Osteogenic differentiation and proliferation potentials of human bone marrow and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the 3D-printed hydroxyapatite scaffolds

Ladda Meesuk; Jintamai Suwanprateeb; Faungchat Thammarakcharoen; Chairat Tantrawatpan; Pakpoom Kheolamai; Iyapa Palang; Duangrat Tantikanlayaporn; Sirikul Manochantr

doi:10.1038/s41598-022-24160-2

科学代表。2022; 12: 19509.

2022年11月14日在线发布。数字对象标识：10.1038/s41598-022-24160-2

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PMID：36376498

人骨髓和脐带源间充质干细胞在三维羟基磷灰石支架上的成骨分化和增殖潜能

拉达·米苏克，¹ Jintamai Suwanprateb公司，² Faungchat Thammarakcharoen公司，² Tantrawatpan主席，^1,^三 Pakpoom Kheolamai公司，^1,^三伊亚帕·帕朗，¹ Duangrat Tantikanlayaporn公司，^1,^三和Sirikul庄园^1,^三

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数据可用性声明: 本研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是一种很有前途的骨修复候选细胞。然而，骨髓间充质干细胞注射到骨损伤部位的维持仍然效率低下。一种潜在的方法是开发一种类骨平台，将MSC纳入生物相容性3D支架中，以促进骨移植到所需位置。骨组织工程是一个多步骤的过程，需要优化几个变量，包括细胞来源、成骨刺激因子和支架特性。本研究旨在评估MSCs在两种3D-涂层羟基磷灰石（包括3D-喷涂HA和仿生磷酸钙涂层3D-涂抹HA）上的增殖和成骨分化潜能。来自骨髓（BM-MSC）和脐带（UC-MSC）的MSC培养在3D-染色HA和涂层3D-着色HA上。扫描电子显微镜和免疫荧光染色用于检测MSCs的特征和与支架的附着。此外，监测细胞增殖，并使用碱性磷酸酶（ALP）活性和成骨基因表达评估细胞分化为成骨细胞的能力。BM-MSC和UC-MSC附着在具有纺锤形形态的塑料培养板上，显示出与MSCs特征一致的免疫表型。两种MSC均能在3D-printed HA和涂层3D-pritted HA支架上附着和存活。与对照组相比，在这些支架上培养的MSC显示出足够的成骨分化能力，这可以通过增加ALP活性以及成骨基因和蛋白的表达来证明。有趣的是，与在3D-染色HA上培养的骨髓间充质干细胞相比，在涂层3D-着色HA上生长的骨髓间质干细胞表现出更高的ALP活性和成骨基因表达。这一发现表明，在3D-染色HA和涂层3D-涂层HA支架上培养的BM-MSC和UC-MSC能够增殖并分化为成骨细胞。因此，HA支架可以为骨组织工程中MSCs的三维培养提供一个合适而有利的环境。此外，磷酸八钙仿生涂层可以提高骨再生支架的生物相容性。

主题术语：细胞生物学、分子生物学、干细胞

介绍

以骨功能受损为特征的骨疾病，如骨关节炎、骨髓炎和骨质疏松症，在全球范围内的发病率急剧上升，尤其是在老年人中。骨组织疾病是骨科最常见的问题之一^¹具有重大临床和经济影响^²尽管有先进的治疗方案，但骨折治疗失败导致骨延迟愈合甚至骨不愈合的患者数量仍在继续增加。此外，干扰骨折愈合可能会导致严重的骨缺损，需要进行骨置换^{^三}自体骨移植通常用于治疗显著的骨缺损^⁴虽然自体骨移植是严重骨缺损的首选治疗方法，但它也有一些缺点，包括供应有限、牙体发病率高以及对患者的额外伤害^⁵.

另一方面，尽管同种异体骨移植被广泛使用，但它们具有感染性疾病传播和宿主免疫系统反应排斥的巨大风险^⁶为了克服这些限制，使用合成骨移植的替代方法对于降低自体骨移植和同种异体骨移植的风险和成本至关重要^⁷因此，骨组织工程有望开发合成骨移植物^⁶然而，这是一个复杂的动态过程，需要人工构建的细胞外基质支架的协同作用，选择合适的干细胞，并结合成骨刺激因子^⁸人工骨基质的生物材料通常是多孔的，允许三维细胞粘附和增殖，能够填充骨缺损，同时在骨修复和再生过程中提供机械支持^⁹.骨组织工程生物材料必须显示某些特征，包括生物相容性、骨诱导和骨传导，才能在临床上安全有效^¹⁰.

许多合成和天然聚合物，包括羟基磷灰石、胶原蛋白、壳聚糖和肽水凝胶，被用来构建支架^¹羟基磷灰石（HA）是一种优良的骨再生支架材料，因为它是天然骨中的主要矿物成分，更重要的是，它具有生物相容性^¹¹此外，它还具有骨传导性和骨诱导性，如移植区的成骨细胞能够在支架上迁移，并随着时间的推移逐渐用新骨替换，以及在体内促进新骨形成的能力所示^¹²HA已被用于在临床环境中构建骨移植物^¹³然而，传统HA支架是使用陶瓷技术制成所需形状的，需要高温烧结以烧毁粘合剂并使结构致密。因此，高结晶度和大晶粒限制了支架材料在体内的吸收，从而阻碍了其与宿主天然骨的整合^{¹⁴，¹⁵}为了避免这一局限性，我们的团队开发了三维打印羟基磷灰石（3D-printed HA）作为一种新型骨移植材料^¹⁶在我们的研究中，将新型粘合剂喷射技术与低温磷化相结合，制备出结晶度低的羟基磷灰石和与天然骨中天然羟基磷磷灰石晶体结构非常相似的纳米晶体。此外，我们的3D-printed HA还具有高孔隙率和液体粘附能力，对于促进细胞粘附和其他生物活性至关重要。3D打印还将为定制具有定制形状和结构的三维磷酸钙支架或骨移植提供一种新方法。

此外，人们认为这种3D-染色HA的生物活性可以进一步提高。磷酸八钙（OCP，Ca）仿生涂层₈H（H）₂（采购订单₄)₆·5小时₂O）我们小组最近还开发了晶体，它模拟了天然骨中通过加速磷酸钙溶液（ACS）发生的沉积和矿化过程^{¹⁷–²⁰}因此，选择OCP晶体覆盖3D涂层HA支架（涂层3D涂层HA）^²⁰与单独的羟基磷灰石相比，其具有更好的吸收性、骨传导性、骨诱导性和对生物活性成骨刺激因子的结合能力，从而增强生物活性^²¹–²⁴。3D涂层HA和涂层3D涂层HA都已经具有成骨细胞反应的特征，并显示出良好的结果。然而，与间充质干细胞的相互作用尚未进行。

间充质干细胞（MSCs）是一种多能干细胞，可以分化为各种中胚层细胞类型。它们在骨骼建模、重塑和修复中起着关键作用^²⁵MSC已在骨科和再生医学中显示出治疗用途^{²⁶，²⁷}然而，骨髓间充质干细胞移植修复骨损伤是无效的，因为细胞无法定位到损伤部位；因此，使用支架在靶点维持移植MSC至关重要。最近，来自骨髓的MSCs（BM-MSC）在三维支架上培养用于修复骨组织。然而，骨髓基质干细胞的使用受到各种因素的限制，包括骨髓采集的侵入性程序和骨髓中MSC数量有限，尤其是在老年人中^²⁸从骨髓中获得的MSC数量始终低于骨修复所需的临界细胞数量^²⁶.

