O、 0.1 mM EDTA和5 mM Hepes，pH 7.8）。在10°C下用生物素标记12 min后，用0.1×MMR将胚胎洗涤两次，并在4°C下将其固定在3%甲醛中过夜，甲醛是由80 mM的多聚甲醛钠（pH 7.4）新鲜制成的。用PBS冲洗胚胎，将其包埋在TISSUE-TEK中并冷冻切片。将14-μm冰冻切片在封闭缓冲液（1%鱼皮明胶和1%牛血清白蛋白，PBS）中培养至少5 h。然后将1:200稀释在封闭缓冲溶液中的抗FLAG M2抗体放置在切片上，并在4°C下培养过夜。用封闭缓冲液冲洗三次后，用预吸附的FITC-偶联山羊抗鼠IgG孵育切片(博林格曼海姆生物化学公司)和RITC-亲和素(皮尔斯化学公司。)，均在阻隔缓冲液中稀释1:500。用抗FLAG M2抗体鉴定RNA注射区域。生物素化后将对照胚胎加热至18°C，并允许其发育到蝌蚪阶段。选择12分钟标记时间是因为这是10°C下的最大时间，这与胚胎到蝌蚪阶段的正常发育完全一致。

四个COOH端截断阻塞物对紧密结磁导率屏障的破坏

我们使用一种新的表面生物素化方法来检测胚胎紧密连接的通透性。在正常发育过程中爪蟾胚胎中，生物素分子从双细胞期开始就被阻止进入有限的细胞间隙，这表明功能性紧密连接的形成和囊胚腔的形成始于第一次卵裂(斯莱克和华纳，1973年; Merzdorf，C.、Y.-H.Chen和D.A.Goodenough，手稿正在准备中）。当来自结构体504（全长）、486（COOH末端截短最少）和CT（仅COOH终点）的mRNAs注射到8世纪胚胎中时，结果与只注射水的胚胎相同：紧密连接对生物素示踪剂是不可渗透的（图。​（图3，三,一和b; 未显示CT数据）。NHS-LC-生物素标记卵黄包膜和顶端卵裂球膜，它们在胚胎表面共同出现一条粗线（图。​（图3，三,一和b). 细胞间隙的卵裂球之间未检测到信号。然而，如果胚胎注射来自四个COOH末端截短结构385、336、320和266的mRNA，上皮细胞之间的细胞间隙就会被生物素穿透（图。​（图3，三,c–f)，表明残留物486和385之间存在一个关键区域，这是正确组装所必需的，对紧密连接密封至关重要。图。​图3三 c（c）(箭头)揭示了胚胎表面下的内部细胞膜也被生物素化，表明示踪剂穿透了第一层细胞。这一观察表明，截短的闭塞素分子一定改变了紧密连接的渗透功能。用亲和素和抗FLAG M2抗体对切片进行双重标记显示，泄漏仅发生在表达截短闭塞素蛋白的卵裂球之间；同一胚胎内未被M2标记的卵裂球之间的紧密连接处密封良好（数据未显示）。

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图3

通过表面生物素化测定紧密连接的功能爪蟾注射鸡全长或截短闭塞素的胚胎。mRNA注射后6小时（2000个细胞的囊胚），通过在10°C下在1 mg/ml NHS-LC生物素中孵育12分钟来标记胚胎，洗涤，然后在80 mM的二甲二酰化钠中的3%甲醛中固定。冰冻切片用RITC-亲和素染色并用荧光显微镜观察。在所有胚胎中，NHS-LC-生物素与卵黄膜、卵黄下间隙和卵裂球顶端质膜中的分子发生反应，这些分子在胚胎表面共同形成一条粗而连续的线。注射504的胚胎紧密连接(一，全长）或486(bmRNAs中COOH末端截短最少的）阻断物阻止生物素进入细胞间隙，卵裂球基底外侧膜未染色。在注射了385的胚胎中(c（c）), 336 (d日) 320 (e（电子）)、和266(（f）)（四个COOH末端截短的mRNAs），生物素分子渗入细胞间隙，表明紧密连接密封被破坏。棒材，10μm。

截短的occludin突变体的这些显性负效应对稀释和来自野生型蛋白的竞争敏感。当截断的闭塞分子mRNA被稀释1:10而不是1:50时，观察到卵裂球之间的泄漏（数据未显示）。通过将结构体504（全长）中等量的mRNA与结构体266中的mRNA共同注射，可以挽救诱导的紧密连接泄漏。图。​图44显示了爪蟾从构建体504中注射mRNAs 6小时后的胚胎(一), 266 (b)、266和504一起(c（c）). 504和266 mRNAs同时注射导致卵裂球之间没有检测到泄漏（图。​（图44 c（c）).

