国际分子科学杂志。2022年10月；23(20): 12697.
利用人脐带源间充质干细胞构建组织板促进糖尿病创面愈合
大卫·米尔斯，学术编辑
大阪大学医学研究生院心血管外科，2-2 Yamada oka，Suita 565-0871，日本大阪
2022年9月29日收到；接受2022年10月20日。
- 补充资料
GUID:2CC47127-A08E-4466-833E-B7328AD4E894
- 数据可用性声明
本研究中生成和/或分析的所有数据均包含在本文中。
摘要
糖尿病足溃疡是糖尿病常见的慢性并发症。人脐带源间充质干细胞（hUC-MSC）因其多向性和易得性在再生医学中得到了广泛应用。我们开发了基于聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）的支架，用于制作hUC-MSC组织片。体外免疫染色显示，hUC-MSC组织片形成厚实的组织片，含有丰富的细胞外基质（ECM）。无论是否使用hUC-MSC组织片、hUC-MSC-注射或纤维治疗小鼠的糖尿病创面，结果显示hUC-MCC组织片移植促进了糖尿病创面愈合，改善了再上皮化、胶原沉积、血管形成和成熟，与其他组相比，炎症减轻。综上所述，我们的研究结果表明，在PLGA支架上培养的hUC-MSC可以促进糖尿病创面愈合、胶原沉积和血管生成，为细胞移植提供了一种新的有效方法，并为糖尿病皮肤创面治疗提供了一个有希望的替代方案。
关键词：糖尿病伤口、人脐带源间充质干细胞、PLGA支架、炎症、胶原沉积、伤口愈合
1.简介
糖尿病是一种严重而常见的慢性疾病，对公众健康构成重大威胁[1]. 根据国际糖尿病联合会（IDF）的报告，估计2021年有5.37亿人患有糖尿病。到2030年，这一数字将达到6.43亿，到2045年将达到7.83亿[2]. 糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病常见的慢性并发症[三,4]. 与非糖尿病患者相比，糖尿病患者一生中发生足部溃疡的风险为25%[5]. 据估计，全世界每30秒就有一名糖尿病患者接受下肢截肢手术[5]. DFU是由止血、炎症、胶原沉积和血管生成等多种机制失衡引起的非愈合伤口[6]. 尤其是促血管生成生长因子减少和伤口血管生成减少是糖尿病患者伤口修复受损的主要原因[7]. 因此，增强创伤区域的血管生成可能是加速伤口愈合的有效策略。
近几十年来，越来越多的证据表明，以间充质干细胞（MSC）为基础的治疗可以促进伤口愈合并抑制疤痕形成[8,9,10]. 因此，MSC移植作为治疗糖尿病创面的一种新策略正日益受到重视[11]. 脂肪源性间充质干细胞（ADSC）和骨髓源性间基质干细胞（BM-MSCs）在伤口愈合方面表现出类似的效果，它们可以通过增强血管生成、促进细胞增殖和ECM分泌来加速糖尿病伤口愈合[12,13]. 然而，之前的几项研究表明，MSC的数量和功能随着年龄或长期疾病而减少。因为大多数糖尿病患者都是老年人，所以大多数糖尿病患者缺乏足够的、有功能的自体干细胞用于糖尿病伤口的细胞治疗[14,15,16,17]. 在MSCs的可用来源中，脐带在经济上是可行的和多产的。据报道，人脐带源性MSCs（hUC-MSC）可加速伤口愈合；然而，关于其对糖尿病的影响的研究很少[18,19]. 此外，hUC-MSC促进糖尿病伤口愈合的机制尚不清楚。
将单细胞悬液注射到受伤区域的外围是一种有效的MSCs输送方法[20]. 然而，细胞悬液注射会导致细胞大量丢失和局部分布不均匀，从而降低治疗效果[21]. 此外，当伤口规模较大时，外围注射无法将细胞输送到伤口中心。也有一些关于静脉注射的报道；然而，这种方法可能会降低MSC向受伤区域的输送效率，因为一些移植细胞会被困在肺部，导致其积聚[22,23].
聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）是一种可生物降解且生物相容的共聚物材料，已用于许多食品和药物管理局（FDA）批准的治疗设备中[24]. 在本研究中，我们开发了基于PLGA的纤维作为支架，以在体外创建hUC-MSC组织片，并将其移植到糖尿病小鼠体内，以评估其对糖尿病伤口愈合的影响。我们优化了支架制备、细胞培养和组织构建的条件，获得了192±14μm厚的组织片。在将hUC-MSC组织片移植到糖尿病小鼠全层切除皮肤伤口上之前，对组织片的特性和性能进行了测试和验证。hUC-MSC组织片有效促进上皮再生、胶原沉积、微血管浸润和血管成熟。这些发现可能有助于为糖尿病伤口提供新的临床有效治疗方法。
2.结果
2.1. hUC-MSC的表征
hUC-MSCs培养5～7代，根据MSC表面标记物的表达确定其特性。流式细胞术分析表明，hUC-MSC对CD73、CD90、CD105和HLA-ABC显著阳性，对CD31、CD34、CD45、HLA-G和HLA-DR显著阴性(a） ●●●●。在光场显微镜下，细胞表现出典型的纺锤状形态(b） ●●●●。此外，为了检测hUC-MSC是否保留其成脂、成骨和成软骨分化潜能，在第五代后进行体外分化试验。细胞对油红O染色（脂肪生成标记物）呈阳性(c） 茜素S红染色（成骨标志物）(d） 和Alcian Blue染色（软骨生成标记物）(e） ●●●●。
人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的特性。(一)使用hUC-MSC表面标记CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR和HLA-G进行流式细胞术分析(b条)亮场显微图像显示纺锤状hUC-MSC。比例尺=100μm。(c（c）–e（电子）)hUC-MSC的分化能力。分别使用油红O、茜素红和阿尔西安蓝检测脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，比例尺分别为100μm、100μm和200μm。
2.2. hUC-MSC组织片的构建和评估
将PLGA支架用作培养支架，以引导hUC-MSC形成组织(a） ●●●●。为了探讨纤维取向对hUC-MSC组织薄片形成的重要性，我们比较了两种PLGA支架，交叉结构和传统排列结构。与交叉型相比，对齐型组织片的厚度更均匀、更平坦(图S1). 因此，我们选择了一种对齐的支架来制作组织片(b） ●●●●。扫描电子显微镜（SEM）图像显示出平行且均匀分布的结构(c） 每根纤维的直径为3622±563nm(d） ●●●●。此外，为了确定制作hUC-MSC组织片的最佳细胞浓度，我们培养了三种不同浓度的MSCs（1×106/2 × 106/ 4 × 106每厘米2)在PLGA支架上，然后评估组织板的厚度(e、 f）。结果表明，构建的组织片厚度随种子细胞浓度的增加而增加。
人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）组织片的构建和评价。(一)体外组织构建示意图。(b条)PLGA对齐光纤的图像。比例尺=2 mm(c（c）)PLGA排列纤维的扫描电子显微镜图像。比例尺=10μm。(d日)PLGA对准纤维中纤维直径的定量分析。(e（电子）)不同细胞密度hUC-MSC组织片厚度的定量分析(（f）). (（f）)不同细胞密度的hUC-MSC组织片的苏木精和伊红染色。比例尺=100μm。(克)hUC-MSC组织片（1×10）中波形蛋白（绿色）的免疫组织学图像6单元格）。比例尺=100μm。(小时)不同细胞密度hUC-MSC组织切片的TUNEL染色。比例尺=100μm。(我)不同组细胞死亡率的定量分析。(j个)不同细胞密度的hUC-MSC组织切片中I型胶原（绿色）和III型胶原（红色）的免疫组织学图像。比例尺=100μm。(k个)定量分析不同组中I型胶原/III型胶原的比率。结果以平均值±标准偏差表示。显著性通过方差分析确定。方差分析*第页< 0.05, **第页<0.01，ns表示无统计学意义。PLGA，聚（丙交酯-聚乙二醇）。
此外，我们进行了TUNEL免疫荧光分析，以检测不同hUC-MSC浓度的组织片中凋亡hUC-MSCs的数量。在含有4×10的组织片组中，TUNEL阳性MSCs的百分比增加到26%6细胞。相比之下，1×106和2×106细胞组的存活率较高（3.4±2.2%和5.7±2.5%，1×106细胞组和2×106细胞组），组间无显著差异(h、 i）。在无瘢痕胎儿伤口愈合中，III型胶原蛋白聚集物的比例较高，而I型胶原蛋白沉积在瘢痕成人伤口中的比例较高[25]. 因此，为了评估不同细胞浓度下的胶原蛋白沉积，对组织片进行了I型和III型胶原蛋白的免疫染色6细胞组高于2×106细胞群；然而，1×10之间没有显著差异6和2×106单元格组(j、 k）。因此，我们选择了1×10的细胞浓度6/厘米2构建组织片并进行移植实验。
