蛋白组学研究表明，Toll样受体2信号通路激活对乙型脑炎病毒感染小鼠小胶质细胞高效炎症反应的影响

摘要

介绍

日本脑炎病毒（JEV）属于黄病毒科(Seo等人，2013年). 虽然JEV在世界许多地区流行，但在亚洲次大陆的发展中国家流行率很高(所罗门，2006).

日本脑炎病毒跨越血脑屏障，对中枢神经系统（CNS；Wang等人，2018年). 小胶质细胞是中枢神经系统薄壁组织中的常驻巨噬细胞，是抵御病原体入侵的第一道防线，在炎症反应中发挥着重要作用。当病原体入侵时，小胶质细胞被迅速激活，炎性细胞因子被释放以介导炎症反应。小胶质细胞的大量激活是脑内JEV感染的特征之一。在JEV感染小胶质细胞期间，一些炎症因子的释放，如iNOS、TNF-α、IL-1β和CCL3，触发炎症反应，加剧神经炎症和神经细胞死亡(Lannes等人，2017年). 这些炎症反应是由小胶质细胞表面的模式识别受体（PRR）诱导的，包括识别病原体相关分子模式（PAMPs）的Toll样受体。Toll样受体检测并摧毁侵入中枢神经系统实质的病原体(Mariani和Kielian，2009年)并触发炎症介质的产生(波克和鲁兰，2012年).

以前的报告表明，JEV感染会引起炎症反应通过TLR3级(Jiang等人，2014年). 然而，JEV感染是否只通过TLR3途径引起炎症反应是一个值得关注的问题。先前的研究表明TLR2介导寄生虫诱导的炎症反应(Wei等人，2021年)尽管TLR2介导的JEV感染炎症反应的机制尚未阐明。JEV感染后TLR2及其下游途径的激活仍有待研究。包括日本脑炎在内的嗜神经黄病毒能够通过TLR信号通路参与机体的免疫反应。TLR2与PI3K/AKT通路的相互作用已在许多领域得到证实，包括炎症反应和自噬的调节(Jiang等人，2017年)，防止急性肾损伤(Shen等人，2019年)，蛋白质合成(Jing等人，2016)以及抗原提呈细胞和T细胞的激活(Cho等人，2018年). 先天免疫反应在JEV感染的初始控制中也起着关键作用，并导致炎症过程(Paun和Pitha，2006年). 然而，目前的研究并没有描述导致JEV感染的小胶质细胞炎症反应的先天免疫途径。

在本研究中，我们应用蛋白质组学技术全面鉴定JEV感染后小胶质细胞中激活的蛋白质。我们研究了在JEV感染期间表达发生显著变化的TLR2的表达，并验证了其下游PI3K-AKT通路，以充分描述其在激活炎症反应中的作用。我们的研究进一步了解了JEV诱导的小胶质细胞炎症，并通过提供减少JEV感染后脑内损伤的选项，为今后预防炎症诱导的神经元损伤提供了基础。

材料和方法

结果

日本脑炎病毒感染后BV2细胞中蛋白质组表达差异

我们在感染后6 h（hpi）、12 hpi、24 hpi感染JEV的BV2细胞和模拟组中通过MS对DEPs进行了蛋白质组研究。箱线图用于描述重复之间蛋白质定量数据的相对标准偏差（RSD），较低的总体RSD值表示较高的定量再现性(图1A).

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图1

（A）箱线图显示了各重复组蛋白质定量结果的相对标准偏差（RSD），总体RSD值较低表示定量再现性较高。（B）212个DEPs在6 hpi时上调。（C）754个DEP在12hpi时上调。（D）191个上调了24 hpi的DEP。

经过质量检查和数据过滤，共鉴定出7493个蛋白质(补充表2). 在JEV感染期间，我们在6 hpi检测到212个上调DEPs和430个下调DEPs，在12 hpi检测出754个上调DEP和927个下调DEP，在24 hpi检测发现191个上调的DEP和778个下调的DEPs(补充表3和图1B–D).

