癌症（巴塞尔）。2022年4月；14(8): 1878.
抑制ABCA1胆固醇转运蛋白对上皮性卵巢癌生长和迁移的影响
,1,2,三，*†‡ ,1,三，†‡ ,1,‡ ,1,‡ ,1,4,‡ ,1,‡ ,1,三，‡ ,1,‡ ,1,‡ ,1,三，‡ ,5 ,5 ,6 ,1,三，‡ ,1,7,‡ ,1,三，‡并代表澳大利亚卵巢癌研究8,§
马金·伊瓦尼基，学术编辑和Mikołaj Piotr Zaborowski，学术编辑
2澳大利亚新南威尔士州2145 Westmead儿童医学研究所端粒长度调节室
三澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯州悉尼妇女儿童健康学校，邮编：2052
4澳大利亚新南威尔士州悉尼Garvan医学研究所，2010年
7新南威尔士州儿童癌症研究中心，澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯州悉尼2052
†这些作者对这项工作做出了同样的贡献。
‡澳大利亚儿童癌症研究所隶属于新南威尔士州悉尼和悉尼儿童医院网络，澳大利亚新南威尔士州悉尼2052。
§确认中提供了该组的成员身份。
2022年2月20日收到；2022年3月29日验收。
- 补充资料
GUID:CBD795F4-D745-44CF-B0F0-F381C55C7BBF
- 数据可用性声明
支持本研究结果的数据可从相应作者处获得(mhenderson@ccia.org.au)应合理要求。
摘要
简单摘要
卵巢上皮癌（EOC）是最致命的妇科癌症。超过80%的病例在确诊时已经扩散，这些患者面临35%的五年生存率。EOC细胞通常扩散到大网膜，即腹部脂肪垫。这里，EOC细胞摄取胆固醇。过量的胆固醇是致命的；因此，我们提出ABCA1胆固醇转运蛋白从浆液性EOC细胞中输出胆固醇以维持胆固醇平衡。事实上，我们发现降低ABCA1水平可以在二维和三维细胞培养中抑制浆液性EOC生长，并阻碍其迁移，这是癌症扩散所需的关键过程。我们还发现了通过抑制胆固醇输出来损害EOC细胞生长的药物。我们的数据表明，通过靶向ABCA1破坏胆固醇平衡可能是EOC患者的有效治疗策略。
摘要
背景：上皮性卵巢癌（EOC）是最致命的妇科恶性肿瘤，超过80%的病例在诊断时已经扩散，面临着35%的惨淡五年生存率。EOC细胞经常扩散到大网膜，在那里它们吸收胆固醇。过量的胆固醇可能会导致细胞死亡，这表明胆固醇通过转运体流出可能对维持体内平衡很重要，这可能解释了以下观察结果：ATP-结合盒A1（ABCA1）胆固醇转运体的高表达与EOC患者的不良预后有关。方法：通过生长和迁移实验、三维球体培养和胆固醇定量，沉默EOC细胞中ABCA1的表达，研究抑制胆固醇流出对EOC生物学的影响。结果：ABCA1抑制显著降低EOC细胞系的生长、运动和集落形成，以及EOC球体的大小，而刺激ABCA1的表达可逆转这些作用。在浆液性EOC细胞中，ABCA1抑制诱导胆固醇积聚。使用甲基-B-环糊精降低胆固醇水平可以缓解ABCA1抑制作用，恢复EOC生长。此外，我们确定了FDA批准的药物，这些药物可以诱导胆固醇积聚并在EOC细胞中引发细胞杀伤作用。结论：我们的数据证明了ABCA1在维持EOC细胞胆固醇平衡和恶性特性方面的重要性，突出了其作为该疾病治疗靶点的潜力。
关键词：上皮性卵巢癌，ABCA1，胆固醇
1.简介
上皮性卵巢癌（EOC）是最致命的妇科恶性肿瘤，晚期疾病患者的五年生存率仅为35%[1]. 卵巢上皮细胞起源于卵巢外表面的卵巢上皮，可分为五种组织学亚型，即高级浆液性（HG-SOC；占所有病例的70%）、低级浆液性、子宫内膜样、透明细胞和粘液性肿瘤[2,三]. HG-SOCs被认为来自输卵管的纤毛细胞，高度增殖，80%的病例是TP53突变[三,4]. 低级别浆液性EOC更为罕见，通常不会出现TP53突变[三,4]. 子宫内膜样EOCs占所有EOCs的10-20%，并表现出一系列体细胞突变，包括ARID1A和PTEN[三,4]. ARID1A突变也常见于透明细胞癌，约占所有EOC的5%[三,4]. 粘液性是最罕见的亚型，占EOC的2-3%，以KRAS突变为特征[三,4]. 与其他亚型相比，高级别浆液性和子宫内膜样卵巢癌的临床预后最差[三,4]. EOC患者的治疗通常从肿瘤去积木手术开始，然后联合卡铂和紫杉醇化疗[4,5,6]. 尽管使用了强化化疗，EOC患者的生存率在过去几十年中几乎没有改善，这促使人们需要更有效、毒性更小的治疗。
