低氧诱导小RNA的跨代表观遗传

缺氧导致基因表达和染色质修饰的代际和跨代失调

为了确定低氧表型反应背后的转录变化，我们对WT进行了RNA测序（RNA-seq）C类.挽歌暴露于常氧或缺氧，以及L4期在常氧条件下生长的三代幼稚后代（P0–F3）。我们发现在P0代中6814个基因对缺氧反应失调(图2A和​和2B）。2B型). 在这6814个基因中，2394个基因在初始F1代中代际失调，1067个基因在初始F2代中转基因失调，而279个基因在初始F3代中仍然失调(图2A,​、2B、，2B型、和S2A公司–S2D系列). 缺氧失调基因与发育调控基因的比较⁴⁴表明基因表达的差异不是由于缺氧影响发育(图S2E). 过表达分析（ORA）表明，遗传上调的基因富含组蛋白结合、RNA结合和转录后基因调控相关的基因。相反，参与氧结合、化学感觉行为和神经肽信号传导的基因在遗传性下调的基因中富集(图2C和S2F（平方英尺）). 这一结果，结合以往对其他跨代表观遗传范式的研究，^{5,13,19,25,45–48}促使我们关注组蛋白修饰和小RNA通路的调节器。我们发现参与组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）甲基化的基因(灰烬-2,设置-17、和wdr-5.1型)和H3K9甲基化(遇见-2,设置-25、和设置-32）在P0低氧处理的亲本中上调，但在F1和F2子代中恢复到正常的表达水平(图2D). 有趣的是，H3K27me3脱甲基酶(jmjd-3.1型和jmjd-3.2标准)和小RNA精氨酸hrde-1型通过P0、F1和F2代保留基因表达的跨代失调(图2D和​和2E）。第二版). 由于酶的基因表达并不一定意味着酶功能的失调，我们对六种不同的组蛋白标记进行了western blot，包括两种典型的与染色质可及性增加相关的修饰（H3K4me3和H3K4me1）以及通常与染色质可及性降低相关的四种修饰（H3K9me2、H3K9 me3、H3k23 me3和H3K27me3）。我们发现H3K4me3、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3的甲基化标记在全球范围内增加，而亲本P0代中H3K4me1和H3K23me3的增加趋势不显著(图2F,S2G公司、和S2H公司). 值得注意的是，虽然H3K4me3在F1代基本恢复到正常氧水平，但我们发现H3K9甲基化和H3K27me3的遗传增加(图2F和S2G公司). 我们检测的所有组蛋白修饰在F2代时恢复到正常氧水平(图2F,S2G公司、和S2H公司). 总的来说，这些结果表明，一些组蛋白修饰在缺氧反应中整体上增加，而典型的抑制性组蛋白修饰H3K27me3、H3K9me2和H3K9 me3在原始F1代间升高。有趣的是，S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成酶上调，sams-3型和样品-4,⁴⁹负责产生通用甲基供体SAM的酶，⁵⁰对父母P0代缺氧的反应(图S2I)这可能有助于解释组蛋白甲基化不加区分地增加的原因。SAM合成酶的上调可与组蛋白去甲基酶的下调和氧的减少协同作用，组蛋白赖氨酸去甲基酶可检测到氧的减少，^37,51导致P0代组蛋白甲基化增加。基因表达和组蛋白修饰的这些变化与代际和跨代缺氧表型相关，增加了小RNA和组蛋白调节机制的变化可能调节观察到的遗传性缺氧表型。

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图2。

低氧对幼稚常氧饲养后代的基因表达和组蛋白甲基化产生代际和跨代影响

（A） 转录物的一个子集在对父母缺氧暴露的反应中被跨代和转基因错误调节。热图显示日志₂各代样本的预期计数的CPM（百万计数）。失调基因列表在表S2.