差异表达蛋白的功能表征

在生物过程类别中(图2A)发现上调的DEPs主要与炎症反应的调节、细胞对细胞因子刺激的反应、凋亡过程的调节、先天免疫反应和信号受体活性有关(图2B). 在细胞成分类别中，上调的DEPs主要与细胞外区域和细胞外间隙相关(图2C). BV2_12h/mock组的DEPs富含细胞粘附分子、抗原处理和抗原提呈(图2D)以及Toll样受体和PI3K-AKT信号通路。使用LC-PRM分析BV2-12h/mock组中15个靶蛋白的候选肽。TLR2表达在12hpi时增加(表1)而TLR受体的一般下游蛋白MyD88此时没有上调。

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图2

JEV感染后BV2细胞中DEPs的功能富集。（A–C）基于GO富集的聚类分析热图。（A）显示多种免疫反应激活的生物过程，表明JEV感染后细胞免疫反应激活。（B）分子功能显示与蛋白结合相关的激活，表明免疫反应的级联效应也被激活。（C）细胞成分富含少量上调蛋白和大量表达减少的蛋白，因此表明JEV感染抑制了细胞内成分的表达。（D）KEGG富集的聚类分析热图。感染性疾病通路被激活，而与自身免疫性疾病相关通路相关的蛋白表达降低。细胞粘附分子以及抗原处理和呈递途径在12 h时高度富集。所有富集的蛋白质都有显著差异，红色到蓝色的梯度表明蛋白质富集程度从高到低。

表1

蛋白质组学的PRM验证。

蛋白质添加	基因名称	BV2_mock PRM/TMT比率的平均值	BV2_6h PRM/TMT比值的平均值	BV2_12h PRM/TMT比值的平均值	BV2_24h PRM/TMT比值的平均值
问题05769	第2部分	0.24	1.53**	1.16**	1.07**
第27512页	镉40	0	0.93**	1.52**	0.55**
第10810页	抄送14	0.35	1.26**	1.86**	0.53**
第13597页	伊卡1	0.20	1.29**	2.08**	0.43**
Q9重量5	NF-κB2	0.47	1.05**	1.14**	1.34**
Q9Z0H7型	密件抄送10	0.40	1.10**	1.50**	1**
第42225页	状态1	0.24	0.79**	1.26**	1.71**
问题9问题7	Tlr2号机组	0.46	1.22**	0.94**	1.37**
第35613页	Daxx公司	0.33	1.04**	1.47**	1.15**
问题64339	第15期	0.04	1.09**	2.26**	0.62**
Q9EQ32问题	图3ap1	0.51	1.14**	1.15**	1.20**
O88522号机组	Ikbkg公司	0.73	0.88-	1.51**	0.89-
第25799页	Nfkb1号机组	0.43	1.19**	1.08**	1.30**
P02468号	拉姆1	0.69	1.22**	1.50**	0.59-
第22366页	我的D88	0.82	0.93-	0.73-	1.53**

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-，调节不明显，**p<0.01。

通过GO富集分析，我们在6、12和24 hpi时发现了许多炎症反应、固有免疫反应和抗病毒反应相关蛋白(图3). 我们观察到，与其他任何时间点相比，在12 hpi时蛋白质的显著上调(图3B).

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图3

JEV感染BV2细胞后免疫相关蛋白的调节（A）6马力，（B）12 hpi，以及（C）24马力。炎症相关蛋白Fas、TNF、Fosl1、Hmgb1、Riok3的表达以及凋亡相关蛋白Fadd、Fas、TNF和干扰素相关蛋白Irf9、Isg20、Ifi35的表达均发生显著变化。这表明JEV感染可诱导广泛的免疫反应，炎症反应是关键的免疫反应之一。所有样本均通过三个平行组进行测试*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.