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图4

全长（504）的闭塞素mRNA与COOH末端截短的闭塞素最大的mRNA（266）共同注射，挽救了仅注射构建物266引起的紧密连接泄漏。实验步骤与图中相同。​图3。三胚胎冷冻切片注射504～2 pg(一), 266 (b)，或504和266(c（c）)构建的mRNA用RITC-亲和素染色。胚胎外空间朝向图的顶部一，然后留在b和c（c）。感染504 mRNA的胚胎中未发现渗漏(一). 生物素分子清楚地穿透紧密连接处，并标记注射266mRNA的胚胎顶端细胞之间的细胞间隙(b). 然而，注射504和266 mRNA的胚胎中没有检测到泄漏(c（c）). 棒材，15μm。

外源鸡闭锁蛋白对早期非洲爪蟾胚胎紧密连接的靶向作用

全长闭塞素以及所有截短的突变体可以在早期定位于紧密连接爪蟾除可溶CT外的胚胎。图。​图55显示了外源性截断闭塞蛋白与内源性全长共定位的示例爪蟾咬合蛋白。用抗闭塞素多克隆抗体11350对注射构建物266 mRNA（COOH末端截短最多的一个）的胚胎冷冻切片进行双重染色（图。​（图55 一)和抗FLAG单克隆抗体M2（图。​（图55 b). 在图中。​图5，5，胚胎外空间朝向图的顶部，胚泡腔朝向底部。由于卵裂球的顶端区域在切面上停留了不同的距离，线性紧密连接染色（图。​（图5，5,一和b,箭头)取样时，染色呈单根或分支细线状，勾勒出切片中包含的顶端细胞表面的那些部分。由于抗闭塞素11350不能识别266个突变的闭塞素（图。​（图22 一，车道266)，图中的信号。​图55 一仅来自内源性全长闭塞素，而图。​图55 b定位了大多数COOH末端截短的外源性occludin。此外，所有表达的外源蛋白都含有细胞质染色。抗闭塞素的共定位（图。​（图55 一)和防FLAG（图。​（图55 b)证明一部分表达的外源性闭塞素已被正确定位于紧密连接。

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图5

冰冻切片的双重标签爪蟾含有抗闭塞素11350的胚胎(一)和防FLAG M2(b). 将突变266mRNA的4nl（～10pg）微注射到八细胞期胚胎的前、后卵裂球中，在室温下孵育8h后冷冻。箭头表示的是爪蟾连接复合体处的全长闭塞素和鸡截短闭塞素。棒材，10μm。

虽然抗FLAG抗体在所有构建物中都显示出线状染色模式（数据未显示），但用抗FLAG和抗闭塞素双重标记来证明共定位是不明确的，因为抗闭塞素试剂识别除构建物266外的外源和内源分子（如图所示。​图5）。5). 因此，外源性闭塞素突变体与另一紧密连接标记ZO-1共定位。图。​图66显示了注射构建物266 mRNA的胚胎冰冻切片的免疫荧光照片，用抗ZO-1（紧密连接位置的独立标记）双重染色(史蒂文森等人，1986年)和防FLAG M2。染色显示大多数COOH末端截短的外源occludin与内源性ZO-1共定位，表明突变occludin靶向连接复合体，尽管它几乎缺乏整个COOH末端，该末端包含与ZO-1的结合结构域。全长和其他四个COOH末端截短的鸡闭塞素蛋白均定位于紧密连接处，如图所示。​图55和​和66（未显示数据）。对于编码可溶性COOH末端肽的构建CT，抗FLAG信号位于细胞质中，在紧密连接处无法检测到（数据未显示）。通过对不同发育阶段的胚胎进行取样，注射后4 h在紧密连接处检测到FLAG标记的鸡闭塞素。注射后20小时，FLAG表位的免疫荧光信号显著降低，这可能是由于注射的mRNA降解或稀释所致。

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图6

免疫共定位爪蟾ZO-1与突变体266（在爪蟾胚胎。冷冻切片由注射突变266 mRNA的胚胎制成，并用抗ZO-1抗体染色(一)或带防FLAG M2(b). 箭头表示这两种蛋白质在结合复合体上的共定位。棒材，10μm。

我们要感谢J.Goliger博士、J.Jiang博士和A.Simon博士的技术支持，以及Paul/Goodenough实验室的成员对手稿的批判性阅读。

这项工作得到了国家卫生研究院GM18974号拨款的支持。