FBXO22通过靶向MLL重排急性髓系白血病BACH1促进白血病发生

MLL-AF9诱导的小鼠AML模型

建立可移植MLL-AF9诱导的小鼠AML模型如下。简单地说，通过腹腔注射，以120 mg/kg体重向10–12周龄供体小鼠注射5-氟尿嘧啶（5-FU）。林⁻在5-FU治疗后第6天分离骨髓（BM）细胞，并在4µg/ml聚合物存在下用逆转录病毒pMIG-MLL-AF9-IRES-GFP上清液感染两次。感染细胞在补充有20 ng/ml小鼠干细胞因子、10 ng/ml鼠白细胞介素-3（IL-3）和10 ng/ml鼠白细胞介素-6（IL-6）的StemSpan™SFEM培养基中培养。在第二轮感染后，收集细胞并以2×10的剂量静脉注射到致死剂量照射的C57BL/6小鼠中⁵每个收件人2×10⁵竞争对手BM细胞。用1×10进行连续移植⁴纯化GFP⁺初级或次级受体小鼠的BM白血病细胞或1000个纯化的白血病-粒细胞-单核细胞祖细胞（LGMP）细胞与2×10混合⁵竞争对手BM细胞。对于极限稀释分析Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−GFP公司⁺从主要受体收集的BM细胞与2×10共移植⁵竞争细胞转化为致死性辐射受体小鼠。使用StemCell Technologies的L-Calc软件记录存活时间以计算LSC频率。

流式细胞术分析和分类

新鲜分离BM单细胞悬浮液，并通过40μm滤网过滤。用氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液处理外周血（PB）细胞，去除红细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬浮。按照制造商的说明，使用指示的荧光铬偶联抗体对细胞进行表面染色。表面染色后用Hoechst 33342和Ki-67-BV786染色检测细胞周期分布。对于细胞内染色，按照制造商的协议，使用BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit固定和渗透细胞。根据制造商的说明，用膜联蛋白-V-别藻蓝蛋白（APC）和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色分析细胞凋亡。附加文件中列出了这些实验中使用的抗体和染料的详细信息1：表S1。染色后使用BD荧光激活细胞分选仪（FACS）Aria II或Aria III进行细胞分选。

免疫沉淀和质谱分析

如前所述，使用电喷雾离子化对标记蛋白或内源性蛋白和纳米LC-MS/MS进行免疫沉淀，以识别相互作用蛋白[28,29]. 免疫沉淀中使用的抗体在附加文件中列出1：表S1。

变性泛素分析

用10µM蛋白酶体抑制剂MG132处理THP-1细胞6 h，收获并用变性溶解缓冲液（变性IP缓冲液50 mM Tris-HCl，pH 6.8，2%SDS）溶解，在100°C下煮沸20 min，以分离蛋白质-蛋白质相互作用。在4°C下17000 g离心10 min后，用1.2 ml 1×RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，PH7.6，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1%NP-40，1 m M PMSF和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒），用BACH1抗体进行免疫沉淀，然后进行Western blot分析，以显示多泛素化蛋白带。

集落形成单位分析

BM细胞分离自Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−或Scl-Cre公司⁻;Fbxo22公司^{飞行/飞行}和Scl-Cre公司⁺;Fbxo22公司^{飞行/飞行}将小鼠置于含有MethoCult M3434（StemCell Technologies）的12孔板中，以进行2.5×10的集落形成单位粒细胞、红细胞、单核细胞和巨核细胞（CFU-GEMM）或MethoCultM3534（Stem Cell Technols）集落形成分析⁴细胞/孔，MethoCult M3334（StemCell Technologies）用于克隆形成单位红细胞（CFU-E）或MethoCut M3630（StemCell Technologies⁵电池/孔符合制造商的协议。GFP公司⁺或根据制造商的说明，将从原发性AML受者中分选出来的LGMP细胞按指定数量放入含有完整MethoCult M3534培养基的12孔板中。为了进行THP-1的克隆形成分析，将FBXO22-敲除的THP-1细胞或对照细胞以500个细胞/孔的速度置于含有完整MethoCult H4436（StemCell Technologies）的12孔板中。为了对AML患者的单核细胞（MNC）进行克隆形成分析，将FBXO22-敲除或过表达的细胞与对照细胞一起置于含有MethoCult H4436的24孔板中，每孔40000个细胞。在电镀后7-10天对菌落进行成像和计数。