乙型脑炎病毒引起强烈的炎症反应，并在BV2细胞中鉴定出相关蛋白

用qPCR检测TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的表达水平(图4A). 此外，经PRM验证，TLR2表达在蛋白质水平上升高(表1)和western印迹(图4C). 还检测到TLR2关键适配器蛋白和下游信号通路蛋白(表1和图4B、C); IRAK4、IRAK1、TRAF6和TAK1的水平保持不变，MyD88信号通路未被激活。未发现关键蛋白（TRIF、TIRAP和TRAM）的表达水平升高。然而，PI3K、AKT和NF-κB的表达水平升高。炎症因子的表达(图4D)包括TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS在内，JEV感染后12 h也增加。

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图4

根据蛋白质组学数据，大多数免疫相关蛋白在感染后12小时被激活。（A）通过相对mRNA水平检测TLR激活。TLR2在所有TLR中均呈高亮表达；选择TLR2进行后续调查。（B）为了研究TLR2发挥功能的途径，对TLR2下游的关键蛋白进行qPCR；TRIF、TIRAP和TRAM没有上调。（C）western blotting证实TLR2下游有两条通路。PI3K-AKT和NF-κB通路蛋白的表达水平显著上调；然而，通常被认为是TLR2连接蛋白的MyD88通路没有被激活。（D）JEV感染促进炎症因子（TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS）的上调，从而表明炎症反应。所有样本分三个平行组进行测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001.

Toll样受体2通过调节PI3K-AKT通路增加炎症因子水平

为了研究TLR2作为JEV感染期间激活炎症的关键受体的作用，我们使用C29抑制BV2细胞中TLR2的表达(图5A). 我们还检测了TLR2下游候选蛋白的表达水平。p-PI3K和p-AKT的表达水平下降，而NF-κB和p-NF-kb B的表达水平保持不变。接下来，我们研究了JEV 12 hpi时BV2细胞中炎症因子的表达水平。TLR2抑制后，JEV感染的BV2细胞中炎症因子的表达降低(图5B).

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图5

TLR2通过PI3K和AKT调节炎症因子的表达是通过抑制途径中的关键蛋白来确定的。（A）我们对TLR2进行抑制，并检测下游关键蛋白（p-PI3K、p-AKT和NF-κB）。p-PI3K和p-AKT的表达随着TLR2的表达而降低，而NF-κB和p-NF-κ的B没有随着TLR2表达而改变；这些结果表明，PI3K和AKT是TLR2的下游，受TLR2的调节，而不是NF-κB途径。（B）TLR2抑制后，关键炎症因子（TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS）的表达显著降低，表明TLR2是调节炎症的关键蛋白。（C）TLR2下游的关键蛋白PI3K被抑制，TLR2的表达保持不变，而AKT的表达降低，表明PI3K作用于TLR2下游。（D）PI3K抑制后，关键炎症因子的表达均降低。（E）AKT被抑制，但这并没有引起TLR2表达的变化，因此表明AKT是TLR2的下游蛋白。（F）AKT抑制后TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS的表达水平均降低。这些结果表明，炎症因子的表达受TLR2-PI3K-AKT信号轴的调节。ns：未受到重大监管*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001.

PI3K抑制后，p-AKT表达同时减少(图5C)而TLR2表达保持不变。我们还研究了TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS的表达水平，它们都随着PI3K的抑制而降低(图5D).

为了确定AKT在TLR2-PI3K-AKT信号轴炎症因子调节中的作用，我们抑制AKT并检测TLR2的表达水平(图5E). 当AKT被抑制时，炎症因子的表达也会降低(图5F).

总的来说，高深度TMT蛋白质组学用于检测JEV感染随时间的先天免疫激活在体外我们发现JEV通过TLR2-PI3K-AKT轴激活炎症反应(图6).