EOC治疗失败的一个原因是，超过80%的EOC患者在诊断时已经患有侵袭性、播散性（3或4期）疾病[7]. 通过将EOC细胞脱落到腹膜腹水中，发生跨腔播散，腹水是EOC向腹腔器官、腹膜和大网膜迁移的介质[8]. 大网膜是EOC的常见传播部位，因为网膜脂肪细胞和脂肪源性干细胞（ADSC）分泌脂肪因子和生长因子，诱导EOC细胞归巢并使肿瘤快速生长[9,10,11]. 卵巢癌细胞可以从细胞外环境中摄取胆固醇和其他脂质，从而改变脂质代谢[9,12,13,14]. 在癌症生物学的背景下，胆固醇通常与促癌作用有关，例如形成脂筏以提高促生长受体的表达[9,15]. 然而，细胞胆固醇的积累可以杀死细胞，这一现象在巨噬细胞中得到了最好的证明，过量的胆固醇导致了细胞凋亡[16,17,18,19,20]. 这表明，存在于富含胆固醇环境中的细胞，如EOC细胞，可能对胆固醇平衡有着关键的需求，这可以部分通过膜结合胆固醇流出转运体的作用来实现。
在三阴性乳腺癌中，另一种妇科恶性肿瘤在富含胆固醇的环境中生长，通过抑制ATP-结合盒A1（ABCA1）胆固醇转运蛋白而损害胆固醇流出，导致胆固醇稳态破坏和恶性特征受损[21,22]ABCA1的高表达与本病中的高级别肿瘤相关[14]. 在EOC中，我们先前发现ABCA1表达升高与不良临床结局相关[23]这表明胆固醇外流在该病中也起作用。
我们对ABCA1在EOC胆固醇平衡中的作用进行了详细的研究。我们首次确定了ABCA1抑制对EOC细胞内胆固醇平衡、细胞生长和迁移以及三维EOC球体特征的影响。
2.材料和方法
2.1. 患者队列
来自澳大利亚卵巢癌研究（AOCS）的150名浆液性卵巢癌患者和61名子宫内膜样卵巢癌患者的样本，该研究是2002年至2006年间进行的一项基于人群的病例对照研究。另外19个子宫内膜样EOC样本来自澳大利亚悉尼Westmead医院（GynBiobank）的妇科肿瘤生物库。在化疗暴露之前，在手术拆散时获得新鲜的冷冻肿瘤标本。经验证，样品中含有至少70%的肿瘤组织。浆液性和子宫内膜样EOC队列均由所有手术阶段的肿瘤组成（根据FIGO分类），中位临床随访时间为46.4个月。使用标准方法提取RNA样本。组织样本和病历数据的使用由各个机构审查委员会批准用于每个患者队列。该项目由新南威尔士大学人类研究伦理委员会（HC12551）批准。
2.2. 细胞系和维护
EOC细胞系HEY、PEO4和JAM是Georgia Chenevix-Trench（QIMR Berghofer Medical Research Institute，Brisbane，QLD，Australia）赠送的礼物，而27/87和SKOV3细胞则是Anna deFazio（Westmead Millennium Institutes for Medical Reseach，Westmeod，NSW，Austraia）提供的礼物。Topp等人首次描述了患者衍生的WEHI-CS62 EOC细胞系（2014）[24]. 非恶性人类卵巢表面上皮细胞（HOSE6.3）由Caroline Ford（Lowy Cancer Research Centre，Kensington，NSW，Australia）善意提供。
WEHI-CS62细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、1µg/mL氢化可的松（西格玛，圣路易斯，密歇根州，美国）、8µg/mL胰岛素（西格马，密歇比州圣路易斯市，美国）和0.05μg/mL表皮生长因子（蓝宝石生物科学，新南威尔士州，澳大利亚）的DMEM F12（Gibco，Waltham，MA，USA）中生长。将HOSE6.3细胞培养在199培养基和MCDB 105培养基中，以1:1的比例混合10%FBS和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺。所有其他细胞系均保存在含有10%FBS的RPMI培养基（Gibco，Waltham，MA，USA）中。细胞每周用胰蛋白酶分裂两次，但WEHI-CS62 EOC细胞除外，其中Puck的EDTA（140 mM NaCl，5 mM KCl，5.5 mM葡萄糖，4 mM NaHCO三使用0.8 mM EDTA和9 mM HEPES）。所有细胞系均经STR分析，与参考样品100%匹配，无支原体，每6个月使用MycoAlert支原体检测试剂盒（瑞士巴塞尔Lonza）进行检测。
2.3. 定量PCR（qPCR）