此外，随着年龄的增长，细胞的可用性和成骨分化的潜能都会降低，导致老年人骨组织修复不足^²⁹此外，衰老的MSCs及其子代在旧骨髓中积累^³⁰–³²或者，MSC可以从其他组织获得，包括脂肪组织、胎盘和脐带^³³–³⁷.

为了构建质量更好的骨移植，我们将我们的3D-printed HA支架与脐带间充质干细胞（UC-MSC）相结合，脐带间质干细胞可以通过非侵入性程序大量获取，并且被认为是比骨髓基质干细胞更合适的MSC来源^{³⁵，³⁸，³⁹}本研究旨在评估仿生磷酸钙涂层对MSC在三维羟基磷灰石支架上的附着、增殖和成骨分化的影响。使用两种类型的MSC进行测试，即BM-MSC和UC-MSC。因此，本研究提供了关于人MSCs在3D-染色HA和涂层3D-着色HA上生长和成骨分化的新的有价值的信息，可用于开发更好的骨组织工程支架。

材料和方法

三维涂层羟基磷灰石支架的制备

如前所述，制备了3D涂层羟基磷灰石支架（3D-涂层HA）^¹⁶首先，将硫酸钙基粉末（Visijet PXL，3D Systems，美国）装入粉末基三维打印机（PROJET 160，3D Systems，美国）使用商业液体粘结剂（Visijet PXL clear，3D Systems，USA）打印直径为5 mm、厚度为2 mm的闭合圆盘状试样，试样中没有任何设计的孔道。关于打印参数，将层厚度设置为0.1 mm，并将圆盘样品定向为Z方向的厚度。接下来，使用溶解-沉淀原理将打印样品在100°C的1 M磷酸氢二钠溶液（美国西格玛-奥尔德里奇）中浸泡24小时，从而将其相变为羟基磷灰石。然后，用蒸馏水清洗支架，烘干，并使用环氧乙烷消毒器消毒。

仿生涂层三维羟基磷灰石支架

通过将制备的3D-羟基磷灰石浸泡在含有154 mM Na的加速磷酸钙溶液（ACS）中，制备了仿生涂层3D-涂层羟基磷磷灰石支架（涂层3D--涂层HA）⁺，201.7 mM氯⁻，3.87 mM钙²⁺和2.32 mM HPO₄²⁻; 37°C下pH7.3持续8小时^²⁰.然后轻轻清洁涂层HA，在室温下干燥过夜，并使用环氧乙烷灭菌器灭菌。

材料特性

使用扫描电子显微镜（日本JEOL JSM 7800 Prime）观察制作样品的微观结构。孔隙度和孔径由汞孔隙度计（AutoPore V 9600，Micromeritics Instrument Cooperation，USA）在20–21°C下使用0.10至61000 psia的压力测定。接下来，使用X射线衍射仪（XRD，Rigaku TTRAX III，USA）在300 mA和50 kV条件下使用铜源Kα线聚焦辐射（λ=0.15406 nm）检查样品的相组成。测量在2–42°2θ下进行，扫描速度为每分钟3°，步进角为0.02°。然后使用粉末衍射文件（PDF）分析XRD图的相组成，从而可以搜索ICDD数据库产品。然后使用Rietveld细化方法（JADE软件）计算相含量百分比。

MSC分离培养

本研究得到了泰国第一大学医学院人类伦理委员会的批准。从5名健康捐赠者（27岁男性、46岁男性、26岁女性、42岁女性和53岁女性）处获得人类骨髓。对于每个有代表性的捐赠者，用1X磷酸盐缓冲液（PBS）将10 ml骨髓以1:1的比例稀释，并轻轻置于IsoPrep（挪威罗宾斯科学公司）上。从间期层回收单核细胞（MNC），并在100xg密度梯度离心30分钟后用PBS洗涤两次（Hettich，Universal 320 K，USA）。然后以1×10的密度培养细胞⁵细胞/厘米²25厘米²在补充有10%胎牛血清（FBS；Hyclone，美国）、2 mM Glutamax™（Gibco/Termo Fisher Scientific，美国），100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的完整DMEM培养基中的组织培养瓶（Costa，Corning，美国）。在含有5%二氧化碳（CO）的湿化组织培养箱中，培养物保持在37°C₂). 在第3天，去除非粘附的MNC，并添加新鲜培养基。

在获得母亲的书面知情同意后，从健康的足月新生儿身上获得人脐带。（产妇年龄分别为25岁、29岁、30岁、34岁和36岁）。对于每个有代表性的供体，在正常分娩后从孕妇处获得脐带后，用PBS彻底清洗脐带（长度2–4 cm）。取下脐带血管后，将脐带组织切成约1-2 mm的小块^三随后，用PBS清洗组织两次，并用0.5%胰蛋白酶-EDTA（美国Gibco/Termo Fisher Scientific公司）在37°C下孵育3小时，持续摇晃以部分消化脐带组织并释放细胞。为了中和胰蛋白酶，添加添加10%FBS的10 ml培养基。离心后，将上清液丢弃，并将部分消化的组织转移至25cm²含有5 ml完整DMEM培养基的培养瓶。培养物保持在5%的CO中₂培养箱，每3天更换一次培养基。用倒置光学显微镜（日本尼康ECLIPSE Ts2R）仔细检查烧瓶，观察外生长细胞并检测细菌或真菌污染。

从骨髓和脐带中分离出的具有成纤维细胞形态的贴壁细胞标记为第0代（P0）。为了进一步扩增，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA对达到80–90%融合的P0细胞进行继代培养，并以1×10的密度重新镀膜⁴细胞/厘米²在随后的实验中，检查了每个代表性供体的MSC，并将数据作为每个代表性供者的平均值进行分析。

免疫表型特征

评估每个供体细胞中细胞表面标记的表达。首先，用0.25%胰蛋白酶-EDTA去除第3-5代细胞。然后，5×10⁵将MSCs重新悬浮在50µl PBS中，并在4°C下用5µl异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）结合的抗CD34抗体（Biolegend，美国）、CD45抗体（Bielegend，美国）、CD73抗体（Bioregend，USA）、CD90抗体（Biodegend，US）和CD105抗体（Bionegend，美利坚合众国）处理30分钟。用PBS清洗后，将细胞固定在PBS中1%的多聚甲醛中。约2×10⁴标记细胞通过流式细胞仪（FACScalibur™，Becton Dickinson，美国）获得。使用CellQuest®（美国Becton Dickinson）对数据进行分析。

脂肪分化试验

将每个供体第3-5代的MSC进行胰蛋白酶化，并在35mm的DMEM培养基中培养²盘子（Costar，科宁，美国），密度为5×10^三细胞/厘米²隔夜评估其脂肪分化潜能。用PBS洗涤后，添加成脂诱导培养基[补充有0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤（Sigma-Aldrich，美国）、1μM地塞米松（Sigma-Aldrich，美国）和10μM胰岛素（Sigma-Aldrick，美国）的完整DMEM培养基，100μM吲哚美辛（Sigma-Aldrich）]。以完全DMEM培养基中培养的MSCs作为对照。细胞保持在5%的CO中₂培养箱在37°C下培养28天。然后，在室温下用37%甲醛的蒸汽将细胞固定10分钟。最后，在60%异丙醇中用0.3%油红O（美国Sigma-Aldrich）染色20分钟后，在倒置显微镜下检查细胞。