2.3. hUC-MSC组织片促进糖尿病创面愈合
我们使用了分贝/分贝建立糖尿病小鼠模型，研究hUC-MSC组织片对糖尿病创面愈合的治疗潜力。在模型小鼠背部造成全厚皮肤伤口，然后在伤口处用hUC-MSC组织片、纤维或hUC-MCC注射进行治疗。我们首先比较了hUC-MSC组织片（1×106和2×106细胞）和对照组（未经处理），观察到组织片处理组显著加快了伤口愈合。有趣的是，1×10的平均伤口闭合率6细胞组比2×10组快6细胞组，且差异显著(第页<0.05）在第10天观察到(图S2a，b). 因此，我们使用了1×106用于后续移植实验的细胞。值得注意的是，hUC-MSC组织片组在创伤后第7、10和14天的伤口闭合效果显著优于其他组。此外，hUC-MSC注射组的伤口闭合效果也优于对照组；然而，只有第10天显示出显著差异。有趣的是，纯纤维组的愈合速度比对照组慢，尤其是在第7天(a） ●●●●。此外，H&E染色显示，与其他组相比，hUC-MSC组织片组的肉芽组织较厚(a、 c），并且有更好的伤口再上皮化(b、 d）。
人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）组织片促进糖尿病创面愈合。(一)受伤后0、7、10和14天的全层切除伤口的代表性照片。(b条)伤后14天，用hUC-MSC组织薄片、纤维和hUC-MSCs注射处理的伤口切片进行苏木精和伊红染色。双头黑色箭头表示伤疤的边缘。比例尺=2 mm(c（c）)定量分析各组的伤口闭合率。(d日)再上皮化程度的定量分析(b条). 结果以平均值±标准偏差表示。显著性通过方差分析确定*第页< 0.05, **第页< 0.01.
2.4. hUC-MSC组织片诱导体内胶原合成
真皮的再生需要由成纤维细胞和肌成纤维细胞介导的胶原结构的重建[25]. 因此，为了进一步证实hUC-MSCs对糖尿病创面愈合的治疗作用，我们使用Masson三色染色法研究胶原沉积。如所示a、 b、与其他组相比，经hUC-MSC组织片或注射治疗的小鼠损伤区域显示出重组良好的胶原纤维；然而，hUC-MSC组织片组表现出比注射组更复杂的胶原纤维结构，具有更厚的胶原束。IF染色(c） I型胶原和III型胶原的含量表明，用hUC-MSC组织片治疗的受伤区域具有较高的III型胶原与I型胶原比率。这一结果与体外实验的数据一致(j、 k）。因此，我们推测使用hUC-MSC组织片可能会导致糖尿病创面无疤痕愈合。
人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）组织片在体内诱导胶原合成。(一)伤后第14天，各组创面切片进行Masson染色。比例尺=100μm。(b条)伤后14天各组胶原纤维沉积定量分析。(c（c）)I型胶原（绿色）和III型胶原（红色）的免疫组织学分析。比例尺=500μm。结果以平均值±标准偏差表示。显著性通过方差分析确定**第页< 0.01.
2.5. hUC-MSC组织片显著促进糖尿病创面新生血管的形成和成熟
为了进一步研究hUC-MSC组织片促进伤口愈合的机制，我们评估了hUC-MCC组织片对伤口愈合的治疗作用是否通过促进血管生成来介导。CD31是毛细血管内皮细胞的特异性标记物，广泛用于评估损伤相关血管生成。A显著(第页与对照组和仅纤维组相比，在hUC-MSC组织片和注射组的伤口中心观察到CD31-阳性细胞数量增加(a、 c）。此外，hUC-MSC注射组CD31-阳性细胞的数量低于hUC-MSC-组织片组，这表明hUC-MCC促进伤口中心的血管生成，而在PLGA支架上培养的hUC-MMC有效地增强了这一作用。有趣的是，在hUC-MSC组织片和注射组之间，伤口边缘CD31-阳性细胞的数量没有显著差异(b、 e）。覆盖有α-SMA阳性壁细胞的CD31-阳性内皮细胞通常用于评估成熟血管。因此，我们进一步分析了这些组中α-SMA的表达。与其他组相比，hUC-MSC组织片组和注射组伤口中心成熟血管密度均显著增加，而伤口边缘成熟血管密度仅在hUC-MSC-组织片组伤口中心和边缘显著增加(a、 b、d、f）。这些结果表明，hUC-MSC组织片能够快速有效地促进糖尿病创面血管的成熟。
人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）组织片显著促进糖尿病创面新生血管的形成和成熟。(一)伤后14天，糖尿病创面中心组织切片的代表性图像（比例尺=500μm和100μm）。(b条)伤后第14天糖尿病创面边缘组织切片的代表性图像（比例尺=500μm和100μm）。(c（c）)伤后14天各组创面中心血管密度的定量分析。(d日)伤后14天各组创面中心成熟血管密度的定量分析。(e（电子）)伤后14天各组创面边缘血管密度的定量分析。(（f）)伤后14天各组创面边缘成熟血管密度的定量分析。结果以平均值±标准偏差表示。显著性通过方差分析确定*第页< 0.05, **第页< 0.01.
