阿帕替尼通过调控VEGFR2/Nrf2通路诱导胶质瘤细胞铁凋亡

2.2. 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测

采用CCK-8分析评估细胞活力。简单地说，将处于对数生长期的U251/U87细胞以5×103个细胞/孔的密度接种到96 well板中。同时，设对照组，对照组在37°C（100μ将L无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）加入井内）。然后分别用阿帕替尼处理细胞24、48和72小时。之后，10μ向每个孔中加入L CCK-8溶液（MCE，美国），并在37°C下培养4h；每个孔的吸光度值由miroplate阅读器在450nm波长下测定。

2.3. 细胞周期测定

将对数生长期的U87和U251细胞密度调节为1×105个/mL，然后将细胞接种到6孔板中。细胞粘附到细胞壁上后，丢弃原始培养基，并对细胞进行处理。然后在37°C的培养箱中，在5%CO2的存在下培养细胞72小时。随后，去除上清液，用PBS清洗细胞两次。700 μ缓慢添加L预冷的80%乙醇，直至最终浓度为70%，并将细胞固定在4°C下4小时以上。随后，以1500 rpm离心细胞5分钟，并在37°C下培养RNase（1 mg/mL）30分钟。10μ碘化丙酸（PI，400μ添加g/mL）溶液，在4°C下黑暗染色30 min，并进行流式细胞术。

2.4. 活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、乳酸脱氢酶（LDH）和铁的检测

将处于对数生长期的U87和U251细胞的密度调整为1×105个细胞/mL，然后将细胞接种到6孔板中，每个孔中有2mL细胞悬浮液。对于ROS检测，根据制造商的说明，使用DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒（分类号S0033；Beyotime Biotechnology，中国上海）通过流式细胞术分析处理过的细胞。对于MDA检测，根据制造商的方案，通过MDA检测试剂盒（目录号S0131S；Beyotime Biotechnology）分析处理的细胞。对于GSH检测，根据制造商的说明，使用GSH检测试剂盒（分类号A006-1；中国南京建成生物工程研究所）对处理过的细胞进行分析。对于LDH检测，根据制造商的说明，使用LDH检测试剂盒（分类号A020-1；南京建成生物工程研究所）对处理过的细胞进行分析。为了进行铁检测，使用铁检测试剂盒（分类号A039-1；南京建成生物工程研究所）和使用的pcDNA3.1载体（分类号V38520；Invitrogen™）对处理过的细胞进行分析。

2.5. 西方印迹法

将全细胞蛋白提取物在裂解缓冲液中均质，并在12000×g下离心15分钟。使用BCA蛋白检测试剂盒测量蛋白质浓度。蛋白质裂解物在10%十二烷基硫酸钠（SDS-）聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，Bedford，MA，USA）。在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1.5小时后，PVDF膜与一级抗体在4°C下孵育过夜。清洗后，PVDF膜与与辣根过氧化物酶结合的相应二级抗体孵育。使用商业ECL套件检测信号（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）。抗甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（分类号26415-1-AP）购自Proteintech（美国伊利诺伊州芝加哥）。从Affinity Biosciences（俄亥俄州辛辛那提市，美国）购买了抗-GPX4（产品目录号DF6701）、抗SLC7A11（产品目录编号DF12509）和inti-phospho-VEGFR2（产品目录号码AF3279）。Anti-KEAP1（产品目录号GTX60660）购自GeneTex Inc.（美国加利福尼亚州欧文市）。Anti-NRF2（分类号Ab137550）从Abcam（英国剑桥）购买。

2.6. 苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学

裸鼠脑胶质瘤在4°C的10%多聚甲醛中固定12 h，然后在不同浓度的乙醇中脱水。肿瘤组织用二甲苯渗透并包埋在石蜡中。然后将其切片（0.5μm） ，再水化，在4°C下用HE染色10分钟并密封。对于胶质瘤中Ki-67的IHC评估，使用了DAKO Envision系统（DAKO；Agilent Technologies，Inc.）。简单地说，将胶质瘤石蜡包埋切片在60°C下加热，然后与Ki-67（1:1000；猫。编号ab279653；Abcam）在4°C下过夜。然后用生物素标记的二级抗体（1:1000；猫。编号：ab205718；Abcam）在37°C下放置20分钟。为了评估Ki67，在光学显微镜下计算三个代表性高染色区域的阳性细胞数量。

2.7. 动物研究

雌性BALB/c裸鼠（年龄，4周龄）购自常州Cavens实验动物有限公司（中国常州）。本研究中的实验程序是根据我们的动物实验机构指南进行的，该方案得到了浙江省肿瘤医院（中国杭州）动物护理和使用机构委员会的批准。