成骨分化试验

为了研究骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能，将第3–5代每个供体的骨髓间充素干细胞进行胰蛋白酶化，并与完整的DMEM培养基在35mm的培养基中培养²密度为5×10的盘子^三细胞/厘米²一夜之间。随后，用PBS清洗细胞，并添加成骨诱导培养基[补充有100 nM地塞米松、10 mMβ-甘油磷酸（Sigma-Aldrich，美国）和50µg/ml抗坏血酸（Sigma-Aldrich，美国）的完整DMEM培养基]。用完全DMEM培养基培养的细胞作为对照。培养28天后，用4%多聚甲醛在4℃下固定20分钟。接下来，在室温下用40 mM茜素红S（美国Sigma-Aldrich）对固定细胞染色30分钟，并在倒置显微镜下观察。

软骨分化试验

为了检测分离的MSCs的软骨分化潜能，将每个供体的MSCs胰蛋白酶化并以3×10的密度进行电镀⁶细胞/厘米²在包含完整DMEM介质的96 W U形底板（Jet Biofil，中国）中。细胞在37°C和5%CO的增湿大气中培养₂一夜之间。取出培养基后，添加完整的MSCgo™软骨生成XF培养基（德国Sartorius）。每3天更换一次培养基，并将培养物保持在37°C，在含5%CO的湿润环境中₂持续14天。用10%福尔马林溶液固定球形块，并在室温下用1%Alcian Blue在0.1 N HCl中染色过夜。去除染色溶液，用0.1 N HCl清洗球状物3次。在倒置显微镜下检查染色的肿块。在完整的DMEM培养基中培养的MSC作为对照，并以与在软骨分化培养基中培育的MSC相同的方式进行处理。

MSC增长评估

通过胰酶消化培养扩增的MSCs（第3-5代）并将其重新涂布在24孔细胞培养板（美国科宁Costar）上，该培养板含有1ml完整DMEM培养基，5×10，评估BM-MSC和UC-MSC的生长特性²细胞/厘米².细胞在37°C的5%CO中保持₂培养箱。每隔2天，用血细胞仪对细胞进行计数。为了生成生长曲线，计算每天三倍细胞计数的平均值，并根据培养时间绘制。

为了测量MSCs的生长动力学，将第2-8代细胞接种到密度为5×10的24孔细胞培养板上²细胞/厘米².每48小时对每一代细胞进行计数，根据以下公式计算倍增时间：

人口 加倍 时间= \frac{单元格 文化 时间 (小时)}{日志 (\frac{编号 属于 细胞 在 这个 结束}{编号 属于 细胞 在 白天 0}) \times 3.31}

肌动蛋白丝染色

对于种子细胞，用PBS将无菌的3D-printed HA/涂层的3D-prented HA清洗两次，用完整的DMEM培养基培养，最后放入96个培养皿中（美国科宁科斯塔）。MSC（2×10⁴细胞）接种在5mm支架表面。培养物保存在37°C、5%CO的完整DMEM培养基中₂孵化器。为了评估细胞在支架上的附着，使用Phalloidin iFluor 488染色（Abcam，UK）观察肌动蛋白丝。简单地说，样品用PBS清洗3次，并在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟。仔细抽吸固定液后，用PBS将样品清洗成三份。随后，在室温下用0.1%Triton X-100（美国USB公司）渗透细胞5分钟，用1%BSA封闭细胞60分钟。然后，在室温下用用1%BSA稀释的Phalloidin-ifuoro 488试剂在PBS中以1:1000的稀释度培养细胞60分钟。接下来，用PBS轻轻冲洗细胞3次，以去除多余的卵磷脂。最后，用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色观察细胞核（Sigma-Aldrich，美国）。样品在共聚焦显微镜（共聚焦显微镜C1系统；日本尼康）下观察，激发波长为493 nm，发射波长为517 nm。

细胞形态观察

为了检查种子细胞的形态，MSCs（2×10⁴细胞）接种在含有完整DMEM培养基或成骨分化培养基的96周板中的5 mm支架表面。细胞保存在含有5%CO的加湿培养箱中₂37°C时。每3天更换一次培养基。第28天，用PBS清洗样品两次，并用4%戊二醛和2%多聚甲醛在4°C的0.1 M Millonig缓冲液pH7.2中固定60分钟。然后，用0.1 M Millonig缓冲液清洗样品3次，然后在0.1 M Milronig缓冲液中的1%四氧化锇中固定30分钟。然后，将样品在0.1 M Millonig的缓冲液中重新冲洗，并用50%、70%、90%和95%的系列浓度乙醇连续脱水10分钟。最后，样品用100%乙醇脱水15分钟，共3次，然后用液态CO进行临界点干燥₂样品在扫描电子显微镜观察之前被镀金（日本JEOL JSM 7800 Prime）。

细胞增殖评估

为了评估BM-MSC和UC-MSC对支架的亲和力，根据制造商的方案，使用PrestoBlue™分析（美国赛默飞世尔科技公司）研究了在3D-染色HA/涂层3D-着色HA上培养的BM-MSCs/UC-MSC的增殖。简单地说，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA去除第3–5代中的细胞，并进行台盼蓝染色以确定活细胞的数量。可行MSC（2×10⁴细胞）接种在5mm支架的表面上，所述96孔板含有不含酚红的完全培养基[不含酚红的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco/Thero Fisher Scientific，USA），补充有10%胎牛血清（FBS；Hyclone，USA），2mM Glutamax™（Gibco/Thero Fisher Scientific，USA）100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素]。细胞在37°C的5%CO中保存₂培养基每3天更换一次。为了避免培养板上附着的细胞参与分析并影响结果，在接种过夜后将支架转移到新的培养板上。在第3天、第7天、第14天、第21天和第28天，使用PrestoBlue™分析在同一孔中测量支架上MSC的细胞活力，而不从孔中移除支架。简单地说，样品与PrestoBlue™试剂在苯酚无红完全培养基中以1:10的最终稀释率培养30分钟。然后，使用微孔板阅读器（美国BioTex）在560 nm激发和590 nm发射下分光光度法测量100µl反应介质。根据以下公式，结果以对照百分比表示：

单元格 增殖 = (\frac{哦 . D类 . 属于 细胞 在里面 每个 白天 - 哦 . D类 . 属于 空白的}{哦 . D类 . 属于 细胞 在 白天 1 - 哦 . D类 . 属于 空白的}) \times 100

碱性磷酸酶活性测定

为了检测在3D-染色HA/涂层3D-着色HA上培养的BM-MSC和UC-MSC的成骨分化潜能，使用SensoLyte®pNPP ALP检测试剂盒（美国AnaSpec）测量碱性磷酸酶（ALP）活性。简言之，2×10⁴骨髓间充质干细胞接种在3D-涂层HA/涂层3D-涂HA上，接种在含有苯酚无红完全培养基的96个培养皿中。让细胞整夜粘附在表面，用成骨分化培养基替代苯酚无红完全培养基。细胞保存在37°C、5%CO的加湿培养箱中_2,每3天更换一次新鲜培养基。在第3、7、14、21和28天测定ALP活性。简单地说，脚手架从96-well板上拆下，放在一口新井里。支架上的MSC与裂解缓冲液[0.1 M甘氨酸（美国VWR Chemicals BDH®）、1%Nonide P-40（美国USB Chemical）、1 mM MgCl孵育₂（美国Sigma-Aldrich）和1 mM氯化锌₂（德国EMSURE®），pH 9.6]，室温下保持20分钟。之后，将样品在−80°C下冷冻30分钟，并在室温下解冻20分钟。在冷冻-解冻循环重复3次后，将样品在12000xg，4°C下离心10分钟，以沉淀细胞碎片。使用微孔板阅读器收集上清液，以405 nm的吸光度进行ALP活性分析。使用Bradford试验（美国Bio-Rad）测量总细胞蛋白。通过比较样品的OD值（外径样品-外径空白）和由0–10 ng/ml ALP标准溶液生成的标准曲线，并用细胞总蛋白浓度进行归一化，计算ALP活性。