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图6

JEV感染通过TLR2-PI3K-AKT信号轴增加炎症反应关键因子的表达。TLR2下游的MyD88信号通路未被激活，NF-κB信号通路不受TLR2调节。

讨论

反应性胶质增生症是一种不受调节的炎症反应，伴随着神经细胞死亡，被认为是中枢神经系统JEV感染的主要特征。JEV进入大脑后，胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）和神经元细胞的显著激活是JE的一个特征。小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中的几个通路被激活，以启动神经炎症反应。小胶质细胞是CNS薄壁组织中的常驻巨噬细胞群，是抵御入侵病原体的最初防线。小胶质细胞有多种模式识别受体，包括Toll样受体和吞噬细胞受体家族成员；它们共同作用，检测并清除渗入中枢神经系统实质的微生物(Mariani和Kielian，2009年). TLR2是一种位于细胞表面的天然免疫传感器，可以识别病毒、真菌、细菌和寄生虫的配体(Wei等人，2021年). TLR2被发现能感应感染后的各种病毒蛋白，包括EB病毒dUTPase、巨细胞病毒糖蛋白B和乙型肝炎病毒衣壳(Wei等人，2021年). JEV诱导神经炎症，这已被确定为人类JEV发病机制中的重要因素，包括免疫细胞浸润和神经元变性(Misra和Kalita，2010年).

在6和12 hpi时检测到类似的蛋白质组结果，尽管我们在6 hpi时确实检测到较少的差异蛋白质。因此，12 hpi的结果可能更能代表JEV感染BV2的情况。MyD88在24hpi时被显著激活，因此表明与12hpi时不同的先天免疫途径；这需要在未来的实验中进一步研究。GO分析产生与DEP富集的生物过程、分子功能和细胞成分有关的信息(Li等人，2017年). 因为宿主炎症反应是JEV-小胶质细胞相互作用的最关键特征之一，所以我们重点关注小胶质细胞免疫反应相关蛋白。JEV感染激活先天免疫反应(周等，2018)和抗病毒反应(Ye等人，2017年)，从而导致炎症反应。我们的蛋白质组学结果表明，大量免疫相关蛋白得到了富集。炎症反应相关蛋白Fas和TNF是凋亡信号分子，Hmgb1是内毒素致死效应的最重要炎症介质之一。先天免疫反应相关蛋白Fadd促进Fas蛋白所在细胞的凋亡，而Irf9、Isg20和Ifi35是干扰素相关蛋白。病毒相关蛋白Fosl1在调节细胞凋亡和炎症反应中起作用，而Riok3在巨噬细胞中对I型干扰素和炎症因子起调节作用。在感染后12小时，JEV激活了抗病毒免疫反应、炎症反应和先天免疫反应，许多相关蛋白升高，这意味着这是免疫反应的关键时间点。

在本研究中，我们利用TMT定量蛋白质组学描述了不同时间点BV2对JEV感染反应的整体蛋白质组特征。此外，通过应用定量蛋白质组学、qPCR和western blotting，我们发现在12 hpi时，PRR和关键炎症途径相关蛋白的表达水平显著增加。我们确定TLR2的激活是在BV2细胞中产生强炎性因子的关键因素。这与JEV感染N9细胞的结果一致(Sharma等人，2021). 此外，从拉斯穆森脑炎患者的标本中发现TLR2被激活；手术控制皮层组TLR2的表达水平较低，从而为TLR2介导的大脑慢性炎症提供了直接证据(Luan等人，2016年). 同样，TLR2依赖性信号在冠状病毒感染期间促进促炎细胞因子的产生。TLR2检测SARS-CoV-2包膜蛋白并促进骨髓源巨噬细胞在冠状病毒感染期间产生促炎细胞因子(Zheng等人，2021年). 还发现，刺激SARS-CoV-2 S蛋白也可以激活TLR2，并在HEK293T细胞和A549细胞中引起强烈的炎症反应(Khan等人，2021年). 一般来说，MyD88和NF-κB的激活对于病毒感染后TLR2介导的炎症反应至关重要。TLR2需要适配器蛋白MyD88激活IRAK和TRAF6，有时需要TIRAP的协助。TRAF6触发TAK的激活，TAK抑制磷酸蛋白IκB，然后激活转录因子NF-κB。例如，TLR2的抑制下调了MyD88和NF-κB通路，并降低了HSV1脑炎感染的BV2细胞中炎症因子的表达(郭等，2015). 然而，我们的结果表明，这些蛋白在JEV感染后没有被激活。通过调节TLR2下游的关键蛋白，我们证实TLR2-PI3K-AKT信号轴是调节JEV感染炎症反应的关键。在确认TLR2是TLR中最明显的激活蛋白时，我们发现TLR6被激活，尽管比TLR2弱。TLR6可能与TLR2形成异二聚体，从而识别病毒蛋白并增强感染，导致TLR6表达增加(Henrick等人，2015年). 然而，TLR2/6异二聚体在人巨细胞病毒（HCMV）感染中不会共沉淀(Boehme等人，2006年). 此外，TLR6还通过MyD88信号通路和NF-κB信号通路作用于巨噬细胞的炎症和自噬(Roy等人，2014年). 这些结果表明，TLR6具有复杂的功能，可能在各种疾病和炎症中发挥重要作用。然而，JEV感染期间TLR6的高表达仍然令人困惑，需要更多证据。

