重复有丝分裂早期DNA合成的显微检测拉科人类细胞中的序列

摘要

背景

细胞周期的一个基本原则是确保有丝分裂伴随着DNA复制的完成。在S期，各种复制应激，如DNA损伤、与转录的冲突以及紧密结合的蛋白质复合体，干扰DNA复制并导致与各种遗传疾病相关的基因组不稳定(穆尼奥斯和梅恩德斯，2017年). 为了防止或减少复制应激的有害后果，细胞已经进化出DNA损伤反应机制，包括DNA修复途径(吉田和藤田，2021年). 停滞的复制分叉激活停止细胞周期进程的检查点路径(Lemmens和Lindqvist，2019年;莫卡努和陈，2021年). 然而，研究表明，在温和的复制应激下（适度减缓复制叉），细胞可以进入有丝分裂，其中含有一些复制不足的DNA（Lukas等人，2011年；Bertolin等人，2020年；Lezaja和Altmeyer，2021年;Mocanu和Chan，2021年). 轻微的复制应激会导致复制不完全，而不会激活G2/M检查点，特别是在难以复制的区域，如染色体脆性位点、着丝粒和端粒(Sarlós等人，2017年； 奥泽和希克森，2018年； Lokanga等人，2021年). 这些DNA重复不足的区域在有丝分裂早期激活有丝分裂DNA合成（MiDAS）以完成DNA复制，而一些区域仍然不完整，将在随后的细胞周期中解决(Minocheromji等人，2015年； 奥泽和希克森，2018年； Bertolin等人，2020年； Lezaja和Altmeyer，2021年).

MiDAS是一种同源定向修复DNA合成，涉及修复停滞的复制中间产物和POLD3（聚合酶δ的一个辅助亚单位）依赖的保守DNA合成，类似于断裂诱导复制(Kockler等人，2021年； Epum和Haber，2022年). MiDAS检测的基本协议最初由Hickson及其同事开发(Minocheromji等人，2015年;Bhowmick等人，2016年;Garribba等人，2018). 简单地说，用低剂量（0.4μM）蚜虫灵和RO-3306处理细胞。Aphidicolin是一种DNA聚合酶抑制剂，可减缓DNA复制并诱导复制不足，而RO-3306是一种细胞周期素依赖性激酶1抑制剂，可将细胞阻滞在G2期。然后，在核苷类似物乙炔脱氧尿苷（EdU）存在下，将细胞释放到有丝分裂状态，以标记新合成的DNA。点击反应后，通过荧光显微镜观察到MiDAS为EdU聚焦于前期染色质。

在这里，我们描述了一种在重复引起的复制不足区域检测MiDAS的详细方法拉科人类U2OS 40-2-6细胞中的序列(图1). U2OS 40-2-6细胞，一种携带拉科阵列和雌激素受体（ER^T2段)–融合LacI基因，用于研究人类染色体上紧密的DNA-蛋白质复合物诱导的复制应激对DNA损伤的反应(Ishimoto等人，2021年). 用4-羟基三苯氧胺（4-OHT）治疗可快速形成拉科–干扰DNA复制的LacI复合物。值得注意的是，我们还发现，即使没有LacI拉科序列在本质上很难复制，在有丝分裂之前，其重复性仍然不足，从而触发MiDAS。在这里介绍的方法中，新生DNA由另一种核苷类似物溴脱氧尿苷（BrdU）标记，并且拉科通过结合到阵列上的LacI蛋白的免疫染色来显示阵列。在我们的ER–LacI诱导系统中，复制应激是使用序列特异性DNA结合蛋白在特定的染色体位点诱导的。因此，使用普通免疫染色方法可以很容易地检测到特定位点的MiDAS，而无需使用Hickson及其同事开发的方案中使用的荧光原位杂交（FISH）。该方案可以针对MiDAS功能的其他重复性脆弱位点进行优化，例如端粒、着丝粒和核糖体DNA阵列。