采用7900HT Fast Real-Time PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）进行逆转录酶（RT）-qPCR，以确定ABCA1的基因表达水平。如前所述，使用MMLV逆转录酶（澳大利亚新南威尔士州悉尼生命科技公司）逆转录RNA[23]. 使用TaqMan测定ABCA1的mRNA表达水平®96 well平板格式的基因表达分析（ID:Hs00194045_m1）（每孔20 ng cDNA（mRNA当量））。使用ΔΔCt方法定量与对照基因（HPRT，ID:Hs99999909_m1和GUSB，ID:Hs99999908_m1）表达相关的基因表达水平，并计算表达值的平均值。相对基因表达水平通过对数归一化2转型。
2.4. 西方印记
如Jung等人（2020年）所述，进行蛋白质提取和蛋白质印迹[22]. 微小变化包括将球体在放射免疫沉淀缓冲液中孵育30分钟，并将20–50μg/孔蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上。
使用的抗体是针对ABCA1（小鼠单克隆抗体（AB.H10）#Ab18180；英国剑桥Abcam；1:750至1:1000），ß-actin（兔子多克隆#A2066；美国密歇根州圣路易斯Sigma-Aldrich；1:2000至1:3000，抗兔子HRP#A0545；美国密西西比州圣路易斯西格马·阿尔德里奇；1:10000）或抗鼠HRP（#NXA931；美国宾夕法尼亚州拉德诺VWR；1:5000）。除抗肌动蛋白抗体（用2.5%牛血清白蛋白稀释）外，所有抗体均在5%脱脂奶中稀释。使用Clarity ECL Western Blotting Substrate（BIO-RAD，Hercules，CA，USA）检测信号。
2.5. siRNA转染
使用Lipofectamine 2000（Gibco，Waltham，MA，USA）将10 nM ABCA1特异性siRNA（siRNA-1 5′GGAGAGUGUAUACAUAGUUUU 3′；siRNA-2 GAAGAAACUGUGUUGUCUAU，Dharmacon，Lafayette，CO，USA，合流率为50-60%的HEY，27/87和JAM细胞转染10 nM的ABCA1-specific siRNA（siRNA-1 5'GGAGGUAGUUACAUACAGUUU 3'；siRNB-2 GAGAAAACUGCUGUUCUAU，Dharmcon，CO，US）或根据制造商的说明。在相同条件下转染WEHI-CS62细胞，但使用脂质体RNAimax（Gibco）作为载体。
2.6. 增长曲线
HEY和27/87细胞在转染后24小时，1×105细胞/孔置于6孔板中，并在指定的时间点采集和计数。
2.7. 溴脱氧尿苷（BrdU）掺入分析
根据制造商的说明，使用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入测定试剂盒（Sigma-Aldrich，St.Louis，MI，USA）进行BrdU掺入测定，除了在含有10%FBS的PBS中包含固定后阻断步骤。
2.8. 细胞凋亡检测
如Gao等人（2020）所述，使用膜联蛋白V和碘化丙啶染色评估细胞凋亡[25]. 在转染后72小时对HEY和27/87细胞进行检测。
2.9. 伤口愈合试验
如Henderson等人（2011年）所述，使用伤口愈合分析测量细胞迁移[26]. 微小变化包括转染24小时后4×10接种细胞4每个培养插入室的细胞数（Ibidi），HEY在接种后16小时和27/87细胞系在接种后24小时取出插入物，分别在4.5小时和16小时后拍照。
2.10. 3D球体的生长
通过测量球体中的体积和/或细胞数来评估3D中的细胞生长。将EOC细胞以8×10的密度接种到96个超低粘附板（美国纽约州康宁市康宁市ULA板）中三HEY、JAM和WEHI-CS62细胞系和6×10的细胞/孔三27/87、PEO4和SKOV3细胞系的细胞数/孔。在评估ABCA1抑制的效果时，在转染后24小时进行接种。
为了评估球体体积，使用奥林巴斯BX53显微镜在指定时间点放大50倍拍摄球体图像。在使用公式r=√（面积/π）和V=4/3（πr）外推半径和体积之前，使用ImageJ软件测量圆形面积三)分别是。在用血球仪计数细胞之前，通过在胰蛋白酶中分离球体2–5分钟并旋转来确定每个球体的细胞数。