（B） 维恩图揭示了对父母P0低氧暴露反应的失调基因亚群，这些基因亚群是代际（F1）失调或代际（F2）失调，尽管是在常氧条件下饲养的。

（C） 根据Benjamini-Hochberg多重测试调整评估，遗传失调基因的基因本体分析显示RNA和组蛋白结合基因上调，氧结合和化学感觉行为基因下调，上下面板的错误发现率（FDR）<0.05。

（D） 热图关注参与小RNA调节和染色质调节的基因的跨代表达，揭示了代际和跨代错误调节的酶。这些值用对数（CPM+1）进行标准化，并表示为每代人缺氧和常压之间的倍数变化。

（E） 基因组浏览器快照显示跨代增长hrde-1型表达和代际减少jmjd-3.2标准表达对父母缺氧暴露的反应。

（F） H3K4me3、H3K9me2、H3K9me3和H3K27me3的组蛋白甲基化在亲代或代际缺氧反应中增加，这是通过对三个重复生物中进行的三个独立的western blotting实验进行量化评估的。每列代表平均值±SEM。

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，^纳秒经非配对t检验，p>0.05。一个实验的代表性western blot显示在图S2G。另请参阅图S2和表S2.

低氧诱导的跨代生育缺陷的遗传依赖于精氨酸HRDE-1和抑制性染色质修饰酶

由于表观遗传酶的失调和对祖先缺氧暴露的反应(图2C–2楼)接下来，我们测试了这些失调的酶是否是跨代生育表型所必需的。因此，我们使用秀丽线虫关键的表观遗传机制成分发生突变。我们发现H3K4单和二甲基转移酶的突变设置-17和设置-30,⁴⁵与WT蠕虫一样，由于父母缺氧，生育能力持续下降三代，这表明这些酶和H3K4me1/me2不是跨代生育缺陷所必需的(图3A和​和3B）。3B公司). 我们确定了父母一代初始低氧反应所需的六个基因，因此与检测它们在表观遗传表型传递中的作用不一致。这六个基因包括dsRNA转运蛋白，sid-1号机组;⁵²H3K23me3甲基转移酶设置-32;³²小RNA argonautes西米-2⁵³和编号-2;⁵⁴H3K27me3脱甲基酶之一，jmjd-3.1型;⁵⁵和假定的蛋氨酸合成酶金属-1(图3C–第三方和S3A系列–S3C系列). 我们还发现五个基因在暴露于低氧环境下的亲代中表现出生育缺陷，但未能将这种降低的生育表型传递给单纯的常氧饲养的F1和F2后代(图3F,​、3G、，3克、和S3E系列–S3G系列). 表观遗传所必需的基因包括一个小RNA argonautehrde-1型¹⁹(图3F); 内在无序蛋白质兆欧-3通过RNA结合参与相分离⁵⁶(图S3E); 假定的H3K9三甲基转移酶设置-25⁴⁹(图S3F); EZH2同源物和推测的H3K27三甲基转移酶网格-2⁵⁷(图S3G); 和假定的H3K27me3脱甲基酶jmjd-3.2标准⁵⁸(图3G). 我们发现了hrde-1型也是可遗传的脂质减少所必需的(图S3I). 总之，这些发现指向小RNA和抑制性组蛋白修饰(图3H)对于建立和向幼稚后代传递非遗传性缺氧反应是必要的。

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图3。

跨代生育缺陷的遗传依赖于精氨酸HRDE-1和抑制性染色质修饰酶

（A） WT蠕虫表现出对亲代（P0）接触0.1%O的生育能力的跨代下降₂在L4阶段持续16小时。该面板如所示图1E为了便于比较，此处显示和。

（B） H3K4me1/me2对于低氧诱导的生育缺陷的遗传是不必要的，因为第17集；套-30双突变蠕虫的行为类似于WT蠕虫。

（C–E）sid-1号机组（C） ，设置-32（D） 、和金属-1（E） 突变蠕虫对低氧的反应表明，亲本P0代的生育能力没有降低。

（F和G）hrde-1型（F） 和jmjd-3.2标准（G） 突变蠕虫在低氧条件下表现出亲本P0代的生育能力下降，但未能将此表型传递给后代。每个点代表一个单独的实验，用10条蠕虫进行三次*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，^纳秒经非配对t检验，p>0.05。每列代表平均值±SEM。

（H） 针对低氧诱导生育表型筛选的遗传突变体表显示了对跨代传播不必要的基因(设置-17和套-30)，是父母代低氧反应的初始需要(jmjd-3.1、nrde-2、sid-1、set-32、sago-2、metr-1、和F57G12.1型)，对父母生育率降低是不必要的，但需要将降低的生育率传递给幼稚的常氧饲养后代(hrde-1、jmjd-3.2、mes-2^+/−,兆欧-3，组25、和林-41).