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图1。

有丝分裂DNA合成检测的流程图拉科数组。

材料和试剂

1. Lab-Tek II，4孔室玻璃载玻片（Thermo Fisher，Nunc，目录号：154526）
2. 腔室拆卸工具（包括腔室滑块）
3. 玻璃科普林罐，5片式（AsOne，目录号：4-567-01）
4. 注射过滤装置，PES 0.22μm（Merk Millipore，目录号：SLGPR33RS）
5. 注射过滤装置，PVDF 0.45μm（Merk Millipore，目录号：SLHVR33RS）
6. 矩形盘（Eiken Chemical，目录号：AW2000）
7. 棉签
8. 纸巾（日本Crecia纸巾，目录号：37105）
9. 玻璃盖玻片，24×60 mm（松下玻璃，目录号：C024601）
10. 指甲油（透明面漆）
11. 人细胞系U2OS 40-2-6(Ishimoto等人，2021年)，一种携带拉科阵列和ER^T2段-U2OS 2-6-3细胞产生的LacI基因(Janicki等人，2004年). U2OS 40-2-6单元和原始U2OS 2-6-3单元包含大约200个拷贝的256个数组拉科重复（大约50000份拉科序列总数）。该阵列稳定地整合到1号染色体的1p36染色体位点中。
12. Dulbecco改良Eagle's培养基（D-MEM）（含L-谷氨酰胺的高糖）（例如Wako，目录号：043-30085）
13. 胎牛血清（FBS）（例如，Nichirei，目录号：175012）
14. RO-3306（例如，Sigma-Aldrich，目录号：SML0569）
15. 4-羟氨苄（4-OHT）（例如，Abcam，目录号：ab141943）
16. 乙醇（例如，Nacalai Tesque，目录号：14713-53）
17. 10×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如Wako，目录号：048-29805），稀释至1×
18. 溴脱氧尿苷（BrdU）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：B5002）
19. 盐分（例如大冢正常盐分、大冢制药）
20. 管道（例如，Dojindo，目录号：347-02224）
21. 0.1 M EGTA-2Na溶液（例如，Nacalai Tesque，目录号：37346-05）
22. Triton®声波风廓线仪X-100（例如Wako，目录号：169-21105）
23. 氯化镁₂（例如，Wako，目录编号：133-00165）
24. 37%甲醛溶液（例如Nacalai Tesque，目录号：16223-55）
25. 自制兔抗LacI抗体(Ishimoto等人，2021年)
26. 硫柳汞（例如Nacalai Tesque，目录号：21624-74），用水溶解至10%（w/v）
27. Alexa 594驴抗兔IgG（分子探针，目录号：A21207）
28. 甲醇（例如，Nacalai Tesque，目录号：21915-93）
29. HCl（例如Wako，目录号：080-01066），稀释至1 M
30. 小鼠抗BrdU抗体，克隆号：3D4（BD Pharmingen，目录号：555627）
31. Alexa 488山羊抗鼠IgG抗体（分子探针，目录号：A11029）
32. 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（例如，Wako，目录号：043-18804）
33. Fluoro-KEEPER防褪色试剂（Nacalai-Tesque，目录号：12593-64）
34. RO-3306储备溶液（见配方）
35. 4-OHT原液（见配方）
36. BrdU原液（见配方）
37. PTEMF缓冲区（见配方）
38. 抗体工作液的FBS（见配方）
39. 抗体工作溶液（见配方）
40. DAPI原液（见配方）

    注：在我们的实验室中，我们通常使用DAPI、Alexa 488和Alexa 594对DNA和两种感兴趣的蛋白质进行三重染色。可能存在其他荧光团组合。

设备

1. 细胞培养箱（ASTEC，型号：SCA-165D）
2. 吸水器（例如FLINN scientific，型号：AP1136）
3. 宽视野荧光显微镜，配备冷却CCD摄像机、LED照明源和滤光片，用于拍摄Alexa 488、Alexa 594和DAPI（例如，Keyence、BZ-X700）。类似的传统荧光显微镜也适用。
4. 40×物镜[例如，尼康，CFI（无色差无限大）平面Apoλ40×/0.95 NA]。也可以使用放大倍数更高的物镜，例如63倍透镜。

软件

1. 显微镜操作软件（例如，Keyence，BZ-X查看器软件）

程序

1. 细胞同步化和诱导LacI结合
   1. 平板U2OS 40-2-6细胞，4×10⁴细胞置于0.5 mL D-MEM培养基中，每孔4孔室载玻片补充8%FBS，使细胞第二天融合50%-60%。
   2. 在含有5%CO的细胞培养箱中培养细胞₂在37°C下过夜。
   3. 将RO-3306添加到每个孔中添加8%FBS的D-MEM培养基中，使最终浓度达到7μM。
   4. （可选）为了诱导S相中的LacI结合，添加4-OHT至最终浓度1μM。

      注：S期LacI结合诱导额外的复制应激；然而，它不会增加MiDAS的频率，可能是因为MiDAS容量有限(Ishimoto等人，2021年).

