半乳糖：PEGamine包裹的金纳米粒子粘附在丝状伪足上并引起外源性凋亡^†

硼氢化钠分析

NaBH的水解损失₄在AuNP合成反应期间，通过2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）测定法进行监测。¹⁴使用0.2 M NaOH将Milli-Q水调节至pH 12。加入10毫升NaBH₄添加以达到90 mM的最终浓度₄溶液，15 mg HAuCl₄同时添加39 mg 5,5-二硫代-双（2-硝基苯甲酸），对应于标准AuNP合成反应中使用的金和配体的摩尔浓度（注意，我们必须用另一个二硫醚取代α-半乳糖和PEG-胺二硫醚配体，因为TNBS与伯胺反应）。每隔一段时间取出20微升等分的该反应混合物，并将其添加到96 well塑料板中的180μl pH值为12的水中。最后，将20μl等分稀释样品添加到200μl等份新制备的2 mM TNBS中，pH值为12。15分钟后，使用FLUOstar Optima平板阅读器（BMG Labtech）在470 nm处测量TNBS溶液的吸光度，并使用90 mM NaBH的倍稀释系列进行校准₄溶液，以与AuNP反应相同的方式处理。

纳米粒子物理化学表征

细胞培养

HSC-3鳞癌细胞购自美国类型培养库。HaCaT细胞是鹿特丹伊拉斯谟医学中心埃里克·沃尔比姆赠送的礼物。细胞在低葡萄糖（1 g l）中培养⁻¹)DMEM培养基（Gibco）添加10%FBS（Sigma-Aldrich）和1%青霉素/链霉素，置于37°C、5%CO的增湿培养箱中₂传代前，细胞在T-75培养瓶中生长至约80%的汇合处。

克隆形成试验

细胞以每孔300个细胞接种在24孔板中，并允许过夜粘附。第二天，将细胞暴露于AuNPs中3小时，然后在新鲜培养基中清洗。我们之前证明，3小时培养最适合使用这些类型的糖进行克隆形成分析和摄取研究：PEGamine AuNPs。²让细胞生长6天以形成菌落，然后用2%亚甲基蓝在50%乙醇中染色并固定。实验重复三次，每次技术重复三次（总计n个= 9). 使用带有GeneSys v1.4.6软件（Syngene）的G:Box Chemi XX6凝胶文档系统捕获染色板图像。使用GeneTools v.4.03软件（Syngene）对含有>50个细胞的菌落进行量化，并以对照组的百分比表示。通过肉眼验证自动计数。集成电路₅₀根据AuNP浓度的对数图估计值对对照菌落的百分比。

细胞摄取和分布

通过ICP-MS和TEM定量细胞摄取。

细胞上的纳米粒子TEM计数

采用系统采样方法评估细胞中的纳米颗粒计数。该方法基于以规则的间隔在每个样品上以相同的放大率和相同的设置采集25张TEM图像，包括细胞的每五个视场。每个图像都被加载到ImageJ软件（NIH）中，在该软件中测量细胞核和细胞质的可见区域以及细胞表面的长度，并手动计算这三个区域中每个区域的纳米颗粒数量。数据以每微米纳米颗粒数表示²用于核和细胞质纳米颗粒计数，以及作为每微米纳米颗粒用于细胞表面纳米颗粒计数。

Fascin抑制

fascin抑制剂fascin-G2（Xcessbio，M60269-2s）用于抑制丝状伪足的形成。细胞与50μM fascin-G2在37°C下孵育2小时。然后用10μg ml培养细胞⁻¹在37°C或4°C条件下，将50μM fasin-G2中的AuNP再放置3小时。然后对细胞进行清洗、固定并制备以进行TEM分析。

半胱氨酸蛋白酶抑制

如前所述，建立细胞进行克隆形成分析。在添加10μg ml之前，用70 nM caspase 8抑制剂I（Merck，218773）或50 nM caspase 9抑制剂II（Merck（218776）或caspase 3/7抑制剂（Abcam，ab120382）预培养细胞1 h⁻¹使用10μM抗霉素A（Abcam，ab141904）作为细胞凋亡的阳性对照，并将其培养3 h⁻¹Apo2配体/TRAIL作为诱导外源性细胞凋亡的阳性对照。如前所述，在6天后分析克隆试验。实验重复三次，每次技术重复三次（总计n个= 9).