成骨基因表达的定量

BM-MSC和UC-MSC（1×10⁵细胞）在含有完整DMEM培养基的24孔板中，在15-mm三维染色HA/涂层三维染色HA上培养过夜。然后，将培养基替换为成骨分化培养基。细胞保持在37°C的5%CO中₂培养箱，每3天更换一次新鲜培养基。在第7、14、21和28天，使用Trizol™试剂（美国Thermo Fisher Scientific Invitrogen公司）提取总RNA。简而言之，用500μl Trizol™试剂溶解支架上的MSC。初始−80°C冷冻30分钟，然后25°C解冻20分钟。循环重复3次。将溶解的细胞转移到1.5 ml试管中。随后，添加100µl三氯甲烷，将混合物剧烈摇晃15 s，然后在室温下培养2 min。在4°C下以12000xg离心15分钟后，将水相转移到新的管中，并加入异丙醇。样品在室温下培养10分钟，然后在12000xg、4°C下离心10分钟。丢弃上清液，用75%乙醇在无核水中清洗RNA颗粒，并在室温下干燥10分钟。然后将RNA重悬于50µl不含RNA酶的水中。使用纳米滴机器（美国Thermo Fisher Scientific公司）测量RNA浓度，并使用iScript™逆转录Supermix进行RT-qPCR（美国Bio-Rad公司）将其逆转录成cDNA。qRT-PCR反应是使用iTaq™Universal SYBR®Green Supermix（美国Bio-rad）制备的。使用StepOne plus™Real-Time PCR系统（Applied Biosystems；ABI，美国）以40个扩增周期（在95°C下变性15秒，在60°C下退火60秒）对反应进行扩增。引物序列，包括runt-related transcription factor-2(RUNX-2（运行2）)，奥斯特里克斯(OSX公司)，骨钙素(OCN公司)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)，总结在表中表11（表（表1）。1). 成骨基因的差异表达通过内部控制基因进行标准化。使用StepOne™软件版本2.3（Applied Biosystems；ABI，USA），通过比较阈值循环值（ΔΔCT）方法分析数据，并以相对mRNA表达水平表示。

表1

底漆和产品尺寸。

基因	正向底漆	反向底漆	产品规模（bp）
RUNX-2（运行2）	5′-GACAGCCCCAACTTCGTG-3′	5′-CCGGAGCTCAGCAATAAT-3′	159
成骨相关转录因子抗体	5′-TGCTTGAGGAGGAGAGTTCAC-3′	5′-CTGCTTGCCCAGAGTGTT-3′	114
骨钙素	5′-CTCCACCCCTCGCCCTATT-3′	5′-TCAGCAACTCGTCACAGTC-3′	245
GAPDH公司	5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′	5′-TTGATTTGGAGGGATCTCG-3′	159

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免疫荧光染色

用免疫荧光染色法检测在3D-染色HA/涂层3D-着色HA上培养的BM-MSC和UC-MSC中骨基质胶原蛋白和非胶原蛋白的表达。简言之，2×10⁴骨髓间充质干细胞接种在3D-涂层HA/涂层3D-涂HA上，接种在含有苯酚无红完全培养基的96个培养皿中。让细胞一夜之间粘附在表面。然后，取出完整的培养基并添加成骨分化培养基。细胞保存在37°C、5%CO的加湿培养箱中₂新鲜培养基每3天更换一次。第21天进行免疫荧光染色。简单地说，支架上的MSC用4%多聚甲醛固定15分钟，用0.1%Triton X-100（美国USB公司）渗透10分钟。然后将细胞在PBS中洗涤，并在室温下与4%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich，USA）在PBS中孵育30分钟。随后，在室温下用4%BSA-PBS培养细胞30分钟。然后将细胞与抗骨钙素抗体（Abcam，UK:ab93876，1:100）和抗胶原蛋白I抗体（Abcam，UK:ab34710，1:500）在4℃孵育过夜。将细胞用PBS中的0.1%吐温20洗涤5分钟3次，并与Alexa Fluor®488山羊抗兔IgG（H+L）（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA：A11034，1:500）在室温下孵育30分钟。用1µg/ml的Hoechst（美国Sigma-Aldrich）对细胞核进行复染。使用共焦显微镜（共焦显微镜系统C2+；日本尼康）检查细胞。将在完整培养基中培养的细胞作为对照。

统计分析

所有实验均在至少3个不同的样品上进行。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。采用单因素分析（ANOVA）进行统计分析。小于0.05的P值被认为具有统计学意义。

道德批准和参与同意

本研究得到了泰国第一大学（医学院）人类研究伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基和贝尔蒙特报告的声明原则。所有样本均获得捐赠者的书面知情同意。

结果

3D打印支架的特性

3D涂层HA和涂层3D涂层HA的XRD图谱在11°、23°、26°和32°的2θ处具有相同的显著峰，这是HA相的典型峰（图1A） ●●●●。涂层3D-涂层HA中也观察到约5°和9°的小峰，属于磷酸八钙（OCP）。这表明OCP在HA基质上的仿生沉积是成功的，样品中HA:OCP的比例为97.2:2.8（图1B） ●●●●。涂层3D-着色HA的孔隙率略低于3D-涂层HA，分别为61.26%和65.87%，而两种样品的平均孔径在0.24和0.26μm的相似范围内（图1B） ●●●●。通过扫描电子显微镜，3D涂层HA和涂层3D涂层HA的微观结构显示出类似的高度多孔性，但具有不同的晶体形态。3D显示的HA显示了羟基磷灰石针状晶体的缠结（图1C）它们是在低温相变过程中形成的。相比之下，由于涂层3D-涂层HA中的仿生涂层步骤，磷酸八钙的叶状晶体额外沉积在羟基磷灰石晶体上（图1D） ●●●●。

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图1

三维喷涂支架的特点。(A类)显示两个样品宽峰的XRD模式表明HA样品中羟基磷灰石的低结晶性和单相相，涂层HA样品中的羟基磷磷灰石/磷酸八钙相。(B类)表中显示了样品的孔隙度、孔径和HA:OCP的相比。(C类)3D打印HA（HA）的微观结构显示多孔性（左，×500），这是由HA针状晶体（右，×2500）的缠结形成的。(D类)涂层3D-涂层HA（涂层HA）的微观结构显示多孔结构（左，×500），包括HA针状晶体和OCP晶体的混合物，如红色箭头所示（中，×2500），这些晶体为叶状晶体（右，×20000）。

间充质干细胞的特性

采用密度梯度离心法从人骨髓（BM-MSC）分离间充质干细胞。接种后，球形细胞粘附在培养瓶上，呈现成纤维细胞样形态。第3天，去除非粘附细胞，显微镜检查显示有几个粘附细胞集落。菌落中的细胞呈现纺锤状和成纤维细胞外观（图2A） ●●●●。这些细胞具有很高的增殖能力。在达到衰老阶段之前，它们被扩展到10代。