   5. 在37°C下用RO-3306培养细胞20小时，以使细胞在G2晚期同步。
   6. 培养16小时后，为了在G2期诱导LacI结合，添加4-OHT至1μM的最终浓度（在RO-3306存在下用4-OHT处理4小时），用于剩余的4小时RO-3306。
2. 释放到有丝分裂中并用BrdU标记
   1. 培养20小时后，细胞现在处于G2晚期。
   2. 用1 mL 1×PBS清洗细胞三次，预热至37°C，以去除RO-3306。
   3. 添加0.5 mL预先加热的D-MEM培养基，补充8%FBS。
   4. 同时，将BrdU添加到最终浓度10μM，以标记新生DNA。
   5. 在37°C下培养细胞20分钟，使细胞进入前期。

   注意：快速清洗和处理细胞，以限制暴露在室温（RT）下，这可能会干扰细胞周期的进展。预温PBS和D-MEM至37°C对于快速同步进入有丝分裂也至关重要.

3. LacI的细胞固定、渗透和免疫染色
   1. 用带有黄色尖端（200μL）的吸水器轻轻去除生长介质。
   2. 小心地向每个孔中添加1mL冰镇PBS。
   3. 轻轻地去除PBS，并小心地加入1mL PTEMF缓冲液，以同时固定和透化细胞。
   4. 室温下培养20分钟。
   5. 吸入PTEMF缓冲液并从玻璃滑块上拆卸腔室。拆卸时小心不要使电池变干。

      注：玻璃载玻片可以用手搬运，但应使用镊子从科普林罐中的溶液中取出并转移载玻片。

   6. 通过将载玻片浸入含有50mL冰冷PBS的Coplin罐中洗涤载玻片，三次，每次5分钟。
   7. 将载玻片面朝上放置在一个矩形盘子中，并用棉签清除水井周围疏水区域中多余的PBS。不要让细胞变干。
   8. 向每个孔中添加95μL主要抗LacI抗体溶液（稀释1:500，见配方）。
   9. 关闭矩形培养皿的盖子，在室温下培养1小时。
   10. 在纸巾上倾斜载玻片，轻轻排空抗体溶液。
   11. 用冰镇PBS在Coplin罐中清洗载玻片三次，每次5分钟。
   12. 将载玻片面朝上放在长方形盘子中，用棉签去除多余的PBS。不要让细胞变干。
   13. 向每个孔中添加95μL Alexa 594二次抗兔抗体溶液（1:1000稀释，见配方）。
   14. 关闭矩形培养皿，在室温下培养1小时。
   15. 从现在开始，将样品遮住，避免荧光染料的光漂白。
4. BrdU的复性、DNA变性和免疫染色
   1. 在纸巾上倾斜载玻片，轻轻排空抗体溶液。
   2. 用50毫升冰镇PBS在科普林瓶中清洗载玻片，每次清洗三次，每次5分钟。
   3. 将载玻片浸入含有100%甲醇的科普林罐中（在-30°C的冷冻柜中预冷过夜），在工作台上（室温下）浸泡10分钟，以重新放置样品。
   4. 用50毫升冰镇PBS在科普林瓶中清洗载玻片，每次清洗三次，每次5分钟。
   5. 为了使DNA变性，将载玻片在含有50 mL 1M HCl的Coplin罐中在室温下浸泡15分钟。