克隆形成试验

HSC-3细胞急性（3小时）暴露于AuNPs的细胞毒性/细胞抑制潜力通过克隆发生测定法测定，并显示出细胞集落的剂量依赖性减少。短合成AuNP具有IC₅₀约8μg ml⁻¹，而长合成AuNP具有IC₅₀约3.5μg ml⁻¹(图1).

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图1

急性暴露3 h后，对HSC-3细胞进行短合成（1 h）和长合成（5 h）AuNP的克隆形成分析。所有数据均显示为平均值±SEM。**=P（P）< 0.01, *** =P（P）< 0.001,n个= 9.

AuNP的细胞摄取和分布

通过ICP-MS在低密度细胞培养物上测定AuNP的总细胞摄取量，包括细胞上和细胞内的AuNP（以允许丝状伪足在每个细胞周围无阻碍地延伸）。发现细胞在3小时内积累了类似数量的每种AuNP（短合成AuNP每细胞4.8±1.8 pg，长合成AuNPs每细胞6.8±2.2 pg；双尾吨-测试P（P）= 0.63).

为了研究AuNP细胞摄取的细节，我们使用了一种成熟的定量TEM方法。^15,20–22为了区分能量依赖性转运和被动转运，分别在37°C或4°C下进行细胞摄取研究。37°C孵育3小时后，发现AuNP主要位于细胞质内，短合成和长合成AuNP的积累没有显著差异(图2)，与ICP-MS数据一致。然而，当在4°C下培养时，两种AuNP在细胞表面的分布发生了显著变化，与短合成AuNP相比，长合成AuNPs与细胞表面相关(图3). 在4°C时，AuNP并非随机分布在细胞表面，而是优先与丝状伪足相关（88.9%（3385/3808）的长合成AuNP和82.5%（2254/2732）的短合成AuNPs与丝状假足相关；图3B和C).

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图2

急性接触10μg ml后3 h银增强HSC-3细胞的TEM图像⁻¹37°C时的AuNP。（A） 无AuNP控制。（B） 短合成（1小时）AuNP。（C） 长合成（5小时）AuNP。（B′）和（C′）分别表示（B）和（C）的方框区域的放大部分。n=细胞核，cy=细胞质，f=丝足。比例尺=500 nm。（D） 每微米AuNP计数的定量²细胞核和细胞质（左轴）以及细胞表面每微米AuNP计数（右轴，带红色边框的条）。每个类别计数的AuNP总数显示在条形图上。所有数据显示为平均值±SEM，n个= 6.

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图3

10μg ml急性暴露3h后银增强HSC-3细胞的TEM图像⁻¹4°C下的AuNP。（A） 无AuNP控制。（B） 短合成（1小时）AuNP。（C） 长合成（5小时）AuNP。（B′）和（C′）分别表示（B）和（C）的方框区域的放大部分。n=细胞核，cy=细胞质，f=丝状体。比例尺=500 nm。（D） 每微米AuNP计数的定量²细胞核和细胞质（左轴）以及细胞表面每微米AuNP计数（右轴，带红色边框的条）。每个类别计数的AuNP总数显示在条形图上。所有数据均显示为平均值±SEM。*=P（P）< 0.05,n个= 6.