2.6. hUC-MSC组织片调节糖尿病创面炎症反应
为了评估移植的hUC-MSC组织片对治疗后第14天巨噬细胞浸润的影响，对伤口组织进行CD68免疫染色，CD68是一种组织巨噬细胞标记物。如所示a、 b，在糖尿病小鼠的伤口部位观察到大量CD68阳性细胞。hUC-MSC组织片组和注射组创面处CD68阳性细胞数量显著低于对照组和单纯纤维组。然而，仅纤维组中的大误差线是因为可用于定量统计的组织太少。此外，两个hUC-MSC组之间未观察到显著差异。总之，这些发现表明，hUC-MSC组织片或注射可以减少糖尿病小鼠局部伤口部位的巨噬细胞数量，可能有助于调节炎症反应和促进糖尿病伤口愈合。
人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）组织片调节糖尿病伤口的炎症反应。(一)伤后第14天各组免疫组织化学切片的代表性图像。比例尺=200μm。(b条)高倍视野图像中CD68免疫组织化学信号的定量分析。在仅光纤组中，只分析非光纤区域。结果以平均值±标准偏差表示。显著性通过方差分析确定**第页< 0.01.
3.讨论
伤口愈合是一个涉及众多分子的复杂生物过程。在此过程中，一个或多个阶段的中断可能导致伤口延迟愈合或无法愈合。尤其是一些慢性或严重的疾病，如烧伤和糖尿病，与严重受损的伤口愈合有关[26]. 这种损伤的伤口愈合主要是由于生长因子减少、血管生成受损和伤口细胞功能降低[27]. 皮肤损伤的传统治疗方法包括粘连伤口敷料、高压氧治疗、负压治疗和自体皮肤移植。然而，这些方法是有限的[28]. 因此，迫切需要为慢性和严重皮肤损伤患者制定创新和有效的治疗策略。
来源于不同组织的间充质干细胞可以促进糖尿病伤口的愈合[29,30]. UC-MSC来源于新生儿组织，可通过非侵入性方法获得。它们具有更强的增殖能力，尤其是在缺氧条件下[31]. 因此，在我们的研究中，我们选择hUC-MSC进行移植，以加速糖尿病创面愈合。
细胞移植最常用的方法是在伤口周围注射单细胞悬浮液。然而，由于缺乏细胞外基质（ECM）和细胞间通讯，这种方法往往导致移植后细胞存活率低，治疗效果有限。在之前的研究中，我们的研究小组报告称，在体外将细胞构建到组织中，然后进行移植，大大提高了体内细胞的存活率，改善了心脏功能和下肢缺血[24,32]. 在本研究中，我们使用基于纤维的支架构建具有3D结构的MSC组织片用于移植。我们假设，组织片不仅可以避免细胞之间的通信中断，而且可以保持ECM的完整性，同时还可以通过3D结构增加移植细胞的数量，从而产生更好的治疗效果。我们的结果证实了这一假设，并表明与传统的单细胞注射相比，移植hUC-MSC组织片可以加快糖尿病溃疡创面的愈合速度，诱导创面中心和边缘的血管生成和成熟，并改善其胶原重塑(). 有趣的是，我们发现仅移植纤维会影响糖尿病创面的愈合率，但对再上皮化、血管生成或胶原重塑没有明显的不良影响(,和). 这可能是因为，如果没有细胞，纤维可能会直接接触并粘附到受影响的部位，从而在伤口愈合过程中防止皮肤收缩。降低纤维密度可以解决这个问题。此外，由于人类的糖尿病伤口不像老鼠的伤口那样收缩，因此在人类糖尿病伤口愈合过程中，这个问题可能可以忽略不计。