      注：BrdU的免疫染色需要DNA变性；然而，过多的HCl处理可能会导致步骤E3的DAPI染色较弱。

   6. 在Coplin罐中用冰镇PBS清洗载玻片三次，每次5分钟。
   7. 将载玻片面朝上放在长方形盘子中，用棉签去除多余的PBS。不要让细胞变干。
   8. 向每个孔中添加95μL初级抗BrdU抗体溶液（稀释1:200，见配方）。
   9. 关闭矩形培养皿，在室温下培养1小时。
   10. 在纸巾上倾斜载玻片，轻轻排空抗体溶液。
   11. 在Coplin罐中用冰镇PBS清洗载玻片三次，每次5分钟。
   12. 将载玻片面朝上放在长方形盘子中，用棉签去除多余的PBS。不要让细胞变干。
   13. 向每个孔中添加95μL Alexa 488次级抗鼠抗体溶液（稀释为1:1000，见配方）。
   14. 关闭矩形培养皿，在室温下培养1小时。
5. DAPI染色和安装
   1. 在纸巾上倾斜载玻片，轻轻排空抗体溶液。
   2. 在Coplin罐中用50mL冰冷的PBS洗涤载玻片，三次，每次5分钟。
   3. 将载玻片在装有DAPI工作溶液（0.2μg/mL，避光）的Coplin罐中，在室温下浸入PBS中15分钟。
   4. 用50毫升冰镇PBS在科普林瓶中清洗载玻片，每次清洗三次，每次5分钟。
   5. 将载玻片面朝上放在纸巾上，用棉签去除多余的PBS，注意防止细胞变干。
   6. 在玻片的每个孔中添加一滴Fluoro-KEEPER防褪色试剂。
   7. 使用玻璃盖玻片安装，确保避免出现气泡。
   8. 擦去盖玻片边缘多余的Fluoro-KEEPER防褪色试剂。
   9. 在盖玻片边缘用指甲油密封，让其干燥并在室温下固化至少2小时或一夜。
   10. 进行显微镜检查或将载玻片在4°C下保存1-2个月，并避光保存。
6. 图像采集
   1. 使用荧光显微镜对载玻片进行成像。
   2. 使用DAPI通道找到包含前期/中期细胞的区域，并使用Alexa 594通道聚焦LacI病灶。
   3. 在相同的场位置连续采集每个通道（DAPI、Alexa 488和Alexa 594）的图像，而不改变焦距(图2).
      

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      图2。

      有丝分裂DNA合成的代表性图像拉科数组。

      白色箭头表示LacI和BrdU的共定位。比例尺=10μm。

   4. 评估MiDAS在拉科阵列，计算BrdU病灶与拉科数组。具有LacI焦点的前期/前期细胞核的数量和BrdU信号在LacI焦点上形成焦点的细胞核的频率被手动评分。尽管在这种情况下前期/前中期细胞富集，但BrdU病灶与拉科病灶可见于早期/中期和中期细胞。相反，正如之前报道的那样，在G2阳性细胞（未从RO-3306中释放）中未检测到BrdU掺入(Ishimoto等人，2021年).

      注：这些图像应与没有BrdU标记的对照分析进行比较(图2，底部）以确认BrdU信号的特异性。

食谱

1. RO-3306原液

   将RO-3306溶解在二甲基亚砜中，使其储存浓度达到1 mM，并将等分样品储存在-80°C下。使用前预热至37°C。

2. 4-OHT储备溶液

   将4-OHT溶解在100%乙醇中，使其储备浓度达到125μM，并将等分样品储存在-30°C下。使用前预热至37°C。

3. BrdU原液

   将BrdU溶解在盐水中，使其储备浓度达到10 mg/mL（32.5 mM），并将等分样品储存在-80°C下。

4. PTEMF缓冲器

   20 mM管道，pH 6.8

   10毫米EGTA

   0.2%Triton®声波风廓线仪X-100

   1 mM氯化镁₂

   4%甲醛

   注：制备不含甲醛的溶液，用0.22μm过滤器过滤，并在4°C下储存。每次实验新鲜加入甲醛。

5. 抗体工作液FBS

   将硫柳汞添加到FBS中，浓度为0.1%，并用0.45μm过滤器过滤。储存在4°C或-30°C下，以便长期储存。

6. 抗体工作溶液

   将抗体在1×PBS中稀释，加入10%的FBS。为每个实验重新准备。

   1. LacI的检测

      一抗：兔抗LacI，1:500

      二级抗体：Alexa 594抗兔，1:1000

   2. BrdU的检测

      一抗：小鼠抗BrdU，1:200

      二级抗体：Alexa 488抗小鼠，1:1000

7. DAPI储备溶液

   将DAPI溶于水中，浓度为1 mg/mL，避光。储存温度为-30°C。

鸣谢

竞争性利益

作者声明没有冲突的利益。

引用

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