先前的研究表明，改变配体密度会影响纳米颗粒细胞的积累，尽管对于低配体密度还是高配体密度是最佳的还没有达成共识。^7–10此外，配体在纳米颗粒表面的精确分布可能至关重要，因为计算机模拟表明，均匀的配体分布有利于细胞摄取，而无配体区域的存在则阻止细胞摄取。²³然而，在本研究中，尽管配体密度较低的AuNP与细胞表面的结合更好，但AuNP的细胞内积累并未受到配体密度的显著影响。

为了确认AuNP是否与丝状伪足有选择性结合，HSC-3细胞预先与fascin-G2孵育，fascin-G2是fascin肌动蛋白捆绑能力的抑制剂，从而破坏丝状伪肢的稳定性并阻止其形成。Fascin抑制导致每微米细胞表面丝状体减少85%（相比之下图4A和D具有图4B、C、E和F).

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图4

10μg ml孵育3 h的银增强HSC-3细胞的（A–F）TEM图像⁻¹在（A）不存在或（B，C）存在筋膜抑制物的情况下，在4°C时的AuNP；在（D）不存在，或（E，F）存在筋膜炎抑制物时，在37°C时，AuNP。比例尺=500 nm。（G，H）每微米AuNP计数的定量²对于细胞核和细胞质（左轴），以及在（G）4°C或（H）37°C下有或没有fascin抑制剂的细胞表面（右轴）每微米的AuNP计数。每个类别统计的AuNP总数显示在条形图下方。所有数据均显示为平均值±SEM。*=P（P）< 0.05, ** =P（P）< 0.01,n个=6。

在筋膜抑制后，在4°C下负载短合成或长合成AuNP的细胞表面AuNP显著减少三倍(图4G)而37°C下负载短合成或长合成AuNP的细胞在细胞质内的AuNP显著减少(图4H).

AuNP与其他细胞系的相互作用

为了确定长合成AuNP与细胞膜相互作用的方式是否有任何明显的趋势，我们检测了另外两种细胞类型：hCMEC/D3人内皮细胞和HaCaT人角质形成细胞。

首先，我们检查了在4°C下培养是否会抑制细胞摄取并将AuNP重新分配到细胞表面。如所示图4，摄取10μg ml⁻¹如果在4°C下进行培养，长时间合成AuNPs到HSC-3细胞的能力将被抑制95%（平均细胞质AuNPs：5.97±1.97/μm⁻²37°C时对0.28±0.12/μm⁻²4°C时，图4G和H). 10μg ml的累积⁻¹当在4°C下进行培养时，长时间合成AuNPs到HaCaT细胞的能力同样受到94%的抑制（平均细胞质AuNPs：7.39±1.02/μm⁻²37°C时对0.43±0.12/微米⁻²4°C时；ESI图7A和B^†). 最后，在与此处所用条件相当的条件下，我们先前报告了8μg ml⁻¹如果在4°C下进行培养，将AuNPs长时间合成为hCMEC/D3细胞3小时将被抑制98%。¹³

接下来，我们重点研究了4°C时细胞表面与丝状伪足相关的长合成AuNP的比例。如上所述，HSC-3细胞在4°C时表现出88.9%的AuNP与丝状伪足的关联（细胞表面3808个AuNP中丝状伪满上的3385个AuNPs）。相比之下，HaCaT细胞在4°C时表现出52.5%的AuNP与丝状伪足的关联（细胞表面988个AuNP中丝状伪劣伪劣伪足上的519个AuNPs，ESI图7B^†). 对我们现有的4°C hCMEC/D3细胞TEM数据的重新分析(参考13)显示AuNPs与丝状伪足有11.9%的相关性（细胞表面657个AuNPs中丝状伪劣伪劣伪足上有78个AuNP，ESI图7C和D^†).

从这个有限的数据集中，可以看到一种趋势，即细胞表面与丝状伪足相关的AuNP比例与毒性相关。因此，HSC-3:88.9%的纤维结合，IC₅₀3.5微克毫升⁻¹; HaCaT:52.5%丝状体结合，IC₅₀10微克毫升⁻¹（ESI图7E^†); 和hCMEC/D3:11.9%丝状体结合，IC₅₀>75微克毫升⁻¹（注意，hCMEC/D3不会克隆生长）。然而，金纳米粒在75μg ml时无毒⁻¹连续暴露48小时后(参考13). 这些数据表明，丝足结合可能刺激细胞死亡受体，下一节将使用HSC-3细胞进一步探讨这种可能性。