细胞系和细胞培养

THP-1、MV4-11、Molm13、Kasumi-1、HL-60和U937细胞保存在添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640中。32D细胞用10%FBS和10 ng/mL小鼠IL-3保存在RPMI-1640中。293个T细胞保存在补充有10%FBS的DMEM中。细胞在37°C和5%CO的增湿培养箱中培养₂所有细胞系均购自美国型培养物收藏中心（ATCC）。

AML患者

采用密度梯度离心法从上海交通大学医学院仁济医院AML患者的骨髓样本中分离出原代人AML MNC。所有患者都获得了书面知情同意书，所有程序都得到了仁济医院医学研究伦理委员会（IRB）的批准。样品在含有10%二甲基亚砜（DMSO）的FBS中冷冻并储存在液氮中。

公共数据库分析

来自基因表达综合数据库（GEO）的公开注释数据集，包括{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE1159”，“term_id”：“1159”}}GSE1159标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE13159”，“term_id”：“13159”}}GSE13159标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE7186”，“term_id”：“7186”}}GSE7186标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE48173”，“term_id”：“48173“}}GSE48173型,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE76008”，“term_id”：“76008“}}GSE76008标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE63720”，“term_id”：“63720“}}GSE63720标准,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE68172”，“term_id”：“68172“}}GSE68172型和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE138883”，“term_id”：“138883”}}GSE138883标准通过R包affyPLM（1.30.18）或独立使用GEO2R下载并使用RMA方法进行分析。使用R包TCGAbiolinks（2.25.3）对来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库的AML样本的基因表达数据进行分析，然后进行log处理₁₀，并从cBioportal下载了公共临床注释(http://www.cbioportal.org/). 通过交互式浏览器（包括Vizome）探索Beat-AML的基因表达计数和临床细胞遗传学结果(http://vizome.org/aml2/)和BeatAML2(https://biodev.github.io/BeatAML2/). AML的蛋白质组数据库（PXD032110）通过AML的蛋白组学和磷蛋白组学景观进行访问和查询(http://www.leylab.org/amlproteome).

质粒、病毒构建和感染

使用慢病毒载体pLKO.1-GFP（目标序列列于附加文件1：表S1）。FBXO22编码序列（CDS）分别插入到多西环素（Dox）诱导的慢病毒载体pINDUCER21和逆转录病毒质粒pQCXIN中。使用聚乙烯亚胺（PEI）转染方法，利用包装质粒pCMV-dR8.91（Δ8.9）和pMDG生产慢病毒。为了进行救援实验，将带有shFBXO22#1靶序列多点突变的标记FBXO22 CDS插入逆转录病毒质粒pQCXIN中。将HA标记的Fbxo22 CDS插入逆转录病毒质粒pMIGR1-RFP中。为了研究BACH1对人类AML细胞系和动物模型中AML进展的影响，将Flag标记的BACH1 CDS和HA标记的BACH1 CDS分别插入pQCXIN和pMIGR1-RFP中。用PEI转染方法在人细胞中用包装质粒gag-pol和VSV-G或在小鼠细胞中用pCL-ECO制备逆转录病毒。收集慢病毒或逆转录病毒上清液，通过以1800rpm两次离心90分钟感染细胞。

体外增殖分析

以人FBXO22或shNC慢病毒上清液为靶点的shRNAs感染多个人类白血病细胞系THP-1、MV4-11和人类AML患者的MNC，然后分析指定时间点的体外增殖能力。根据制造商的说明书，使用CCK8试剂盒（Dojindo）进行用于体外增殖测定的细胞计数试剂盒8（CCK8）实验。人类AML患者的细胞在补充有20 ng/ml人类干细胞因子、10 ng/ml人IL-3和10 ng/ml人IL-6的Stemspan基本培养基（StemCell Technologies）中培养。（所有生长因子均来自PeproTech。）

回零

6 × 10⁶ Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−GFP公司⁺将从主要受体收集的BM细胞移植到致死性辐射小鼠体内。GFP的频率⁺移植后16h用流式细胞仪检测PB、脾脏和BM细胞中的细胞数。