此外，我们评估了组织中移植细胞数量的影响，发现用4×106细胞凋亡率高于1×10细胞6和2×106单元格组(). 这是因为组织的厚度超过了营养物质和氧气的扩散极限[33]. 尽管1×10的组织之间的凋亡率没有显著差异6单元格和2×106体外培养细胞，1×10移植组6细胞显示出比2×10更显著的治疗效果6体内细胞群(图S2). 这可能是由于受伤区域的恶劣环境，尤其是在早期，伴随着大量组织液渗出。组织液中还含有大量炎症因子，可能影响移植物与宿主之间的血管结构。如果组织超过适当的厚度，移植物的营养供应可能会受到影响，从而影响伤口愈合的治疗效果，并可能导致更严重的炎症反应。因此，必须仔细选择移植细胞的数量和组织的厚度，以诱导理想的治疗效果。
皮肤再生的典型过程分为四个重叠阶段：炎症、血管生成、细胞增殖和伤口重塑。在细胞增殖阶段，血管生成、胶原沉积、上皮化和伤口收缩同时发生。血管生成对伤口愈合和组织修复至关重要[34]. 我们的数据表明，hUC-MSC组织片促进伤口区域和边缘的血管生成。此外，与单细胞注射相比，hUC-MSC组织片对血管成熟也有明显的影响(). hUC-MSC组织片不仅加速了伤口愈合，而且有效促进了伤口内的上皮化(). 因此，我们的移植策略不仅允许细胞直接接触溃疡伤口，还允许细胞分泌因子直接作用于伤口。此外，这种替代单细胞移植的策略可以保护细胞间ECM的完整性，从而降低细胞丢失率，提高移植后的细胞存活率，并产生更多有助于血管生成的因子。此外，伤口的重塑期在2周到1年以上，与ECM的产生和重组密切相关；因此，它对结疤的程度有重要影响[35]. 在我们的研究中，体外和体内的结果都显示出显著的一致性。在组织片和移植部位观察到大量ECM沉积，III型胶原的比例明显高于I型胶原(和). 这些结果表明，移植的组织片可以抑制伤口区域的瘢痕形成。
慢性组织炎症是糖尿病的公认特征[36]. 因此，创面微环境的改善是创面愈合和组织重塑的关键因素[37]. 此外，MSCs可以发挥抗炎和免疫调节作用[38]. 因此，我们研究了hUC-MSC组织片在糖尿病伤口微环境中的免疫调节功能，发现hUC-MSC组织片通过减少巨噬细胞的浸润来调节伤口微环境。然而，hUC-MSC组织片组和注射组之间没有显著差异(). 这种现象可能是因为两组细胞的数量相同。然而，组织修复和重建需要一定程度的炎症反应，以向伤口区域募集更多的抗炎、促血管生成和其他因子，以促进伤口愈合。
此外，基于MSC的细胞治疗的长期结果和有效性仍需改进。Maksimova和Zhang的研究表明，局部给药MSCs是一种安全且有前景的选择，但它主要在早期的初始伤口闭合中起作用[39,40]. 在这里，我们提供了一种新的方法来提高MSC的有效性，并可能改善未来的长期结果。
4.材料和方法
4.1. PLGA脚手架施工
为了建造脚手架，将PLGA（75/25；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）与六氟-2-丙醇（HFIP，Wako Pure Chemical Industries，Tokyo，Japan）在离心管（1.2 g:3 mL，w个/v（v）)使用自动静电纺丝机（日本福冈MECC，NF-103）合成纤维。将混合溶液装入一个3 mL注射器中，注射器上装有内径为0.6 mm的针头，以连接到高压电源（10 kV）的正极。接地滚筒上贴了一层铝箔。滚筒以1000 rpm的速度旋转，用于收集PLGA脚手架。针尖与滚筒之间的距离保持在15cm。纺纱过程持续120min（对齐型：同方向共120min；交叉型：平行方向60min（0度），垂直方向60min，90度））。然后将纤维片转移到聚二甲基硅氧烷（PDMS）框架（1 cm×1 cm）中，用于随后的细胞接种。构建后，如前所述，使用扫描电子显微镜检查纤维[24].