这是首次明确报道AuNP与丝状伪足特异性相互作用。在巨噬细胞上，细菌颗粒被丝状伪足的轴捕获，然后朝向细胞表面进入吞噬杯中。²⁴类似地，胞外体纳米囊泡附着在丝状伪足上，并直接指向其底部的内吞热点。²⁵当能量依赖性转运被抑制时，AuNP仅在4°C时出现在丝状伪足上；这表明在37°C时，它们通常被迅速清除和/或内吞。然而，我们没有证据表明丝足蛋白结合的程度可以预测随后的摄取：它们可能是独立的。

我们还不能确定AuNP是否最初与预先存在的丝状伪足结合，或者AuNP与细胞表面的结合是否局部刺激丝状伪满的形成。一项涉及二氧化硅纳米颗粒的研究发现，纳米颗粒的长径比影响了丝状伪足的形成和胞饮作用。²⁶

一种可能性是，这些AuNP能够与丝足类上优先表达的受体结合，可能以类似于某些溶瘤病毒的选择性癌细胞靶向的方式结合。²⁷

另一种可能性是，带正电荷的AuNP和带负电荷的细胞膜之间可能发生静电相互作用。^28,29由于膜电位的变化，可能会产生选择性，不同细胞类型之间的膜电位差异可达90 mV。²⁸目前尚不清楚丝状伪足的膜电位是否比细胞膜其他区域的膜电位更负。然而，丝足轴的弯曲是由小的“香蕉状”细胞内蛋白质凸面上的负电荷从内部雕刻而成，这些蛋白质排斥并弯曲相邻带负电荷的细胞膜。³⁰推测，这可能会局部增加丝状伪足表面的负电荷。与这个想法一致，与固定COS7细胞上的其他细胞膜相比，带正电的1.4 nm“纳米金”AuNP与丝状伪足的结合强度更大。³¹尽管SEM研究中使用的放大倍数无法解析单个AuNP。纳米金配体外壳的确切性质是专有的，但制造商表示每个AuNP有6个伯胺基团。³²这与我们的AuNP的配体结构不同，不赞成（但不是否定）这两种AuNP共用丝足受体的想法，而赞成静电作用于AuNP与细胞表面结合的想法，AuNP在每个细胞表面的精确分布由电荷不均一性决定。

与AuNP电荷无关，两亲性有机配体包覆的AuNP在细胞膜脂质双层中的非能量插入优先发生在细胞膜高曲率区域³³当核心尺寸小于3nm时，其性能显著提高。³⁴虽然这些研究没有专门研究丝足类，但丝足类突起的尖端和底部以及丝足轴的小半径都构成了细胞膜的高度弯曲区域，因此可以作为能够插入这种膜的纳米粒子的优先粘附位点通过“浮潜”。³⁵在本研究中，PEGamine配体的六乙二醇部分可能具有足够的两亲性，以允许与细胞膜进行这种能量无关的相互作用。需要进行进一步的详细研究，以比较使用不同比例的α-半乳糖：PEGamine的AuNP的丝足结合和细胞摄取。我们之前的研究²随着α-半乳糖：PEGamine比率的变化，HSC-3和HaCaT细胞的摄取（通过ICP-MS评估）表现出差异。50:50比例的AuNPs吸收率最高（50:50>60:40≈40:60≈0:100>100:0）。然而，我们还没有关于这些不同的α-半乳糖：PEGamine比值AuNP在能量无关条件下（例如在4°C下培养）的丝状体相互作用的TEM数据，并且我们在文献中没有发现类似的TEM研究。

Konstantina Tzelepi由Midatech Pharma和开放大学联合资助。我们感谢开放大学的Radka Gromnicova博士和Gordon Imlach博士分别为TEM和SEM-EDS做准备。我们还感谢开放大学的Radka Gromnicova博士和David Male教授分享了未发表的hCMEC/D3细胞的TEM图像。