CRISPR-CAS9公司

慢病毒载体pLenti-U6-gRNA-mCMV-SaCas9-P2A-sfGFP中的gFBXO22购自Obio Technology（中国上海）。目标序列列在附加文件中1：表S1。将携带CAS9和gRNA的病毒感染THP-1细胞48小时，接种到96个平板中，获得FBXO22基因敲除克隆。

蛋白质印迹

蛋白质提取物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移到0.45μm硝化纤维素膜（Millipore）上，用PBS中的5%脱脂牛奶封闭，然后与指示的一级抗体孵育，然后与辣根过氧化物酶（HRP）反应-链接二级抗体（Cell Signaling，Beverly，MA）；采用Immobilon Western Chemiluminase HRP底物试剂盒（Merck Millipore）进行检测。

定量RT-PCR

使用TRIzol（Invitrogen）制备总RNA，并按照制造商的说明使用随机引物（Takara）和M-MLV逆转录酶（Promega）进行逆转录以合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行qRT-PCR。实验用Applied Biosystems QuantStudio5 PCR系统进行三次。mRNA水平归一化为参考基因RNA转录水平。使用的引物序列如附加文件所示1：表S1。

删除Fbxo22公司不能影响正常造血

为了确定FBXO22是否是白血病发生所必需的，我们交叉了Fbxo22型^{飞行/飞行}带有Mx1-芯生产应变Mx1克里;Fbxo22公司^{飞行/飞行}鼠标（图2A） ●●●●。pIpC注射两周后，有效删除Fbxo22公司通过基因分型、qRT-PCR和Western blot（图2B） ●●●●。此后，pIpC-治疗Mx1-芯^–;Fbxo22公司^{飞行/飞行}和Mx1-芯⁺;Fbxo22公司^{飞行/飞行}被称为Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^–/–小鼠。考虑到Mx1型启动子驱动的Cre在造血细胞和基质细胞中表达[31]，我们也交叉了Fbxo22公司^{飞行/飞行}三苯氧胺诱导的HSPC特异性小鼠Scl-Cre公司应变，应变[32]以获得Scl-Cre公司;Fbxo22公司^{飞行/飞行}鼠标（图2A） ，以及Fbxo22公司不足Scl-Cre公司⁺;Fbxo22公司^{飞行/飞行}小鼠在三苯氧胺治疗3周后也得到证实（附加文件三：图S2A）。

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图2

删除Fbxo22公司不能影响正常造血。A类的示意图Fbxo22公司显示Cre重组酶活性后floxed外显子3-4缺失的floxed等位基因。的使用Mx1-芯或Scl-Cre公司-急诊室^T型pIpC或三苯氧胺治疗后导致HSC特异性缺失。B类 Fbxo22公司通过pIpC治疗后指定时间的PBMC和BM基因分型（左）、pIpC-治疗后第21天的BM总细胞的qRT-PCR（中）和Western blot（右）评估缺失。C类,D类代表性流式细胞仪图（左）和LSK细胞百分比（Lin⁻Sca-1型⁺c-套件⁺)、LT-HSC（林⁻Sca-1型⁺c-套件⁺CD150型⁺CD48型⁻)，MPP1（林⁻Sca-1型⁺c-套件⁺CD150型⁻CD48型⁻)，MPP2（林⁻Sca-1型⁺c-套件⁺CD150型⁺CD48型⁺)和MPP3（林⁻Sca-1型⁺c-套件⁺CD150型⁻CD48型⁺) (C类，对，n个 = 5） 和LK细胞（Lin⁻Sca-1型⁻c-套件⁺)，首席营销官（Lin⁻Sca-1型⁻c-套件⁺CD16/32型⁻CD34型⁺)，总经理（Lin⁻Sca-1型⁻c-套件⁺CD16/32型⁺CD34型⁺)和MEP（林⁻Sca-1型⁻c-套件⁺CD16/32型⁻CD34型⁻)BM中的Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−老鼠(D类，对，n个 = 5). (E–K公司)主要竞争性移植试验用Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−BM CD45.2细胞（1×10⁶)与CD45.1竞争细胞（1×10⁶). 指定时间内供体或受体来源的PB细胞百分比(E类)，并在16周时分析显示的细胞(F类–K（K）,n个 = 5).L（左）用分类的LT-HSCs（1×10）进行初次移植^三)来自Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−BM细胞和1×10⁵来自CD45.1竞争对手的BM细胞。在指定的时间点分析PB中供体或受体衍生细胞的百分比。误差条表示平均值±标准偏差。统计显著性由双尾非配对确定吨测试。所有动物实验重复至少两次，结果相似