3.2. 阿帕替尼通过调控VEGFR2/Nrf2/Keap1通路诱导铁凋亡

接下来，我们研究了阿帕替尼是否影响了参与铁凋亡诱导的调控途径，尤其是VEGFR2/Nrf2/Keap1途径。结果表明，用阿帕替尼处理72 h后，U251和U87细胞中Keap1和VEGFR2的表达水平增加，而Nrf2和p-VEGFR2表达水平下降（图2（米）和2（n））。为了确定Nrf2是否参与U251和U87细胞对阿帕替尼治疗的反应，对过度表达Nrf2的细胞进行了进一步分析。结果表明，在用阿帕替尼治疗24、48和72小时后，过度表达Nrf2的U251和U87细胞的存活率显著增加（图3（a）与转染空载体的细胞相比，72h后增加最显著。阿帕替尼治疗组U251细胞形态紊乱，边缘模糊，而Nrf2过表达组则趋于正常，边缘清晰(图3（c）). 在U87细胞中观察到相同的趋势(图3（d）). 流式细胞术显示细胞周期在G₀/G公司₁期，S期减少，G期无明显变化₂/用阿帕替尼处理72h后的M期，表明阿帕替尼可阻断G期细胞的生长₀/G公司₁阶段。Nrf2过度表达后，G₀/G公司₁U87细胞在S期细胞周期增加，表明抑制细胞生长的作用减轻。然而，U251细胞的结果显示，用阿帕替尼处理的Nrf2过表达细胞和非过表达细胞之间没有任何相关差异（图3（e）–3（h））。此外，LDH水平（图4（a）和4（b）），ROS（图4（c）–4（f）），MDA（图4（克）和4（h））和Fe（图5（a）和5（b））显著升高，而GSH水平（图5（c）用阿帕替尼处理U251和U87细胞72h后，5（d）和5（b））含量下降，表明细胞受到损伤。在阿帕替尼治疗的基础上，Nrf2的过表达可以降低阿帕替尼治疗的效果，从而减少细胞损伤。此外，在阿帕替尼处理的细胞中，Nrf2的过度表达增加了GPX4和SLC7A11的表达水平（图5（e）和5（f））。此外，Nrf2过度表达可消除Apatinib激发的胶质瘤细胞中Nrf2和磷酸化VEGFR2的减少以及Keap1的增加（图5（克）和5（h））。这些结果表明，阿帕替尼可以通过调控VEGFR2/Nrf2通路抑制胶质瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡。

在单独的窗口中打开

图3

Nrf2的过度表达可恢复细胞活力的丧失和细胞周期在G₀/G公司₁阿帕替尼诱导期。所有数据均涉及转染空载体（NC）并过度表达Nfr2的U251和U87细胞。（a，b）CCK-8分析显示用阿帕替尼处理24、48和72小时后的细胞活力。（c，d）光学显微镜下细胞形态的代表性图像。（e，g）用阿帕替尼治疗72小时后细胞周期分析的代表性直方图。（f，h）用阿帕替尼治疗72小时后细胞周期相的定量分析。^∗P（P）< 0.05;^∗∗P（P）< 0.01.

在单独的窗口中打开

图4

Nrf2的过度表达可逆转阿帕替尼诱导的铁凋亡。所有数据均指用空载体（NC）转染的U251和U87细胞，在有或无阿帕替尼的情况下治疗72小时后过度表达Nfr2。（a，b）细胞上清液中的LDH水平。（c） DCFH-DA染色U251细胞的流式细胞术代表直方图。（d） DCFH-DA染色U251细胞平均荧光强度的折叠变化。（e） DCFH-DA-染色U87细胞的流式细胞术代表直方图。（f） DCFH-DA-染色U87细胞平均荧光强度的折叠变化。（g，h）MDA细胞水平。^∗P（P）< 0.05;^∗∗P（P）< 0.01.

在单独的窗口中打开

图5

Nrf2过度表达可逆转铁的增加、GSH、GPX4和SLC/A11的减少以及阿帕替尼诱导的VEGFR2/Nrf2/Keap1通路成分表达的变化。（a，b）铁水平；（c，d）谷胱甘肽水平；（e，f）GPX4和SLC7A11的表达水平；U251和U87中Keap1、Nrf2、p-VEGFR2和VEGFR2的（g，h）表达水平。^∗P（P）< 0.05;^∗∗P（P）< 0.01.

本研究得到浙江省医学科技项目（批准号：2018KY291、2018KYS92、2019RC127、2017KY260）、国家自然科学基金（批准号81502147）、浙江省中医药科技计划（批准号2016ZA039、2021ZB036）、，浙江省自然科学基金（批准号：LY21H160007、Y21H16000、LQ18H290002、LQ20H290001、LQ21H16006）、苏州市青年科技项目（批准号KJXW2020067）、浙江省肿瘤医院青年科技创新基金（批准编号：QN201402、QN201902）、，第三届“浙江省新型医学人才工程”