丝胶蛋白的异位表达使家蚕能够通过结构变化高效生产古丝绸

突变蚕表现出丝纤维结构重排和性能改善

突变家蚕产生的蚕丝纤维在EGFP与SER3融合后显示出绿色荧光。从蚕丝纤维的横截面观察，荧光分布不均匀，在丝素层和丝胶层之间出现强烈的荧光（图2a个). 激光共聚焦显微镜的结果更清楚地表明，丝素区的重组SER3蛋白以不同大小的颗粒存在。可测量的粒径为0.05–0.50μm，颗粒分布不均匀，主要分布在丝素层和丝胶层之间，然后是丝素纤维之间（图2亿). 用透射电子显微镜（TEM）观察了蚕丝纤维的纵向截面。SER组的大量SER3-EGFP微粒体（SM）分散在丝素蛋白区。SM的形状为雨线状或纺锤状，在成熟幼虫纺丝过程中，形状的变化方向与蚕丝蛋白胶体在挤压下的运动方向相同。值得注意的是，在SM中，观察到不同大小和形状的低密度丝蛋白水溶液的液泡（图2厘米). 横截面TEM图像进一步证实了突变丝纤维中存在SM和液泡（补充图^三). 采用经典的蚕丝脱胶方法，测定了蚕丝中的丝胶含量。SER组茧丝中的丝胶含量比WT组高7.39%（图第二版)增长21.8%。以P25为内标物，采用蛋白质印迹法测定茧丝中SER3的含量。突变体中的SER3含量（天然加重组SER3）是WT中的3倍（图第2页). 我们的结果表明，突变家蚕的PSG非常有效地合成了SER3蛋白，并成功地将其分泌到蚕丝纤维中。

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图2

PSG合成的SER3重组蛋白在茧丝中的分布及其对纤维结构的影响。

观察到的蚕丝纤维图像一荧光显微镜和b条激光共聚焦显微镜。由PSG合成的SER3重组蛋白在丝纤维中的EGFP荧光定位。c（c）纵向丝绸纤维截面的透射电子显微照片。由PSG合成的SER3蛋白分散在丝纤维的原纤维中。d日蚕丝纤维P25蛋白的免疫荧光定位。图2a至图2d:WT-L和SER-L，丝绸纤维的纵向截面；WT-C和SER-C，蚕丝纤维的横截面；R-生丝；D-蚕丝，脱胶蚕丝。SF，丝素层。SS，丝胶层。丝素原纤维中的丝胶蛋白微粒体。真空，液泡。e（电子）采用经典脱胶方法测定了蚕茧丝中丝氨酸的含量。数据以平均值±SEM表示，未配对t吨-两组之间的比较采用测试分析。n个 = 3个茧。（f）用蛋白质印迹法测定茧丝中SER3蛋白的含量；P25为内部参考。n个 = 3.EGFP定位结果表明，重组SER3蛋白具有单倍体和二聚体2型，二聚体是主要类型。数据以平均值±SEM表示。除非另有说明，否则图像数据代表三个独立实验。

利用免疫荧光技术，我们观察到WT丝纤维中的P25蛋白均匀分布在丝原纤维区，而SER丝纤维几乎所有的P25都转移到丝原纤维外面，并且在丝素层和丝胶层之间分布不均匀，具有不同的微粒体尺寸（图二维). 我们的研究结果表明，SER蚕丝纤维中的P25与包含Fib-H/Fib-L/P25聚合物的蚕丝蛋白分离，从而表明蚕丝蛋白中的有序纤维结构受到PSG中合成的SER3蛋白的影响而发生了很大改变。

分析了蚕丝纤维的氨基酸组成。我们观察到SER和WT茧丝的氨基酸组成没有差异。但是，含有丝胶蛋白的蚕丝纤维显示出各种氨基酸的相对含量发生了变化，例如丝氨酸和天冬氨酸的相对含量增加，甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸的相对含量降低。去除外层丝胶后，纺织原料用蚕丝纤维（丝素）中丙氨酸含量仅增加1.7%（WT中29.9%，SER中30.41%），其他氨基酸的相对含量几乎没有变化（补充表²)，因为丝素蛋白的Fib-H/Fib-L/P25聚合物的氨基酸组成与SER3的相同，并且相对含量也相似（补充表^三).