虽然FBXO22过表达对小鼠正常祖细胞32D细胞的细胞生长和集落形成能力没有影响（附加文件三图S2B–D）和FBXO22在健康个体中的表达低于AML（图1B） ，我们仍然调查了Fbxo22公司正常造血的缺失表明Fbxo22公司pIpC诱导后8周，骨髓中HSCs、HSPCs和分化谱系的不同亚群的总BM细胞数或频率没有显著变化（图2C、 D和附加文件三：图S2E–G）。凋亡细胞比例在Fbxo22型^+/+和Fbxo22公司^–/–HSC（附加文件三：图S2H）。同时，集落形成单位（CFU）检测显示，CFU-GEMM、CFU-GM和CFU-pre-B的比例相当，而CFU-E的比例略高Fbxo22公司^–/–鼠标（附加文件三：图S2I）。类似的结果也可以在Scl-Cre公司;Fbxo22公司^{飞行/飞行}鼠标模型（附加文件三：图S2J–O）。这些数据表明Fbxo22公司缺失对正常造血没有明显影响，至少对年轻小鼠没有明显影响。为了进一步研究Fbxo22公司由于HSC的再生能力缺失，我们竞争性地移植了来自Fbxo22公司^+/+或Fbxo22公司^–/–小鼠（CD45.2⁺)与竞争细胞混合成致死性辐射受体（CD45.1⁺)并在指定时间监测PB中供体或衍生细胞的重新填充。如图所示2E–K，BM细胞总数、供体衍生HSC、HSPC的频率和分化谱系在Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^–/–移植后16周的受体。我们还用相同数量的长期（LT）HSC进行了另一项竞争性分析Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^–/–小鼠，移植后指定时间的PB分析中观察到类似结果（图2五十） ●●●●。总之，FBXO22不会显著影响正常HSC的功能。

损失Fbxo22公司在连续移植过程中损害MLL-AF9诱导的小鼠AML发展

与FBXO22在人MLLr AML细胞中的高表达一致，我们证明FBXO22在小鼠GFP中也高表达⁺MLL-AF9诱导AML模型中的白血病细胞[33]，由Western blot测定（附加文件4：图S3A）。然后，我们使用这种可移植的小鼠AML模型来探讨FBXO22在AML发展中的潜在功能。简言之，林^–来自BM的HSPCFbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^–/–用MLL-AF9-GFP逆转录病毒感染小鼠，然后将其移植到致死性辐射受体（附加文件4：图S3B）。结果表明：Fbxo22公司缺乏对GFP没有影响⁺移植后5周原代受体小鼠PB中的白血病细胞，但轻微抑制GFP⁺这些受体小鼠骨髓中的髓系白血病细胞（附加文件4：图S3C，D）。MLL-AF9-GFP感染者Fbxo22公司^–/–细胞与受感染者的存活时间也相当Fbxo22公司^+/+单元格（附加文件4：图S3E）。我们一直在MLL-AF9-GFP感染的Lin的原代移植小鼠中观察到类似的结果^–单元格来自Scl-Cre公司;Fbxo22公司^{飞行/飞行}鼠标（附加文件4：图S3F–H）。随后，我们用相同数量的GFP进行了连续CFU移植和连续移植试验⁺AML细胞。如图所示三A、 的Fbxo22型^–/–AML细胞在第一次和第二次电镀时CFU显著减少。在线路中，Fbxo22公司缺乏显著抑制GFP的植入⁺二级受体小鼠PB和BM中的髓系白血病细胞（图三B、 C）。Giemsa-Wright染色显示骨髓中未成熟母细胞的频率较低，同时脾肿大较小，二次移植受者脾脏和肝脏的白血病浸润明显减少Fbxo22公司^–/–AML细胞（图三D–F）。串联，受体小鼠接受Fbxo22公司^–/–在二次和三次移植期间，白血病细胞的存活时间显著延长（图三G、 H）。同样Fbxo22公司在里面Scl-Cre公司;Fbxo22公司^{飞行/飞行}小鼠在二次移植期间也显著抑制AML的发展（附加文件5：图S4A–D），并在二次和三次移植中显著增加了生存时间（附加文件5：图S4E，F）。