4.2. hUC-MSC培养
hUC-MSC由Cell Exosomes Therapeutics Co.，Ltd.（日本东京）提供，所有实验均经大阪大学伦理委员会批准。简单地说，细胞在37°C、5%CO的MSCs无氙培养基（日本志贺Takara Bio Inc.）中培养2孵化器。每2-3天更换一次培养基。当达到80-90%的融合率时，使用TrypLE Select（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Gibco）分离细胞进行进一步扩增。所有实验都使用了第5-7代的细胞。
4.3. hUC-MSC的表征
使用流式细胞术（FACS II）进行免疫表型分析。简单地说，在七次传代后，收集hUC-MSC并将其分离成单个细胞，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并用以下荧光结合抗体染色()：抗hCD31-PE、抗hCD34-PE、防hCD45-PE、抗hCD73-PE、反hCD90（Thy1）-PE、反对hCD105-PE、对抗HLA-G-PE、抗HLA-DR-PE和抗HLA-ABC-PE。作为对照，使用小鼠IgG1κ同型对细胞进行染色。抗体购自BioLegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。使用FlowJo软件v 10.5.3（BD，美国新泽西州富兰克林湖）分析数据。
表1
| 抗体名称 | 稀释 | 单位 | 目录# |
|---|
| hCD31型 | 1:1000 | 生物图例 | 303106 |
| hCD34型 | 1:1000 | 生物图例 | 343506 |
| 人CD45 | 1:1000 | 生物图例 | 304008 |
| hCD73型 | 1:1000 | 生物图例 | 344004 |
| hCD90型 | 1:1000 | 生物图例 | 328110 |
| hCD105型 | 1:1000 | 生物图例 | 323206 |
| HLA-ABC | 1:1000 | 生物图例 | 311406 |
| 人类白细胞抗原-DR | 1:1000 | 生物图例 | 307606 |
| 人类白细胞抗原-G | 1:1000 | 生物图例 | 335905 |
| 波形蛋白[D21H3] | 1:100 | 细胞信号 | 5741秒 |
| Ⅰ型胶原蛋白 | 1:100 | Sigma-Aldrich公司 | C2456元 |
| Ⅲ型胶原蛋白 | 1:100 | 阿布卡姆 | 约7778 |
| CD31型 | 1:100 | 阿布卡姆 | 约28364 |
| 肌动蛋白（平滑肌） | 1:100 | 达科 | M0851型 |
| CD68型 | 1:100 | 阿布卡姆 | 约31630 |
分别使用分化培养基（德国海德堡PromoCell）对hUC-MSC的成脂、成骨和成软骨分化潜能进行2周、2周和3周的评估。进行油红O、茜素红S和阿尔西安蓝（Sigma-Aldrich）染色以确认hUC-MSC的分化潜能。
4.4. hUC-MSC组织片形成
hUC-MSC接种在PLGA支架上（1–4×106细胞/厘米2). 在细胞接种过程中以10μg/mL的浓度添加iMatrix-511（日本大阪Matrixome）。然后将样品培养在5%的CO中2移植前37℃加湿3-5天，每2天更换一次培养基。
4.5. db/db小鼠模型的体内伤口愈合实验
根据大阪大学的指导原则进行动物实验，所有使用hUC-MSCs的实验均获得大阪学院伦理委员会的批准（20262（T2）-2）。所有实验均使用男性分贝/分贝(BKS公司。Cg-+Leprdb/+Leprdm/Jcl)小鼠（10周龄，46.2±1.8 g体重；CLEA Japan，Inc.，日本静冈）。监测血糖水平和小鼠(n个=28）血糖水平高于300 mg/dL被诊断为糖尿病。在皮肤创面之前，对糖尿病小鼠进行10天的观察。
使用异氟醚对动物进行麻醉（1.5%；Mylan Inc.，Canonsburg，PA，USA）。剃光小鼠背部毛发后，在其背部造成了两处全厚的切除性皮肤伤口（直径8毫米）。然后将小鼠随机分为四组（每组七只）：（1）不治疗（对照）；（2） 用1×10处理6在PLGA支架（hUC-MSC组织片）上培养的hUC-MSCs；（3） PLGA脚手架处理（仅光纤）；和（4）1×106皮下给药50μL PBS中的hUC-MSC悬浮液（hUC-MCC注射液）。在注射组中，小鼠在五个注射部位（每个部位10μL）皮下注射PBS中的hUC-MSC。在hUC-MSC组织片组和单纯纤维组中，将PLGA支架的PDMS框架切除，并将PLGA片放置在创面上。治疗后，使用透明、半封闭的粘合剂敷料（Tegaderm；3M，Saint Paul，MO，USA）保护伤口。这些老鼠被单独饲养。在受伤后第0、3、7、10和14天拍摄并测量伤口面积。然后使用image ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）对图片进行分析。手术后第14天处死小鼠，采集伤口皮肤组织进行组织学分析。