分析了去除外丝胶后丝素纤维的力学性能。应力和应变曲线表明，SER组的拉伸初始模量显著增加，从73.48 MPa增加到110.93 MPa，比WT组高1.51倍（图3a年). 最大应力水平（图3亿)和杨氏模量（图三维)SER组也显著高于WT组。只有最大弹性模量没有统计上的显著变化（图3立方厘米). SER组丝素纤维的吸湿和解吸性能显著改善。吸湿曲线（图第三版)和水分释放曲线（图3克)SER组的蚕丝纤维含量与WT组非常相似。吸湿恢复率和水分释放率分别比WT组高22.0%和8.0%。0–1分钟内的水分吸收率和水分释放率为142.5–139.4%（图第3页)和165.5-164.1%（图3小时)分别为WT组。

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图3

PSG分泌的SER3蛋白改善了蚕丝纤维的物理性能。

一–d日纤维机械性能。从茧（20个WT或SER茧）上缫丝20/22 dtex生丝：在100-200米之间每隔3-4米取一个样品，以确定机械性能。n个 = SER有22个茧，WT有27个茧。一应力和应变曲线。b条压力水平。c（c）弹性模量。d日杨氏模量。数据以平均值±SEM表示，未配对t检验分析用于(b-d（英国）).e（电子）–小时吸湿和解吸性能。将蚕茧中提取的单丝与0.2%的碳酸钠煮沸30分钟，去除外层丝胶蛋白，得到纺织丝素纤维。e（电子）吸湿率（恒温恒湿条件：20℃±2℃，相对湿度65%±3%）。（f）吸湿速度。WT和SER丝素纤维样品的拟合曲线方程为v=12.276–12.163e-0.0756t，R2=0.9966；v=13.470–13.370e-0.0980吨，R2=0.9954。t、 时间。克水分释放率（恒温恒湿条件：20°C±2°C，相对湿度100%）。小时水分释放速度。WT和SER丝素纤维样品的拟合曲线方程为v=12.353+17.619e-0.03381t，R2=0.9977；v=13.184+23.552e-0.04187吨，R2=0.990。t、 时间。i、 j个蚕茧的扫描电子显微镜（SEM）表征(我)和丝素纤维(j个). 除非另有说明，否则图像数据代表三个独立实验。k个茧丝的XRD图谱。我茧丝结晶度。米茧丝的SAXS衍射图。n个SAXS衍射数据。数据以平均值±SEM表示。n个 = 3个样品(e（电子）–n个).

SEM表征表明，SER茧丝层中蚕丝纤维之间的粘附更紧密，气孔比WT中的小（图第3页). 用碱法去除丝胶后，SER组的丝素纤维表面更光滑，观察到的原纤维损伤比WT组少（图第3页). 结果表明，SER组蚕丝纤维的脱胶损伤程度低于WT组。

根据茧丝的结晶峰位置，丝素纤维的结晶衍射峰在9.0°、20.4°和29.1°左右（图3公里). 计算的相对结晶度结果表明，WT和SER组的丝素纤维结晶度分别为36.62%和42.29%（图3升)从而表明SER组的丝素纤维结晶度更高。

SAXS测试结果显示，二维图像接近双楔形（图。​（图3m），300万)其中SER组的短直径比WT组的长，表明SER和WT茧丝纤维都是各向异性的，但两种材料在X射线透射前后的电子密度变化不同。散射强度曲线显示，在0.1°−0.6°的角度范围内，离散强度存在显著差异（图。​（图3n），3个)因此，这表明突变蚕丝和WT蚕丝在纳米尺度上周期结构（例如丝素原纤维）的结晶和非结晶区域的电子密度不同。