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图2

来源于人类骨髓（BM-MSC）和脐带（UC-MSC）的MSCs的特征。(A类)细胞在DMEM+10%FBS中培养10天后的纺锤形形态。(B类)流式细胞术分析显示MSC标志物（CD73、CD90、CD105）阳性表达，造血标志物（CD34、CD45）阴性表达。(C类)MSC标记物在BM-MSC和UC-MSC中的表达无统计学差异。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。(D类)骨髓间充质干细胞和UC间充质干细胞的脂肪分化潜能，分化后的骨髓间充质干细胞经油红O染色后呈现橙红色。(E类)骨髓基质干细胞和脐血基质干细胞的成骨分化潜能，分化后的MSCs经茜素红S染色后呈橙红色(F类)BM-MSCs和UC-MSCs的软骨分化潜能，分化的MSCs经阿尔西安蓝染色后呈蓝色。N=5，微米巴=100μm。

用酶消化法分离脐带细胞，并在与骨髓细胞相同的条件下培养。初次电镀后一天，倒置显微镜下观察到脐带上松散粘附的聚集细胞。这些细胞持续培养，在最初接种后10天内观察到80%的成纤维细胞样细胞均匀聚集（图2A） ●●●●。传代后，UC-MSCs在正常培养条件下表现出快速增殖能力。UC-MSC在失去增殖能力之前可扩增至20代。

免疫表型特征

用流式细胞仪分析第3代至第6代培养的MSC，以检测分化标记物的聚类，包括CD73、CD90、CD105、CD34和CD45。结果表明，表达造血细胞标志物（CD34和CD45）的细胞平均百分比总体低于2%。这些标记被称为排除标记。相反，从骨髓和脐带分离的细胞对最初被称为MSC标记物（CD73、CD90和CD105）的标记物呈阳性。值得注意的是，超过90%的BM-MSC和UC-MSC对MSC标记物（CD73、CD90和CD105）呈阳性（图2B）.然而，BM-MSC和UC-MSC之间的MSC表面标记物表达水平没有显著差异（图2C） ●●●●。

三系分化潜能

通过在成脂、成软骨和成骨诱导培养基中诱导，检测BM-MSC和UC-MSC的三系分化潜能。在其独特的诱导培养环境下，培养的MSC很容易分化为成脂、成软骨和成骨谱系。在脂肪诱导培养基中，纺锤形MSCs发育成细胞质中有大量脂滴的巨细胞（图2D） ●●●●。这些脂滴的油红O染色呈阳性，表明MSCs的成脂分化效率。在完整的DMEM培养基中培养的对照MSC没有显示成脂分化的迹象，油红O染色阴性（图2D） ●●●●。为了研究BM-MSC和UC-MSC的成骨分化潜能，MSCs在成骨诱导培养基中培养，并用茜素红S染色以检测细胞外钙和磷酸盐晶体的分泌。暴露于成骨诱导培养基后，根据茜素红S染色阳性判断，BM-MSC和UC-MSC中均检测到细胞外基质矿化的迹象，而同期在完全DMEM培养基中培养的对照细胞茜素红S染色阴性（图2E） ●●●●。在软骨分化培养基中诱导14天后，评估BM-MSC和UC-MSC的软骨分化潜能。在培养基中维持期间，BM-MSC和UC-MSC在培养板底部形成一个小球，随着时间的推移，小球变得更大、更球形（图2F） ●●●●。在第10天，UC-MSC形成一个直径为520.50±14.54µm的球形肿块，而BM-MSC的直径为368.57±23.78µm。第14天，UC-MSC形成一个直径为561.11±71.31µm的球形肿块，而BM-MSC的直径为547.77±91.27µm。这些球形肿块显示出强烈的阿尔西安蓝染色，与蛋白多糖沉积相一致。在完全DMEM培养基中培养的对照组未能形成颗粒，且阿尔西安蓝染色未阳性（图2F） ●●●●。

MSCs的生长特征

在标准培养条件下观察14天BM-MSC和UC-MSC的生长特性。每2天使用血细胞仪评估一次每个来源的MSC总数。在早期（第0天到第8天），BM-MSCS和UC-MSCS的增殖能力相似（图三A-C）。在培养的前8天，细胞数量和生长动力学不显著。从第8天开始，第3-4代UC MSC的数量显著低于相同代BM MSC的数量(P（P） < 0.05). 然而，有必要注意的是，从第5代开始，UC-MSCs的增殖能力与BM-MSCs相同。从1×10开始^三第0天，BM-MSC在14天内扩增25倍。另一方面，UC-MSC在14天内扩大了20倍（图三).

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图3

UC-MSC与BM-MSC的生长特性比较。每2天采集一次三份培养物，共14天，并对粘附细胞进行计数。(A类)第3代MSCs的生长曲线(B类)第4代MSCs的生长曲线(C类)第5代MSCs的生长曲线。(D类)与BM-MSC相比，UC-MSC的种群倍增时间。结果（N=3）表示为平均值±SD*P（P） < 0.05：与BM-MSC相比存在显著差异。

骨髓间充质干细胞在第2-3代期间的群体倍增时间似乎显著低于UC间充质干细胞(P（P） < 0.05），导致在早期传代过程中BM-MSC的增殖速度比UC-MSC更快（图三D） ●●●●。然而，从第4代开始，BM-MSC和UC-MSC的种群倍增时间似乎相等。根据结果，BM-MSC的平均数量增加了一倍，为47.79±5.32小时，而UC-MSC的增加时间为51.30±4.71小时。

肌动蛋白丝染色

为了评估3D-涂层HA和涂层3D-喷涂HA在骨组织工程中的潜力和适用性，采用肌动蛋白丝染色观察BM-MSCs和UC-MSCs在支架上的粘附。如肌动蛋白染色的荧光显微照片所示，3D涂层HA和涂层3D涂层HA都是MSCs的良好支撑材料（图4). 初始播种后，BM-MSC和UC-MSC都能很好地粘附在支架表面。它们形成的菌落几乎覆盖了支架的整个表面，细胞内肌动蛋白丝的阳性染色证明了这一点（图4). 值得注意的是，BM-MSC和UC-MSC在涂层的3D-染色HA上显示出比3D-着色HA更强烈的染色信号，但细胞形状没有差异。此外，培养在3D染色HA和涂层3D染色HA上的UC-MSC在支架上表现为大量细胞，而BM-MSC表现为均匀分布的模式。

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图4

代表性荧光显微照片显示了BM-MSC和UC-MSC中的肌动蛋白丝染色（绿色），它们在第28天附着在3D-染色HA（HA）和涂层3D-着色HA（涂层HA）上。细胞核用DAPI（蓝色）染色。

三维支架上细胞培养的特点

第28天观察支架上BM-MSC和UC-MSC的形态特征。BM-MSC在3D-printed HA和涂层3D-pritted HA表面铺展良好，呈扁平细长形状，有几个延伸的伪足（图5-红色箭头）。这些假足看起来是相连的，在与支架表面接触的点上形成了局部粘连（图5).

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图5

扫描电镜图像显示，与完全DMEM培养基培养28天的细胞相比，在3D-前体HA（HA）和涂层3D-后体HA（涂层HA）上培养的BM-MSC和UC-MSC的特征。细胞附着在支架上，成为具有延伸和相互连接的细胞质突起的大型扁平细胞（红色箭头）。

有趣的是，在成骨分化培养基中培养的BM-MSC密度高于在完整的DMEM培养基中培育的BM-MSCs在3D打印HA和涂层3D打印HA上的密度。在3D-染色HA和3D-涂层HA上培养的UC-MSC的形态特征与BM-MSC相似。两种间充质干细胞都可以在3D打印HA和涂层3D打印HA的表面上保留至少28天，同时保持扁平的细胞体和附着在支架表面的细长形状的伪足（图5). 此外，观察到假足、局灶性粘连和导致细胞片形成的细胞桥接之间的联系（图5).