图中未显示的突变显示在图S3A–S3H系列.

缺氧诱导22G-RNA的遗传性失调

因为我们观察到argonautehrde-1型是对缺氧反应的跨代升高，并且是跨代缺氧表型所必需的，我们接下来检查小RNA本身是否足以重演缺氧表型。我们将WT蠕虫暴露于常氧或缺氧条件下，从暴露的蠕虫中提取小RNA（<200 nt）和大RNA（>200 nt），然后将幼稚蠕虫浸泡在这些提取的RNA中，并进行蛋氨酸分析(图4A). 虽然将幼稚蠕虫浸泡在从低氧处理蠕虫中提取的大RNA中对生育率没有影响，但将幼年蠕虫浸泡到从低氧治疗蠕虫中萃取的小RNA中足以降低生育率(图4B)，增加了小RNA从低氧暴露的父母传给后代以调节可遗传的生育缺陷的可能性。因为hrde-1型是低氧诱导的遗传性生育缺陷所必需的(图3F)并且将提取的小RNA喂给幼稚的蠕虫足以重演降低的生育率，我们接下来检查是否hrde-1型是小RNA诱导的生育能力降低和对缺氧反应的基因表达的可遗传失调所必需的。Hrde-1号航站楼突变蠕虫对从低氧暴露的野生蠕虫中提取的小RNA（sRNAs）的摄食没有表现出降低生育能力的反应(图S4A)，建议hrde-1型是小RNA诱导的生育率降低所必需的。尽管hrde-1型大多数低氧调节基因表达变化都需要，在P0代中，一个子集（475/6814）的基因表现出类似的上调（红框：60个基因）和下调（蓝框：415个基因）hrde-1型突变蠕虫，如WT蠕虫对缺氧的反应(图4C). 然而，这些失调的基因未能被传递给幼稚的F1hrde-1型后代，因为他们是WT蠕虫(图4C). 这一发现表明这一基因亚群对生育表型很重要，并表明hrde-1型除了传递可遗传的生育表型外，还需要传递可遗传基因表达的失调，以应对缺氧。

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图4。

小RNA足以传递低氧信号，并在父母低氧时发生跨代失调

（A） 低氧暴露计划、RNA提取和向幼稚常氧饲养的蠕虫喂食特定类别的RNA。

（B） 喂食从低氧处理过的蠕虫中提取的小RNA（<200 nt），而不是大RNA（>200 nt）足以降低正常氧饲养的蠕虫的繁殖能力。每个彩色编码点代表一个单独的实验，每10条蠕虫分三次进行**p<0.01，^纳秒经非配对t检验，p>0.05。每一列代表一式三份进行的四个独立实验的平均值±SEM。

（C） 父母缺氧时基因表达失调的传递依赖于hrde-1型如WT和hrde-1型变异蠕虫。野生型蠕虫的基因表达也显示在图2A。标签和比例尺显示在（D）的底部面板。

（D） 22G-RNAs对父母缺氧反应的失调传递依赖于hrde-1型如WT和hrde-1型变异蠕虫。

（E和F）文氏图显示可遗传的上调基因在csr-1型-结合靶点（E），而遗传下调的基因在hrde-1型-绑定目标（F）。

（G） 缺氧诱导的22G-RNA及其靶mRNA的失调依赖于hrde-1型。此散点图表示日志₂WT蠕虫（绿点）中22G-RNA及其靶mRNA（每个由一个圆点表示）相对于常氧的缺氧倍数变化hrde-1型变异蠕虫（紫色圆点）。根据是否报告目标绑定到CSR-1（圆圈）或蠕虫特有的参数，进一步细分目标(货车)（三角形）。

（H） 22G-RNA的核密度图显示，一小部分22G-RNA继续表现出对父母缺氧的跨代调节障碍，22G-RNA调节障碍依赖于hrde-1。.