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图3

损失Fbxo22公司在连续移植过程中损害MLL-AF9诱导的小鼠AML发展。A类系列菌落和菌落编号的代表性图像（左侧）（中部和右侧，n个 = 3） 由GFP组成⁺从主要收件人收集的单元格。B类,C类流式细胞仪图（左）和GFP百分比⁺PBMC中的细胞（右，B，n个 = 5） 以及GFP的百分比⁺细胞和MG（GFP⁺Mac-1型⁺Gr1级⁺)BM（右，C类,n个 = 5） 来自具有AML细胞二次移植的受体。D类Giemsa-Wright染色的代表性图像（左）和成纤维细胞的频率（右）Fbxo22公司^+/+和Fbxo22型^−/−第二次移植的BM细胞。红色和绿色箭头分别指向具有代表性的原始细胞和分化细胞。E类,F类大体病理学（左，E类)和相对重量（右，E类)苏木精-伊红染色(F类)二级受体的肝脏和脾脏(n个 = 5).克,H（H）受体小鼠的存活曲线Fbxo22公司^+/+或Fbxo22公司^−/−MLL-AF9型⁺第二次BM细胞(克)和第三次移植(H（H）) (n个 = 6). 误差条表示平均值±标准偏差。统计显著性由双尾非配对确定吨测试(A类–E类)或对数库测试(克,H（H）)、和P（P）显示了个值。所有动物实验重复至少两次，结果相似

排除有缺陷的归位能力导致Fbxo22公司损失，GFP⁺AML细胞分类自Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^–/–受体被注射到致死性辐射小鼠体内，然后检测宿主GFP⁺PB、脾脏和BM中的AML细胞。注射后16小时，两组之间未检测到显著差异（补充文件5：图S4G）。此外，GFP⁺AML细胞来自Mx1-芯^–;Fbxo22公司^{飞行/飞行}和Mx1克里⁺;Fbxo22公司^{飞行/飞行}将小鼠移植到致死性照射的受体中，然后从第7天开始用pIpC治疗以诱导Fbxo22公司删除（附加文件5：图S4H）。生存数据表明Fbxo22公司删除基因仍然会延缓AML的进展，延长受体小鼠的存活时间（补充文件5：图S4I）。综合起来，我们的数据表明Fbxo22公司损失严重抑制了AML的发展。

损失Fbxo22公司损害LSC的功能

LSC被认为是AML患者耐药性和复发的原因[34]. 三个数据集的分析({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE63270”，“term_id”：“63270”}}GSE63270型,{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE68172”，“term_id”：“68172“}}GSE68172型和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE138883”，“term_id”：“138883”}}GSE138883标准)显示AML LSC的FBXO22转录水平高于HSC（附加文件6：图S5A）。据报道，17个基因LSC评分（LSC17）及其亚标志（其中17个基因中只有3个有助于计算评分（LSC3））在不同AML亚型患者中具有较高的预后，而LSC17/LSC3评分较高的AML患者预后较差[35]. 数据库中的分析{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE76008”，“term_id”：“76008“}}GSE76008标准表明FBXO22的表达与LSC3特征分数呈正相关，尽管其与LSC17的关系尚不清楚（附加文件6：图S5B）。与此一致，小鼠GFP中FBXO22的mRNA和蛋白水平⁺林^–c-套件⁺与正常Lin相比，富集LSC升高^–c-套件⁺丰富的HSC（附加文件6：图S5C，D）。有趣的是，GFP的频率⁺Mac-1型⁺c-套件⁺（MK）富集的LSCs在原发性中减少Fbxo22公司^–/–移植小鼠与对照小鼠的比较（图4A） ，尽管感染者的初次移植存活时间没有显著差异Fbxo22型^–/–和Fbxo22公司^+/+单元格（附加文件4：图S3E）。我们还测量了GFP的频率⁺林⁻CD127型⁻c-套件⁺CD16/32型⁺CD34型⁺（LGMP）人群，这被认为是确定LSC的另一种更严格的方法[36]，并证明Fbxo22公司^–/–在初次移植中，LGMP细胞也减少了（图4B） ●●●●。正如预期的那样，在第二阶段LSC的频率显著降低Fbxo22公司^–/–移植小鼠与对照小鼠的比较（图4C、，​C、 D）。D类). 同样，在初级和次级中检测到的LSC的百分比也较低且显著降低Fbxo22公司-空Scl-Cre公司分别移植小鼠模型（附加文件6：图S5E–H）。LSC频率的降低也与第一次和第二次电镀时CFU的减少有关（图4E） ●●●●。也，Fbxo22公司缺失显著削弱了LGMP在二级受体小鼠中引起疾病的能力（图4F） ●●●●。我们用分类的GFP进行了限制稀释试验⁺ Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^–/–来自主要受者的AML细胞，发现LSC的频率Fbxo22公司^–/–AML小鼠（1:97540细胞）与Fbxo22型^+/+小鼠（1:223个细胞）（图4G） ●●●●。此外，Hoechst和Ki67染色显示循环细胞的百分比显著更高（Hoechst^高的Ki67号机组^高的)伴随着G值的下降₀静止细胞（Hoechst^低的Ki67号机组^低的)和G₁（赫斯特^低的Ki67号机组^高的)中的单元格Fbxo22公司^–/–LGMP（图4H） ●●●●。此外，annexin-V的比例⁺凋亡细胞在Fbxo22公司^–/–LGMP（F​（Fi我g、4一） ●●●●。在中观察到类似的结果Scl-Cre公司;Fbxo22公司^{飞行/飞行}鼠标（附加文件6：图S5I-J）。共同地，Fbxo22公司LSC缺乏导致细胞周期进入增强和凋亡增加。