Toll样受体2是TLR的一种，具有识别病原体的能力(de Aquino等人，2014年)和内源性报警蛋白(Thierry等人，2014年)并且还激活自然免疫。TLR2-PI3K/AKT信号通路也可调节小鼠巨噬细胞的过敏性气道炎症和自噬。在野生型小鼠中，PI3K抑制后炎症因子的表达降低，而在TLR2-KO小鼠中，抑制PI3K后炎症因子表达没有明显变化。这意味着TLR2作用于PI3K上游并调节炎症反应(Jiang等人，2017年). 我们的结果也证实了PI3K被TLR2激活，TLR2的抑制降低了PI3K的表达水平；然而，抑制PI3K对TLR2的表达没有影响。TLR2还能够通过PI3K/AKT调节维持固有免疫屏障的稳态，平衡粘膜内稳态与炎症应激诱导的损伤体内(Cario等人，2007年). 结核分枝杆菌已被证明通过小鼠巨噬细胞中的TLR2-PI3K/AKT通路抑制促炎细胞因子并下调抗原呈递细胞功能，从而削弱T细胞介导的免疫反应(刘等，2016). TLR2-PI3K/AKT信号通路不仅在炎症中发挥功能；它还诱导巨噬细胞的细胞骨架重排和极化(Lasunskaia等人，2006年)并在启动抗原特异性原始T细胞中发挥关键作用(Cho等人，2018年). 有人建议CD14在某些情况下有助于TLR激活(Pauligk等人，2004年). 虽然CD14在TLR2-PI3K-AKT通路中的作用尚不明确，但在我们目前的结果中也发现CD14被激活；这需要进一步调查。