4.6. 免疫荧光和组织学分析
hUC MSC组织片在4%多聚甲醛中于4°C下固定过夜，以形成冷冻切片。根据制造商的说明（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），使用Click-IT TUNEL试剂盒（Alexa Fluor 647）进行TUNEL分析。进行免疫组织学检查。用一级抗体孵育切片()在4°C下过夜，用PBS洗涤，然后在37°C下与相应的二级抗体孵育1小时。用2-（4-氨基苯基）-1H-吲哚-6-甲酰胺（DAPI）（Invitrogen）或Hoechst 33342（Invitorgen）复染后，用荧光显微镜（BZ-X800，KEYENCE，日本大阪）分析切片和尼康A1共焦显微镜（尼康，纽约，纽约，美国）
每组小鼠伤口处的皮肤样本用福尔马林固定，转移到乙醇中，并包埋在石蜡中。在距离伤口中部5μm厚的位置制备连续切片。切片用苏木精-伊红（H&E）和马森三色染色。对于组织学分析，伤口切片用H&E染色，再上皮化百分比（re%）评估为
其中Wo表示原始伤口长度，Wt表示新生成的上皮细胞穿过伤口表面的长度。
Masson三色染色用于评估胶原成熟度。对于伤口组织的免疫组织学，在PBS中清洗脱蜡石蜡切片，并在121°C的Target retrieval Solution（pH=6；DAKO Japan，Inc.，Tokyo，Japan）中进行抗原提取10分钟。切片按上述方法染色。此外，为了量化成熟血管的数量，CD31、α-SMA和细胞核分别染色为橙色、绿色和蓝色。如前所述，橙色和绿色双重染色代表成熟血管[41,42,43].
4.7. 统计分析
所有定量数据均表示为平均值±标准偏差（SD）。方差分析（ANOVA）或t吨-测试用于评估统计显著性，其定义为第页-值<0.05（显著性设定为*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001).
5.结论
综上所述，我们的研究表明，hUC-MSC组织片可以有效加快伤口愈合速度，改善伤口部位的再上皮化，促进胶原沉积和重塑，促进血管生成和血管成熟，调节受伤区域的免疫微环境。我们的发现为细胞移植提供了一种新的有效方法，也为治疗糖尿病皮肤创伤、烧伤和创伤性皮肤损伤提供了新的策略。
致谢
我们感谢Akiko Tabata在决策制定过程中提供的技术支持。
缩写
| hUC-MSC | 人脐带间充质干细胞 |
| PLGA公司 | 聚（丙交酯-羟基乙酸） |
| 发动机控制模块 | 细胞外基质 |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜 |
| 健康与环境 | 苏木精和曙红 |
资金筹措表
本研究得到了日本科学促进会（JSPS；20H00542，22H03157，22K12801）的支持。这项工作也得到了Cell Exosomes Therapeutics Co.，Ltd.的支持。
作者贡献
概念化，J.Z.、Y.S.、L.L.和S.M。；数据管理，J.Z。；形式分析，J.Z。；融资收购、Y.S.、L.L.和S.M。；调查，J.Z。；方法学，J.Z.、X.Q.和A.H。；项目管理，J.Z.和L.L。；资源、J.Z.、X.Q.、J.L.、A.H.、Y.H.、N.Y.和M.I。；监理、J.L.、L.L.和S.M。；书面原稿，J.Z。；所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。
机构审查委员会声明
大阪大学伦理委员会批准了所有使用hUC-MSC的实验（20262（T2）-2）。所有动物实验均按照大阪大学的指导方针进行。
知情同意书
不适用。该研究不包括人类受试者；因此，该出版物没有考虑知情同意或人权。
数据可用性声明
本研究中生成和/或分析的所有数据均包含在本文中。
利益冲突
Yoshiki Sawa是Cell Exosomes Therapeutics Co.，Ltd.的首席顾问。作者声明，他们没有相互竞争的非财务利益。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
工具书类
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