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图4

损失Fbxo22公司损害LSC的功能。A类,B类流式细胞仪图（左）和MKs的百分比(A类)和LGMP(B类)来自主要移植受体的BM（右，n个 = 6).C类,D类流式细胞仪图（左）和MKs的百分比(C类)和LGMP(D类)来自二次移植受体的BM（右，n个 = 5).E类菌落序列和菌落编号(n个 = 3） 由…组成Fbxo22公司^+/+和Fbxo22型^−/−从主要受体收集的LGMP细胞。F类收件人的生存曲线Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−二次移植后的LGMP细胞(n个 = 6).克限制稀释分析，比较Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−MLL-AF9型⁺骨髓细胞。指示的GFP⁺ Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−MLL-AF9型⁺从主要受体收集的BM细胞与2×10共移植⁵骨髓竞争细胞转化为致死性辐射受体。利用L-Calc软件计算竞争性再填充单位（CRU）。H（H）,我细胞周期(H（H）)或凋亡(我)二次移植受者骨髓中LGMP细胞的分析Fbxo22公司^+/+和Fbxo22公司^−/−AML细胞(n个 = 5–6). 误差条表示平均值±标准偏差。统计显著性由双尾非配对确定吨测试(A类–E类和H（H）,我)或对数库测试(F类)、和P（P）显示了个值。所有动物实验重复至少两次，结果相似

FBXO22促进MLLr AML细胞中BACH1的降解

研究由以下因素介导的AML进展抑制的分子机制Fbxo22型我们通过免疫沉淀（IP）结合LC-MS/MS分析，探讨了FBXO22在THP-1细胞中的相互作用体。在两个独立的实验中，总共发现了28个重叠的候选者。除了SCF复合体的两个核心亚单位（SKP1和CUL1）和COP9信号体复合体的三个亚单位（CSN）外，还有泛素结合途径的一个重要调节器[37]，我们注意到BACH1是氧化应激反应的调节器，也是FBXO22最近已知的底物[24]，被可重复地鉴定为THP-1细胞中FBXO22相互作用蛋白的最高丰度（图5A、 其他文件7：表S2），可以通过基于co-IP的免疫印迹法进行确认（图5B） ●●●●。在THP-1细胞中可以检测到内源性BACH1和FBXO22之间的相互作用（图5C） ●●●●。鉴于FBXO22介导氯化血红素诱导的肺癌细胞BACH1降解[24]我们评估了FBXO22是否促进MLLr AML细胞中BACH1的降解。如图所示5D、 CRISPR-CAS9去除THP-1细胞中的FBXO22后，BACH1蛋白水平显著升高。shRNA对FBXO22的敲除导致THP-1和MV4-11细胞中BACH1的稳定，伴随着BACH1最著名的靶抑制基因血红素氧化酶-1（HO-1）的减少[38]（图5E） ●●●●。同时，BACH1增加和HO-1蛋白减少也可以在Fbxo22公司-GFP缺乏⁺AML细胞（图5F） ●●●●。与之形成鲜明对比的是，FBXO22的异位表达和诱导表达强烈降低了THP-1细胞中BACH1蛋白和/或HO-1的表达（图5G、，​G、 H）。H（H）). 此外，在环己酰亚胺（CHX）处理下，FBXO22敲除的THP-1细胞（F​（Fi我g、5一） ●●●●。此外，我们分析了AML蛋白质组数据库（PXD032110）中FBXO22和BACH1蛋白表达之间的相关性[39]. 结果表明，在原发性AML患者中，FBXO22蛋白表达与BACH1蛋白水平呈负相关，FBXO2蛋白表达较高的患者BACH1蛋白质表达较低，反之亦然（图5J、，​J、 K（K）K（K）).