随着培养时间的延长，BM-MSC和UC-MSC均显示出致密连续的细胞片。还观察到，许多MSC集落在第28天附着在支架上，涂层的3D-染色HA的结果稍好。此外，当样品在成骨分化培养基中培养时，两种类型的MSC的密度均高于在完整的DMEM培养基中，UC-MSC表达的结果更好。这些数据可能反映了支架的骨传导性的差异。

细胞增殖评估

通过细胞增殖试验证明了3D-着色HA和涂层3D-涂层HA的生物相容性。在支架上培养BM-MSC和UC-MSC，并使用PrestoBlue™分析评估细胞增殖。播种后第1天，经涂层的3D涂层HA上的BM-MSC与3D涂层HA的BM-MSCs的附着率相似（94.2±1.10 vs.93.9±0.64）。在塑料培养板和支架上培养的BM-MSC在每个时间点都稳定增加（图6A） ●●●●。有趣的是，在3D标记HA支架上培养的骨髓基质干细胞与在塑料培养板上培养的细胞活性相似。相比之下，在涂层的3D-染色HA上培养的骨髓基质干细胞显示出明显高于在塑料培养板上培养的细胞活力，尤其是在第28天(P（P）<0.05). 值得注意的是，在涂有3D涂层的HA上培养28天的BM-MSC的细胞活力显著高于在3D涂层HA上培养的细胞活力(P（P） < 0.05).

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图6

BM-MSC的生存能力(A类)和UC MSC(B类)用完整的DMEM培养基在3D-涂层HA（HA）、涂层3D-涂HA（涂层HA）和塑料培养板上培养。MSCs在每种支架中的存活率表示为对照组的%，即MSCs在培养第1天在同一种支架上培养。N=3*P（P） < 与在塑料培养板上培养的MSC相比，0.05。^#P（P） < 与在3D-染色HA上培养的MSC相比，0.05。

与在塑料培养板上培养的UC-MSC相比，在3D-染色HA和3D-涂层HA上培养的培养UC-MSC的活力显示出与BM-MSC相似的模式。播种后第1天，涂布的3D涂层HA上的UC-MSC与3D涂层HA的UC-MSCs的附着率相似（94.6±1.10 vs.94.0±1.34）。在整个培养期间，在塑料培养板和支架上培养的细胞活力逐渐增加（图6B） ●●●●。然而，在塑料培养板上培养的UC-MSC的加速速度低于在支架上培养的。在第3天和第7天，在3D-染色HA上培养的UC-MSC显示出几乎与在塑料培养板上培养的细胞相似的增殖率。然而，从第14天开始，在涂有3D涂层的HA上培养的UC-MSC的细胞存活率显著高于在塑料培养板上培养的细胞(P（P） < 0.05). 结果表明，该支架与BM-MSC和UC-MSC均具有生物相容性，涂层3D-涂层HA上的细胞增殖和扩张比3D-涂膜HA上的更明显。

碱性磷酸酶活性

定量ALP活性测定评估了3D-染色HA和3D-涂层HA支持和促进BM-MSC和UC-MSC成骨分化的能力。与在完全DMEM培养基中培养的BM-MSC相比，与成骨诱导培养基培养的BM-mSC在3D-染色HA和涂层3D-着色HA上的ALP活性显示出逐渐而显著的增加，而与支撑底物无关（图7A） ●●●●。在第28天，在支架和塑料培养板上培养的细胞中观察到最高的ALP活性。在几乎所有观察的日子里，在塑料培养板上培养的骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活性高于在支架上培养的细胞，但在第28天在涂有3D涂层的HA支架上培养出的骨髓基质细胞除外（图7A） ●●●●。有趣的是，在每个时间点，3D-涂层HA支架上培养的BM-MSCs的ALP活性都高于3D-喷涂HA支架上的BM-MSC；然而，仅在第28天观察到显著差异(P（P） < 0.05).

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图7

骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性(A类)和UC MSC(B类)在第3天、第7天、第14天、第21天和第28天，在3D涂层HA（HA）和涂层3D涂层HA上培养，并与在塑料培养板上培养的细胞进行比较。N=3*P（P） < 0.05，与DMEM+10%FBS培养的MSCs相比。^#P（P） < 与在3D打印的HA上用成骨分化培养基培养的MSCs相比。^$P（P） < 与在塑料培养板上用成骨分化培养基培养的MSCs相比，0.05。

同样，在两种支架和塑料培养板上用成骨分化培养基培养的UC-MSC比用完整的DMEM培养基培养细胞具有更高的ALP活性（图7B） ●●●●。在支架和塑料培养板中，经成骨分化培养基培养的UC-MSCs的ALP活性在第28天之前稳定增加。从第14天起，这些UC-MSC的ALP活性显著增加（图7B） ●●●●。第28天，与在塑料培养板上培养的UC-MSC相比，在3D-染色HA和涂层3D-涂层HA支架上与成骨分化培养基培养的UC-mSC具有显著更高的ALP活性(P（P） < 0.05).

成骨基因的表达水平

为了比较3D-染色HA和3D-涂层HA上培养的BM-MSCs和UC-MSCs与塑料培养板上培养的细胞的成骨分化潜能，每周使用定量实时PCR监测成骨基因的表达。结果表明RUNX-2（运行2）在3D-染色HA和3D-涂层HA培养的BM-MSCs中，3D-着色HA和涂层HA稳定增加，并在第14天达到最高水平，然后在第21天和第28天逐渐减少。类似的进展RUNX-2（运行2）在塑料培养板上培养的BM-MSC中观察到表达（图8A） ●●●●。值得注意的是，在第14天，在涂有3D涂层的HA支架上培养的BM-MSC的表达水平显著高于RUNX-2（运行2）与在3D-染色HA支架上培养的BM-MSC相比。与…对比RUNX-2（运行2）在整个培养过程中，3D-染色HA和3D-涂层HA培养的BM-MSC中OSX和OCN的表达水平逐渐增加，并在培养期结束时达到最高点（图8B、 C）。在3D打印HA和涂层3D打印HA上培养的骨髓间充质干细胞显示更高OSX公司和OCN公司表达量高于塑料培养板上培养的细胞；然而OCN公司仅在第28天观察到表达(P（P） < 0.05).

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图8

实时RT-PCR显示成骨标志物的表达，RUNX-2（运行2），奥斯特里克斯(OSX公司)和骨钙素(OCN公司)BM-MSC中(A类，B类，C类)和UC-MSC(D类，E类，F类)在塑料培养板上培养期间，3D-染色HA（HA）和涂层3D-着色HA（涂层HA）。第0天在完全DMEM培养基中培养的MSC作为对照*具有统计意义的数据P（P） < 与对照组相比，0.05。N=3，^#P（P） < 与同一时间点在3D-染色HA上培养的MSCs相比，0.05。^$P（P） < 与同一时间点在塑料培养板上培养的MSCs相比，0.05。