（一）F44E5.4/5型显示了hrde-1型-父母缺氧导致基因表达依赖性下降，而内源性siRNAs针对F44E5.4/5型表现出对父母缺氧反应的表达增加。这是RNA-seq和小RNA-seq的代表性基因组浏览器快照，以显示22G-RNAs和靶mRNAs之间的相互关系以及hrde-1型这些RNA的依赖性。

另请参见图S4.

P颗粒是位于生殖系细胞核附近的非膜结合RNA和蛋白质缩合物秀丽线虫.⁵⁹这些颗粒被认为通过在mRNA监测中发挥作用来调节生殖细胞分化，也被认为有可能隔绝并跨代传递RNA，以维持生殖系基因表达的记忆。^59–62因此，我们检查了转录本是否包含在P颗粒中⁶³存在于一组可遗传的低氧反应失调基因中。我们发现约30%的P颗粒转录物（198/660转录物）存在于低氧适宜上调基因中，而少数（约1.7%，11/660转录）存在于低氧适宜下调基因中(图S4B). 为了研究P颗粒本身是否因缺氧而失调，我们解剖了正常氧和低氧处理的蠕虫及其正常氧饲养后代的生殖系，并使用第1页：：绿色荧光蛋白转基因菌株。⁴³我们发现，正如之前报道的那样，⁶⁴在减数分裂的二倍体和终末期，P颗粒从细胞核中分离出来，并在正常氧条件下扩散到未受精卵母细胞的细胞质中。令人惊讶的是，在缺氧条件下，P颗粒在二倍体和终变期仍然与细胞核紧密结合(图S4C; ~低氧时保持85%，常压时约15%）。虽然这种延长的磷颗粒保留在世代间减少，但在F3代恢复到基础水平之前，F1代（约50%）和F2代（38%）磷颗粒保留增加(图S4C). 除了P颗粒的时间滞留增加外，与卵母细胞细胞核相关的P颗粒数量也有可量化的增加(图S4C; P0:p<0.001，F1:p<0.05，F2:^纳秒p=0.14和F3:^纳秒p=0.33，其中ns表示不显著）。总之，这些结果表明，P颗粒在减数分裂生殖系的细胞核附近保留了相同的世代数，即基因表达异常和缺氧导致的生育率降低，增加延长P颗粒滞留时间的可能性，有助于特异性RNA在低氧条件下传递给后代。

因为hrde-1型是跨代生育率降低和基因表达失调对低氧反应所必需的，并且由于随着跨代生育能力降低而追踪的P颗粒滞留时间延长，我们决定研究异常小RNA是如何在低氧反应中失调的。我们在野生型和hrde-1型P0暴露于缺氧后，P0、F1、F2和F3代的突变蠕虫。我们发现我们的小RNA-seq在P0中hrde-1型常氧条件下的突变与已发表的数据密切相关(图S4D).⁴⁸如前所示，⁴⁸针对删除hrde-1型，存在全球异常小RNA表达(图4D). 因为低氧处理过的蠕虫的小RNA足以诱导生育缺陷，所以我们对失调的小RNA针对哪类基因感兴趣。我们观察到microRNA和microRNA靶点对父母缺氧的跨代协调失调。为了广泛研究微RNA靶基因的遗传性错误调控过程，我们对低氧诱导的微RNA靶进行了基因本体（GO）分析。这些可遗传失调的缺氧微小RNA靶点表现出对内吞作用、细胞呼吸、脂肪酸氧化和囊泡介导的转运的富集，提高显示可遗传变化的微RNA及其靶点可能直接调节代谢性低氧敏感途径和脂质合成的可能性(图S4E和S4F系列). 父母缺氧导致microRNA和microRNA靶点跨代失调的例子包括mir-253-3p和mir-39-3p型和他们假定的目标F57G12.1型⁶⁵和林-41⁶⁶(图S4G和S4H系列). 检查的预测目标时mir-237型,mir-253型以及代际和跨代失调的siRNAs，我们发现这些小RNAs的大多数靶点在父母缺氧治疗后跨代下调(图S5I). 我们进一步发现，代际或转基因失调的微小RNA的两个靶点，米尔-253-3便士和米尔-39-3便士，是对缺氧的初始生育反应所必需的F57G12.1型(图S3D)或者将生育缺陷遗传给后代林-41(图S3H). 这些结果表明，不仅调控不当的microRNAs，而且其下游靶标可能代表了一个缺氧反应网络，促进暴露代和幼稚常氧饲养后代的适应性反应。总之，这些数据表明，特定小RNA的遗传性失调可以诱导特定靶基因的遗传性失衡。