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图5

FBXO22促进MLLr AML细胞中BACH1的降解。A类通过LC-MS/MS鉴定THP-1细胞中FBXO22相互作用蛋白的工作流程以及两个独立实验中鉴定的28个重叠蛋白的热图分析。B类对标记FBXO22转染THP-1细胞的输入物和免疫沉淀中的指示蛋白进行Western blot分析。C类THP-1细胞内源性BACH1输入和免疫沉淀中指示蛋白的Western blot分析。D类Western blot分析三个克隆衍生的THP-1细胞系中的指示蛋白，这些细胞系中FBXO22缺失（gFBXO22#1、gFBXO2#2和gFBXO 22#3），并且有三个阴性对照（gNC）。E类感染shNC、shFBXO22#1和/或shFBXO2#2的THP-1和MV4-11细胞中指示蛋白的Western blot分析。星号表示非特定带。F类MLL-AF9中指示蛋白的Western blot分析⁺原代受者AML BM细胞注射Fbxo22型^+/+,Fbxo22公司^−/−,Scl Cre公司⁺;Fbxo22公司^{飞行/飞行}或Scl Cre公司⁻;Fbxo22公司^{飞行/飞行}AML细胞。克感染EV和标记FBXO22的THP-1细胞中指示蛋白的Western blot分析。H（H）慢病毒将编码FBXO22的Dox诱导表达系统引入THP-1。通过Dox给药指定时间对THP-1细胞中的指示蛋白进行Western blot分析。我CHX（100μg/ml）处理THP-1 gNC#1和gFBXO22#3细胞系指定时间的指示蛋白的Western blot分析。J型PDX032110数据库中AML患者FBXO22和BACH1蛋白表达水平之间的Pearson相关性。K（K）比较FBXO22之间BACH1蛋白表达水平^高和FBXO22^低PDX032110数据库中的蛋白质表达组。将样本分类为FBXO22^高和FBXO22^低蛋白质表达采用最大选择秩统计法。L（左）感染EV和标记FBXO22的THP-1 gFBXO22#3细胞中指示蛋白的Western blot分析₄Cl（10 mM）持续24小时。M（M）,N个感染EV和标记FBXO22的THP-1 gFBXO22#3细胞(M（M）)、THP-1 gNC#1和gFBXO22#3细胞(N个)用10μM MG132处理6 h，收获并提交体内泛素化分析，然后用所示抗体进行Western blot分析。误差条表示平均值±标准偏差。统计显著性由双尾非配对确定吨测试(K（K）)和P（P）显示了个值。所有实验重复至少三次，结果相似。中的数字D类–我和L（左）显示蛋白质水平的量化

为了验证FBXO22是否通过蛋白酶体途径降解BACH1，我们将Flag-FBXO22转染到FBXO22-敲除THP-1细胞中，并用蛋白酶体抑制剂MG132和CUL-RING连接酶抑制剂MLN4924以及溶酶体抑制剂brefeldin A（BFA）和NH处理₄Cl.结果表明，FBXO22的表达显著降低了BACH1蛋白，而MG132和MLN4924处理可充分阻断该蛋白，而BFA和NH处理则无法阻止该蛋白的表达₄Cl，表明FBXO22介导的BACH1降解受蛋白酶体和CRL复合物的调节（图5五十） ●●●●。此外，用Flag-FBXO22和空载体转染FBXO22敲除的THP-1细胞，然后在变性条件下用BACH1抗体进行IP。免疫印迹显示，FBXO22的表达增加了内源性BACH1纯化蛋白上观察到的泛素结合物的丰度（图5M） ●●●●。相反，FBXO22敲除降低了变性条件下THP-1细胞内内源性BACH1泛素化（图5N） ●●●●。这些结果表明，FBXO22与BACH1相互作用，并促进MLLr AML细胞中BACH1的降解。