对于UC-MSC，RUNX-2（运行2）在3D-染色HA和涂层3D-着色HA上培养的细胞表达逐渐增加，并在第28天达到最高水平。在塑料培养板上的成骨诱导培养基中培养的UC-MSC显示出类似的模式RUNX-2（运行2）在支架上培养的MSCs的表达（图8D） ●●●●。值得注意的是，在3D涂层HA和涂层3D涂层HA支架上培养的UC-MSC显著高于RUNX-2（运行2）比在塑料培养板上培养的细胞的表达(P（P） < 0.05). 此外OSX公司和OCN公司在UC-MSC中，与在完全DMEM培养基中培养的细胞相比，在支架和塑料培养板上培养的细胞明显增加，且呈时间依赖性(P（P）<0.05). 值得注意的是，最强大的OSX公司在涂敷的3D-染色HA上培养的UC-MSC中发现表达（图8E） ●●●●。此外，与在3D打印HA上培养的细胞相比，在涂层3D打印HA上培养的UC MSC在第28天显示出OCN的表达显著上调（图8F） ●●●●。

胶原蛋白和非胶原蛋白的表达

在成骨诱导后第21天进行免疫荧光染色，以检查在3D-染色HA和3D-涂层HA上培养的BM-MSC和UC-MSC中成骨蛋白标记物的表达，包括骨钙素和I型胶原。结果表明，在3D-染色HA上培养的骨髓基质干细胞骨钙素染色阳性，与在涂层3D-着色HA上培养细胞的骨钙素阳性相似。此外，在3D-染色HA上培养的骨髓基质干细胞具有与在涂层3D-着色HA上培养细胞相似的I型胶原的强烈表达（图9). 相应地，培养在3D-染色HA上的UC-MSC与培养在涂层3D-着色HA上的细胞一样，骨钙素染色呈阳性。此外，培养在3D-染色HA上的UC-MSC与培养在涂层3D-着色HA上的细胞具有类似的I型胶原的强烈表达（图9).

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图9

免疫荧光显微照片显示了在3D-染色HA（HA）和涂层3D-着色HA（涂层HA）上培养21天的BM-MSC和UC-MSC中骨钙素和I型胶原的表达。

讨论

随着骨髓间充质干细胞（MSCs）在骨修复中的应用迅速增加，有必要确定哪些组织可以提供最合适的来源，并验证MSCs的特定效力。骨髓是临床应用MSC的主要来源，其可用性有限，因此需要漫长的扩增过程。长期培养会影响MSCs的生物学特性并降低其增殖和分化潜能^⁴⁶在异基因移植中，治疗效果与MSC的数量和剂量有关^⁴⁷因此，来自更容易获得的来源的替代MSC对于骨修复应该更方便。MSCs可以从脐带中分离出来，脐带是分娩后丢弃的生物样本^⁴⁸UC-MSC通过具有相似的细胞表面标记和分化潜能模式，与BM-MSC具有相似的特征^{²⁸，⁴⁹，⁵⁰}然而，它们的成骨分化潜能不如BM-MSC显著^⁴¹。控制培养条件，例如引入特定的生长因子，可以导致更有效的MSC扩增和成骨分化^{²⁸，²⁹}因此，UC-MSC是很有希望用于异基因骨组织修复的干细胞。如果证明临床应用可行，UC-MSC具有优势，因为与自体BM-MSC相比，UC-MSCs可以大量制备，并且作为一种组织处理速度更快的非现成产品。

根据MSCs的标准特性，克隆细胞必须粘附在塑料培养板上，表达分化簇（CD）标记物，包括CD73、CD90和CD105，并能在体外分化为成脂、成软骨和成骨谱系^³⁸本研究通过观察BM-MSC和UC-MSC在塑料培养板中的形态来检测其特征，并使用流式细胞仪分析细胞表面标记物的表达，以及它们分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的潜力。BM-MSC和UC-MSC在塑料培养板中生长时均呈纺锤形，表达类似的细胞表面标记模式。它们可以分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。此外，本研究还证明BM-MSC和UC-MSC具有较高的细胞增殖率。加倍时间从P2稳定增加到P8。在第八代传代后观察到的骨髓基质干细胞的细胞增殖总体下降与之前的研究一致，这些研究表明MSC的寿命有限，并且在一定数量的细胞分裂后进入衰老^⁵¹值得注意的是，UC-MSC的扩张潜力高于BM-MSC；BM-MSC可以在不到10代的时间内积极扩增，UC-MSC可以积极扩增多达20代，然后在第20代后失去增殖能力^⁵²细胞分离和扩增的简单性允许高效的UC-MSC制造。

当用流式细胞仪分析免疫表型时，发现BM-MSC和UC-MSC均不表达MSC排除标记物CD34和CD45。另一方面，这些MSC表达推荐的MSC标记物CD73、CD90和CD105^⁵³这些MSC在扩增后也能保持其成脂、成软骨和成骨分化能力。然而，分化能力因细胞来源而异。

为了提高MSCs在骨修复中的效率，本研究试图开发一种3D培养系统，以更好地支持这些MSCs的增殖和成骨分化。对于成功的骨组织工程，使用支架可能有利于将移植的MSC维持在特定位置。此外，3D支架充当细胞外基质，支持细胞粘附、增殖、分化、扩散和通信^⁵⁴在各种磷酸钙陶瓷中，羟基磷灰石是一种很好的骨修复候选材料，因为它的化学成分与骨组织中的天然羟基磷磷灰石相似^⁵⁵它还具有优异的生物相容性和骨传导性。使用羟基磷灰石进行骨移植可实现羟基磷磷灰石与骨的直接化学结合^⁵⁶.羟基磷灰石用作单一材料或与其他材料组合使用，例如用于骨移植的涂层剂^⁵⁷和靶向骨组织修复的药物输送系统基质^⁵⁸通过3D打印技术可以制作出具有理想解剖轮廓的定制支架，因为该技术可以对生物材料进行简单、快速、准确和多次测试。扫描电子显微镜显示了3D涂层HA和涂层3D涂层HA的多孔微观结构，使营养物质和代谢物能够运输到骨组织中。多孔支架通常用于骨组织修复，以模拟小梁骨的孔隙率^⁵⁹3D-printed HA和涂层3D-pritted HA的表面形貌不同可能会影响MSCs在支架上的相互作用。粗糙的表面刺激成骨样细胞的扩散和增殖^⁶⁰因此，支架的内部和表面特性对治疗应用的成功起着至关重要的作用。

培养在3D-染色HA和3D-涂层HA上的BM-MSCs和UC-MSCs都可以通过荧光阴茎倍体蛋白染色在显微镜下进行鉴定，该蛋白与F-肌动蛋白结合，表明细胞骨架的存在和变化^⁶¹F肌动蛋白应力纤维延伸至整个细胞质的外观表明MSCs与支架表面的适当附着和亲和力。骨组织工程最重要的方面之一是细胞与支持它们的生物材料之间的相互作用。通过延长培养期至28天来进一步评估支架的生物相容性。扫描电子显微镜显示，许多MSC集落以细长细胞片的形式出现，支架表面有延伸的丝状伪足。这表明，3D-printed HA和涂层3D-pritted HA均能支持BM-MSC和UC-MSC的增殖。因此，这些支架可以作为骨组织工程的候选材料。

骨再生是通过向损伤部位招募MSC来实现的。之后，发生细胞增殖、成骨细胞分化和膜内骨化。细胞在支架上增殖的能力意味着它们可以通过细胞和支架之间的有效连接模拟天然细胞外基质，支持细胞生长和分化^⁶²本研究的数据显示，在两种支架上培养的MSCs的细胞增殖率高于在塑料培养板上培养的细胞，尤其是在UC-MSC中。先前的一项研究报告称HA中的颗粒大小也会影响细胞增殖：在较小的HA颗粒上培养的MSC的增殖率高于较大的HA颗粒^⁶³BM-MSCs和UC-MSCs在3D-涂层HA上培养时均显著增加了其增殖潜力。结果表明，表面含有额外OCP的涂层3D-printed HA促进了更好的细胞存活和粘附。先前的研究报道OCP涂层显著增强MC3T3-E1细胞的增殖和ALP活性^{⁶⁴–⁶⁶}因此，在生理条件下，OCP可以控制HA转化过程中的环境，从而提高生物活性和促进骨再生^²².