PI3K已被证明可以调节多种细胞内信号传递过程的激活和许多炎症因子的功能(Yang等人，2015年;Xuan等人，2017年). PI3K/AKT信号通路在病毒感染、复制、翻译、细胞过程、癌症、蛋白质合成、葡萄糖代谢和炎症中起着关键作用(Jing等人，2016). 已知PI3K/AKT被细胞外刺激激活，包括细胞因子、生长因子、G蛋白偶联受体和B细胞受体(刘和科恩，2015年). 磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN；Stambolic等人，1998年)肌醇多磷酸-4-磷酸酶，II型（INPP4B），富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2（PHLPP2；Brognard等人，2007年)和蛋白磷酸酶2（PP2A；Kuo等人，2008年)也已知受PI3K活性调节。也有证据表明，多种病毒可以激活PI3K/AKT信号通路并发挥不同的作用。已知Semliki Forest病毒（SFV）、Ross River病毒（RRV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）都能激活PI3K/AKT信号通路。CHIKV激活PI3K/AKT的激活效率低于SFV和RRV，而病毒复制和翻译受PI3K/AKT通路控制(Joubert等人，2015年;Broeckel等人，2019年). 疱疹病毒（HSV）以依赖PI3K/AKT通路激活的方式进入细胞；PI3K的抑制阻断了HSV的进入(Tiwari和Shukla，2010年). 考虑到我们的结果，PI3K可以被不同的上游蛋白激活；TLR2激活的PI3K/AKT通路似乎更倾向于炎症反应和自噬，而病毒糖蛋白激活的PI3G/AKT途径似乎更有利于病毒感染和长期存在。这些假设需要在未来进行测试。另一件值得注意的事是，PI3K是激活AKT的中央调节分子。然而，已经证明其他激酶也可以直接激活AKT。Ack1（一种非受体酪氨酸激酶）可以通过与Akt形成亚型直接调节Akt(Mahajan和Mahajan2010年). 蛋白酪氨酸激酶6（PTK6）和Src直接介导AKT磷酸化，而非PI3K(Chen等人，2001年;Zheng等人，2010). 总的来说，多种酪氨酸激酶通过在多种酪氨酸残基磷酸化AKT，以PI3K非依赖性的方式激活AKT(Mahajan和Mahajan2012年). 这些结果表明PI3K激活只是AKT信号通路之一。需要更多的研究来探索PI3K-AKT差距。这些可能在PI3K-AKT信号通路的未来研究中发挥广泛的提示作用。

在我们目前的研究中，我们发现TLR2的表达在24 hpi时降低。可能的原因是感染后TLR2表面表达的减少是由于可溶性蛋白的释放；这导致在某些感染和炎症过程中可溶性TLR2水平升高(Henrick等人，2016年;Holst等人，2017年;侯赛因等人，2018年). 另一方面，病毒蛋白在细胞中不同位置的表达对TLR2激活有不同的影响。在已知SARS-CoV-2的S蛋白激活TLR2的前提下，S蛋白在细胞质和细胞表面的表达激活巨噬细胞中的TLR2并引起自然免疫激活，而细胞外TLR2的表达并不激活TLR2。这支持了我们对JEV感染24小时后TLR2活性降低的推测(Khan等人，2021年).

日本脑炎病毒感染已被证明激活TLR3和RIG-I，从而导致NF-κB通路的调节；这激活了参与中枢神经系统炎症反应的小胶质细胞(Jiang等人，2014年). TLR触发几种不同的信号通路以产生促炎细胞因子和干扰素基因(Bagchi等人，2007年;Kenny等人，2009年). 根据我们的结果，TLR2通过PI3K-AKT信号轴发挥作用。一种可能性是，我们使用的JEV菌株有自己的TLR2激活机制。先前的一项研究表明TLR2的参与与DENV的复制潜能无关，并且依赖于病毒颗粒识别(Aguilar-Briseño等人，2020年). 因此，TLR2的激活可能是由JEV株中蛋白质的改变引起的。然而，没有确凿的证据表明TLR2的激活不依赖于JEV的复制，而是依赖于结构蛋白，尽管这需要进一步的研究。

总之，使用蛋白质组学方法，我们研究了在体外JEV感染BV2细胞的时间过程，首次发现JEV通过TLR2-PI3K-AKT轴激活炎症反应。我们的研究进一步了解了JEV诱导炎症细胞因子的分子途径。我们的发现最终为控制JEV诱导的炎症反应和避免剧烈炎症诱导的脑损伤奠定了基础。

数据可用性声明

研究中提供的数据保存在EBI-PRIDE数据库中，登录号为PXD035938型和PXD033575型.

作者贡献

GZ、HL和NJ构思了这项研究。GZ、JZ和YG为数据收集、分析和解释做出了贡献。HZ、FN和CX有助于数据可视化。GZ和YZ完成了手稿的起草。ZH、XZ、PZ和ZL修订了手稿。CL和SF负责监督研究。所有作者都参与了这篇文章并批准了提交的版本。

致谢

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