BACH1抑制MLLr AML进展

尽管一些报告显示巴赫1和巴赫2双缺陷小鼠抑制红细胞生成和B细胞发育，同时支持稳态条件下的骨髓生成[40],巴赫1据报道，该缺陷也不会明显影响造血干细胞的再增殖能力[41]. 此外，我们在小鼠髓系前体32D细胞和Lin中引入了BACH1^–HSPC细胞，发现正常HSC中BACH1过度表达对细胞增殖和集落形成能力没有影响，也没有改变髓系、淋巴系和红系血统承诺（附加文件8：图S6A–E）。

一些研究证实，BACH1通过多种机制促进各种类型癌症的进展，如综述所述[42]. 值得注意的是，BACH1还具有抑癌作用，并通过调节HO-1的表达来控制AML细胞的生长和存活，这表明功能性上调BACH1是一种潜在的抗白血病治疗策略[43]. 与此一致，BACH1在小鼠GFP中的蛋白表达显著降低⁺林^–c-套件⁺与正常Lin相比，富集LSC^–c-套件⁺丰富的HSC（附加文件6：图S5D）。为了研究BACH1表达升高在MLLr AML细胞中的功能作用，我们将Flag-BACH1转染到MV4-11细胞中，发现BACH1过度表达显著抑制细胞克隆原性并增加细胞凋亡（附加文件8：图S6F–H）。此外，我们通过慢病毒BACH1-IRES-RFP质粒在BM-GFP中引入BACH1⁺收集AML小鼠的细胞，然后将其移植到受照小鼠体内。然后，GFP⁺招标书⁺对AML细胞进行分类，并将其注射到受致命照射的小鼠体内（附加文件8：图S6I）。Western blot分析表明BACH1在GFP中高度表达⁺招标书⁺AML细胞（图6A） ●●●●。事实上，BACH1过度表达明显降低了GFP的频率⁺招标书⁺受体小鼠PB和BM中的AML细胞（图6B、，​B、 C）。C类). 更重要的是，BACH1过度表达的BM中LSC的百分比和原始细胞的数量远低于对照组（图6D、，​D、 E），E类)同时脾脏大小和重量减少（图6F） 白血病细胞在肝脏和脾脏的浸润更少（图6G） 和延长BACH1过度表达受体小鼠的生存时间（图6H） ●●●●。进一步的机械解剖显示，BACH1过度表达导致循环细胞的百分比增加，G₀静止电池（F​（Fi我g、6一） ●●●●。此外，annexin-V的比例⁺凋亡细胞在BACH1过表达受体小鼠中显著增强（图6J） ●●●●。总的来说，这些数据表明BACH1的过度表达抑制了MLLr AML的进展。

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图6

BACH1抑制MLLr AML进展。A类分选GFP中指示蛋白的Western blot分析⁺招标书⁺AML细胞感染电动汽车和巴赫1。星号表示非特定带区。B类流式细胞仪图（左）和GFP百分比⁺招标书⁺第二受体PBMC中的细胞（右）(n个 = 6).C类,D类流式细胞仪图（左）和GFP百分比⁺招标书⁺单元格(C类)或MK(D类)来自第二接收人的BM（右，n个 = 6).E类Giemsa-Wright染色的代表性图像电动汽车和巴赫1第二次移植的BM细胞。右边显示了原始细胞频率的量化。红色和绿色箭头分别指向具有代表性的原始细胞和分化细胞。F类,克大体病理学（左）和相对重量（右）（F），苏木精-伊红染色(克)二级受体的肝脏和脾脏(n个 = 6).H（H）收件人的生存曲线电动汽车和巴赫1GFP公司⁺招标书⁺二次移植后的细胞(n个 = 7).我,J型细胞周期(我)或凋亡(J型)GFP分析⁺招标书⁺来自第二受体的BM中的细胞(n个 = 7–8). 误差条表示平均值±标准偏差。统计显著性由双尾非配对确定吨测试(B类–F类、和我,J型)或对数库测试(H（H）)、和P（P）显示了个值。所有动物实验重复至少两次，结果相似