ALP是成骨细胞分泌的主要表型指标。ALP在早期成骨过程中上调^⁶⁷因此，ALP的表达是人类MSCs成骨分化的早期标志^⁶⁸评估在3D-染色HA和涂层3D-着色HA上培养的BM-MSC和UC-MSC中的ALP活性水平有助于验证MSC向成骨谱系的分化。观察结果表明，与培养在3D涂层HA支架上的细胞相比，培养在涂层3D涂层HA上的BM-MSC和UC-MSC的ALP活性显著增加。此外，BM-MSC的这一事件比UC-MSC更为明显。总的来说，数据证实，涂层的3D-染色HA能够支持成骨分化，如增强的ALP活性所示，优于3D-着色HA。

与ALP活性一致，在涂层的3D-染色HA上培养的MSCs比在3D-着色HA上培养时具有更高水平的成骨基因表达。从统计上看，UC-MSC的情况存在显著差异。相比之下，在两种类型的支架上培养的两种MSCs的大多数成骨基因表达均高于在塑料培养板上培养的MSCs。以前的一项研究报告称HA可以诱导成骨细胞的活性，从而增加骨缺损中新骨基质的合成^⁵⁵通过提高调节运行-2表达^⁶⁹在成骨过程中，成骨细胞通过调节多种转录因子（包括主转录因子）与前体细胞分化RUNX-2（运行2）及其下游OSX公司这两个是关键转录因子，在MSC成为成骨细胞的细胞-食物决策过程中发挥关键作用^⁷⁰.RUNX-2（运行2）是最常见的成骨细胞分化标志物之一，尤其是在早期。的表达式RUNX-2（运行2）成骨细胞分化过程中随时间减少^⁷¹.

另一方面RUNX-2（运行2）在成骨细胞分化的后期，抑制成骨细胞成熟，减少骨量，并导致骨质减少和骨折^⁷²。观察到运行-2BM-MSC中的表达水平在第14天最高，直到第28天逐渐降低，而RUNX-2（运行2）直到第28天，UC-MSC中的含量逐渐增加。与UC-MSC相比，BM-MSC可能更快更有效地分化为成骨细胞^⁷³; 因此RUNX-2（运行2）在第14天观察到BM-MSC中的表达，而RUNX-2（运行2）在第28天观察UC-MSC中的表达。OSX公司是一个下游因子RUNX-2（运行2）^⁷⁴，其表达诱导早期成骨细胞分化为成熟成骨细胞，并在成骨过程中最终分化为骨细胞^⁷⁵.停用OSX公司出生后导致成骨细胞功能缺陷，从而减少骨形成^⁷⁶.连同RUNX-2（运行2），OSX公司负责表达成骨细胞蛋白，包括碱性磷酸酶、胶原蛋白和非胶原蛋白^⁷⁷。除此之外RUNX-2（运行2），HA也诱导OSX公司诱导成骨祖细胞向成骨细胞分化的表达^⁷⁸.组织控制网络是一种几乎完全由成骨细胞分泌的γ-羧基谷氨酸蛋白。它是骨组织中最丰富的非胶原蛋白，与骨羟基磷灰石基质具有高亲和力^⁷⁹在骨骼发育过程中，它还负责骨基质的合成和矿化。因此OCN公司在成骨细胞中是矿物质沉积的标志^⁷⁹这些因子通常被用作成骨细胞分化研究的标记物，包括与HA用于骨再生相关的标记物。据报道，HA通过增加成骨转录因子的表达而诱导成骨细胞分化^⁵⁵与基因表达一致，蛋白质分析显示，在两种3D-染色HA支架上培养的MSCs中表达了特定的成骨标记物，包括非胶原蛋白OCN和胶原蛋白COL1。数据表明，培养在3D打印HA和涂层3D打印HA上的BM-MSC和UC-MSC可以分化为成骨细胞。

本研究获得的数据增加了对HA作为骨组织工程生物材料的分子机制的了解，并提供了一种更好的设计用于骨组织再生的HA基支架。尤其是涂层的3D-涂层HA。磷酸钙涂层可能更好地支持MSCs的体外成骨分化，并改善体外成骨形成。这一发现得到了支持，即含有磷酸钙成分的生物材料已被证明可以促进体外培养的人类MSCs的成骨分化^⁸⁰综上所述，我们的研究证明了3D涂层HA和涂层3D涂层HA在骨再生和治疗骨疾病中的潜在应用的益处和适用性。

结论

本研究证明了UC MSCs和BM MSCs在骨组织工程中的潜力。3D打印HA和磷酸钙涂层3D打印HA都支持BM MSCs和UC MSCs的增殖和成骨分化。值得注意的是，涂层的3D涂层HA显示出比3D涂层HA更高的生物相容性。然而，3D涂层HA和涂层3D涂层HA作为生物材料显示出良好的潜力，可以构建成新型骨组织修复支架。

致谢

本研究得到了Thammasat University Research Fund（合同号：TUFT53/2564）、Thammaset University、Thammasat University医学院、Thammatas University干细胞研究卓越中心、Thammsat Universiversity和Thailand Graduate Institute of Excellence in Stem Cell Research的支持，国家科学技术开发署合同号：SCA-CO-2560-4471-TH。作者感谢产房工作人员Thammasat University Hospital为标本采集提供的便利，感谢所有志愿者为本研究捐赠组织。

缩写

碱性磷酸酶	碱性磷酸酶
骨髓间充质干细胞	骨髓间充质干细胞
光盘	分化集群
DAPI公司	4，6-二氨基-2-苯基吲哚
DMEM公司	Dulbecco改良鹰式中号
乙二胺四乙酸	乙二胺四乙酸
FBS公司	胎牛血清
FITC公司	异硫氰酸荧光素
GAPDH公司	甘油醛-3-磷酸脱氢酶
哈	羟基磷灰石支架
MSC（MSC）	间充质干细胞
OCN公司	骨钙素
OSX公司	成骨相关转录因子抗体
美国公共广播电视公司	磷酸盐缓冲盐水
体育课	藻红蛋白
pNPP核电站	对硝基苯基磷酸酯
定量RT-PCR	定量实时聚合酶链反应
RUNX-2（运行2）	Runt-related转录因子2
扫描电镜	平均值的标准误差
UC-MSC（UC-MSC）	脐带源间充质干细胞

作者贡献

S.M.：概念化、监督、方法、调查、数据分析、撰写初稿、编辑和修订手稿、资金获取、资源；L.M.：调查、可视化、撰写初稿；J.S.：监督、资源、撰写初稿、审阅和编辑手稿；F.T.：材料准备、可视化；I.P.：调查；P.K.、C.T.、D.T.：构思、审查和编辑手稿。

基金

本研究得到了Thammasat University Research Fund（合同号：TUFT53/2564）、Thammast University、Thammatas University医学院、Thammasat University-干细胞研究卓越中心（Center of Excellence in Stem Cell Research）、泰国Thammasat-大学医学院、泰国科学技术研究生院、Thamasat大学博士后奖学金的支持，国家科学技术开发署合同号：SCA-CO-2560-4471-TH。

数据可用性

本研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

竞争性利益

作者声明没有相互竞争的利益。

脚注

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

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