显微镜观察

用扫描电子显微镜（SEM）对蚕茧的中茧层和脱胶丝纤维进行了观察。喷涂电流为20 mA，铂真空喷涂3 min。样品在室温下通过SEM（S4800，日本日立）进行观察，并对三个独立样品进行重复观察。蚕丝纤维在0.2%Na中脱胶和煮沸₂一氧化碳_三同时，用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察EGFP的绿色荧光，以追踪重组SER3蛋白在茧丝纤维和丝腺组织（切片）中的分布。

使用透射电子显微镜（TEM）观察生丝样品和SG组织。样品在4°C下预冷，并用电子显微镜固定剂（G1102，Servicebio，中国武汉）固定2 h，然后用1%锇酸固定2–4 h。固定样品在4℃下用乙醇梯度（50、70、80、90、95和100%）脱水°C，然后用100%乙醇和100%丙酮脱水两次，每次脱水持续15分钟。包埋和切片（厚度60–80 nm）后，进行铀铅双重染色（2%乙酸铀酰饱和乙醇溶液和柠檬酸铅）15在室温下干燥样品，然后通过TEM观察（HT7700，日本日立）。

蚕丝纤维性能测试

在恒温恒湿（20°C，相对湿度65%）的房间内，使用通用材料试验机（3365，Instron，USA）测量机械性能。试验条件如下：初始长度为250 mm；拉伸速度，250 mm/min。共有20个WT或SER茧在水中煮沸，并在缫丝前完全膨胀，以获得生丝。每根生丝的缫丝茧数为10个茧，缫丝速度为44-46m/min。所得生丝纤维保留了大部分丝胶，每3米取一个样品，大约在100-200米之间，以测定机械性能。SER组共测量了22个样本，WT组测量了27个样本。

吸湿性测试

脱胶后，蚕丝纤维(n个 = 将3个样品）在80°C下干燥至恒重，然后恢复至正常温度（20°C），以便准确称量。在恒温恒湿（20℃±2℃，相对湿度65%±3%）的房间中测定吸湿性能，每10分钟测量一次重量，直到纤维达到吸湿平衡。当测量水分释放性能时，首先将样品置于R.H.100%容器中并密封24小时，以便纤维达到吸湿平衡（W0）。然后将纤维置于恒温恒湿箱（20℃±2℃，相对湿度65%±3%）中，持续监测质量变化，直到纤维达到水分平衡。水分回收率表示为单位质量的丝纤维在不同时间段所吸收或释放的水分质量相对于原始纤维质量的百分比。吸湿率和水分释放率表示为一定时间内单位质量的丝绸纤维吸收或释放水分的质量，根据前面描述的方法⁴¹.Origin2018软件用于计算随时间恢复水分的拟合曲线方程的相关常数。

广角X射线衍射（WAXD）

使用D8 Advance X射线衍射仪（德国布鲁克）鉴定丝素原纤维样品中的结晶相。扫描时，将丝素原纤维切成小块，置于样品台上，在40 kV和40 mA（Cu靶）条件下以0.04°/s的速度从4°扫描到60°（2θ）。在MDI jade 9软件中计算了样品的相对结晶度。在反褶积过程中，根据文献报道的数据确定结晶峰的数量和位置，并通过基线校准、反褶聚和Pearson IV策略的峰拟合计算峰面积。样品的结晶度按以下公式计算：结晶度=（衍射峰净面积/衍射峰净区域+背景面积）×100%。

小角度X射线散射（SAXS）

以CuKα为靶标，通过在（Nano in Xider，Xenocs，France）上进行的SAXS测量茧丝。将中间层茧壳的样品在25°C下装载到多孔样品架中，并暴露200 s，以在938 mm的样品与检测器距离处进行单独测量⁻¹至0.45º⁻¹波长为1.54º。在FIT2D和OriginPro 2022b软件中进行统计分析。