接下来，我们重点研究了小RNA，它们在WT蠕虫中因缺氧而发生遗传性失调，在P0代中表现出类似的失调hrde-1型变异蠕虫。我们鉴定了一小部分RNA，它们具有强烈的5′鸟嘌呤核苷残基倾向，长度为22 nt（22G-RNAs）⁶⁷除了22G-RNA的另一个亚群受到遗传性下调（蓝色框：148 22G-RNA）外，这些基因是遗传性上调的（红色框：86 22G-RNA(图4D). WT蠕虫中的一部分低氧诱导的可遗传失调22G-RNA在hrde-1型亲本P0代中的突变蠕虫（17/86上调，80/148下调；p<0.05），但在hrde-1型后代(图4D). 22G-RNA与不同的argonautes结合时会沉默或激活其靶基因。²⁴与HRDE-1结合促进转录沉默，¹⁹而与染色体分离和RNAi缺陷（CSR-1）argonaute蛋白结合可促进新生mRNA转录并激活基因表达。²¹低氧转代谢物失调基因与HRDE-1结合基因的比较¹⁹和CSR-1²⁰结果表明，低氧转基因诱导基因富集了CSR-1结合的小RNA靶点(图4E; 526/1068个低氧诱导的遗传上调基因是CSR-1靶点，59/1068个遗传上调基因为HRDE-1靶点；超几何概率p=0）。相反，低氧转基因下调基因表现出对HRDE-1-结合的小RNA靶点的偏好(图4F; 129/1326个低氧遗传下调基因为HRDE-1靶点，66/1326基因为CSR-1靶点；p=6当量⁻⁴超几何概率）。所有由低氧触发的22G-RNA，之前被证明与蠕虫特异性argonautes（WAGOs）或CSR-1结合，²⁰以及它们的靶mRNAs，在缺氧反应中表现出减少的变化hrde-1型变异蠕虫(图4G). 大多数22G-RNA上调hrde-1型-P0代低氧反应的依赖性方式，在幼稚常氧饲养后代中被重置(图4H). 然而，一些22G-RNA是遗传上调的，例如内源性siRNAF44E5.4/5型(图4I). 验证内源性siRNA的可遗传增加F44E5.4/5型通过另一种方法，我们使用靶向22G-RNA区域的探针进行了northern杂交。我们发现F44E5.4/5型低氧处理的亲本或喂食低氧处理蠕虫提取的小RNA的蠕虫P0代和F1代中的22G-RNA(图S4J). 有趣的是，尽管内源性siRNA有可遗传的增加F44E5.4/5型，再加上可遗传的F44E5.4/5型对缺氧反应的转录物(图4I).F44E5.4/5型是一个热休克蛋白-70-像热休克蛋白，通常作为蛋白质伴侣。有趣的是，F44E5.4/5型已经证明在热冲击下代际下调，⁶⁸这表明这种热休克蛋白可能特别容易受到代际失调的影响。综上所述，我们发现内源性siRNAs在低氧反应中存在HRDE-1依赖性失调，这增加了这些内源性siRNA可能在父母向后代传递低氧记忆中发挥作用的可能性。

实验模型和受试者详细信息

方法详细信息

我们感谢S.Strome、D.Updike和Greer实验室成员的讨论。我们感谢V.Ambros对手稿的批判性阅读。我们感谢A.Grishok、D.Updike、F.Slack和由NIH研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的Caenorhabditis遗传学中心秀丽线虫菌株。S.Y.W.得到了克劳彻基金会和查尔斯·金研究金的支持。Z.K.O.由T32-HD007466支持。这项工作得到了NIH拨款的支持（R00AG043550和发给E.L.G.的DP2AG055947）。