基因表达分析

用RNAiso Plus（9109，TaKaRa，Dalian，China）从家蚕5龄第3天（5L3d）的PSG组织中提取总RNA。根据制造商的说明，使用带有gDNA橡皮擦（Perfect Real Time）（RR047A，TaKaRa，中国大连）的PrimerScript™RT试剂盒合成cDNA。qRT-PCR在20μL总反应体积下与TB Green®进行预混料Ex Taq™（Tli RNaseH Plus）（RR420A，TaKaRa，中国大连），并使用ABI Stepone Plus（Ambion，Foster City，CA，USA）进行检测。这个英国卢比49选择基因作为内部对照。补充表中列出了本研究中使用的底漆⁴.

P25免疫荧光分析

按常规方法制作茧丝纤维石蜡切片。脱蜡后，将切片在96°C的0.01M柠檬酸缓冲液中浸泡15分钟以进行抗原修复，并将切片暴露在封闭溶液中40–60分钟。将P25抗体添加到切片的组织表面，并在室温下培养1小时。用PBST冲洗切片三次，共5次每个最小值。然后添加TRITC标记的二级抗体（S0015，Affinity Biosciences，Ohio，USA），在室温下孵育1小时，然后在黑暗中用PBST洗涤三次，每次5分钟。用荧光显微镜观察到红色荧光（日本东京奥林巴斯BX51）。

蛋白质印迹

将总计0.5 g蚕丝添加到2 mL 9.3 M溴化锂溶液中，并在60°C下完全溶解4–6 h。使用BCA蛋白质检测试剂盒（P0012，中国上海贝尤泰姆）测量总蛋白质浓度。用10%SDS-PAGE电泳100μg质量的总蛋白，然后转移到PVDF膜上。在25°C下封闭2 h后，将一级抗体，包括兔抗SER3和兔抗P25（由武汉基因创造生物工程有限公司合成）、小鼠抗EGFP抗体（ab184601，abcam，UK）和小鼠抗β-Tubulin（ab108342，abcam，UKh、 分别是。用TBST清洗膜三次。添加HRP标记的山羊抗兔IgG或HRP标记山羊抗鼠IgG（美国明尼阿波利斯生物世界科技公司），并在37°C下培养2小时。在黑暗条件下，1将mL EZ-ECL化学发光试剂添加到膜中，1分钟后通过化学发光检测（1708370，Bio-Rad，USA）观察带。图像通过Image Lab（Bio-Read，USA）分析。初级抗体的稀释度为1:2000，次级抗体的稀释率为1:5000。所有原始斑点都显示在源数据中。

统计和再现性

除非另有说明，否则每个组织样本都是从至少三个人身上采集的，每个样本测量三次。每个实验独立重复三次，结果相似。除非另有说明，否则图像数据代表三个独立实验。数据通过GraphPad Prism（v8.0.2，GraphPat）进行统计分析和图形化表示，并显示为平均值±标准平均误差（SEM），显著性阈值设置为第页 = 0.05. 未成婚者t吨测试分析仅用于一组的比较，Holm–Sidak方法用于多组t吨-用于比较三个或更多组的测试分析，以及第页所得值为调整后的p值。

这项工作得到了国家自然科学基金（S.X.批准号31972625，Y.-F.W.批准号32102608，Y.-J.W.批准号31972873）、财政部和MARA的中国农业研究系统（Y.S.）、江苏省高等学校优先学术计划发展（PAPD to S.X.）、，江苏省博士后科研基金计划项目（2021K321C至Y.-F.W.）、南通市科技项目（JC2021010至Y.-F.W.）。我们感谢刘安琪（Anqi Liu）和孙晓宁（Xiaoning Sun）在制作SG生产茧丝示意图方面的帮助。