为了评估化学试剂对球体生长的影响，如上所述将HEY和HOSE6.3细胞接种到ULA板上，并培养24小时，然后添加指定剂量的盐霉素、氟哌啶醇、二十碳五烯酸（EPA）、达沙替尼或二甲基亚砜。在拍摄、分离球体之前，将球体再培养72小时，计算每个球体的细胞数并确定球体体积。
2.11. 基因集富集分析
表达数据使用公开的高级别血清数据集从癌症基因组图谱（TCGA）下载(n个= 498). 患者肿瘤被分为高（上四分位数；n个=122）或低（下四分位数；n个=123）与18462个注释基因的整个队列相比，ABCA1的表达。使用Broad Institute开发的软件，将标准化表达值用作基因集富集分析（GSEA）的输入。使用分子特征数据库Hallmark（v7.1）和C5:GO（v7.1。如果基因集有错误发现率（FDR），则认为该基因集是重要的q个-值<0.1。
2.12. 胆固醇提取和定量
根据制造商的说明，使用来自Abcam的胆固醇/胆固醇酯检测试剂盒提取并定量胆固醇。微小的改进包括每个样品采集至少100万个细胞，在室温下将样品分别以7:11:0.1的比例在氯仿、异丙醇和NP-40的缓冲液中培养1-2小时，同时摇晃并向反应混合物中添加胆固醇酯酶以测量总胆固醇。在转染甲基B环糊精（MBCD）或转染后24小时添加载体（水）后48小时，对HEY、JAM和27/87细胞进行胆固醇定量，以评估ABCA1抑制的效果和MBCD去除细胞内过量胆固醇的效果。为了对具有ABCA1相关水平的WEHI-CS62细胞进行实验，将细胞进行3D培养，因为ABCA1表达水平在这些条件下会增加。在转染后24小时，将细胞接种到带有或不带有MBCD的超低粘附板中，并在收获前再培养48小时。胆固醇水平表示为相对于对照siRNA转染细胞的倍数变化。
2.13. 细胞活性测定
将HEY和HOSE6.3细胞以1×10的速度接种到96个培养板中三和8×10三细胞/孔，以在24小时后达到40-50%的融合，此时添加剂量递增的氟哌啶醇、盐霉素或载体（DMSO）。细胞用试剂处理72小时，然后用以瑞沙林为基础的试剂（Sigma-Aldrich）在10%培养基体积下培养3-5小时。在570-595 nm处使用Benchmark Plus平板阅读器（BIO-RAD）测量归一化为DMSO处理细胞的活率百分比。IC50是通过使用GraphPad Prism v8拟合非线性回归曲线来外推的。
2.14. 一般统计分析
使用单向方差分析比较EOC肿瘤样本和细胞株之间ABCA1基因表达值。除非另有规定，否则所有实验均至少进行了三次独立运行。第页-以相对于对照siRNA处理或DMSO处理细胞的折叠变化表示的数据值来自一个样本t吨-试验，但涉及MBCD处理的试验除外。对于涉及MBCD处理的实验，第页-这些值是通过Tukey多重比较试验从双向方差分析得出的。对于其他具有多重比较的实验，使用Dunnett的多重比较检验进行了单向方差分析。使用GraphPad Prism v8进行体外实验的所有统计测试。所有结果均表示平均值±标准偏差（SD）。第页-数值<0.05被认为是显著的。
3.结果
3.1. ABCA1抑制对卵巢上皮癌细胞恶性表型的影响
由于ABCA1的高表达与EOC的不良预后相关[23]，我们想确定表达ABCA1水平的细胞系，代表预后不良患者的肿瘤。因此，我们使用RT-qPCR评估了一组EOC细胞系中ABCA1的表达水平，并将其与EOC患者肿瘤（150例浆液性肿瘤和80例子宫内膜样肿瘤）队列中的表达水平进行了比较。包括27/87、PEO14、HEY、A2780和OVCAR3在内的一组细胞株的ABCA1表达水平高于或接近患者队列的中位数表达水平(A） ●●●●。被认为是主要EOC亚型的代表，适合体外检测，从这些细胞系中选择浆液性HEY和高级子宫内膜样27/87细胞系进行进一步实验(A） ●●●●。为了研究ABCA1在这些EOC细胞中的生物学作用，两个独立的ABCA1特异性siRNA分别抑制ABCA1的表达(B和图S6.ABCA1抑制降低了两种细胞系的克隆原性和生长(C、 D）。BrdU掺入分析显示，响应ABCA1的缺失，HEY细胞的增殖显著减少(E） ●●●●。27/87细胞也观察到类似的趋势，但siRNA-2诱导的增殖减少没有达到统计学意义(E） ●●●●。根据膜联蛋白V染色，27/87细胞在转染ABCA1特异性siRNAs后48小时显示凋亡细胞比例显著增加(F） ●●●●。ABCA1抑制也能诱导HEY细胞凋亡，但其作用无统计学意义(F） ●●●●。因此，ABCA1抑制对增殖和凋亡有负面影响，但这两种EOC细胞类型的影响程度不同。
ABCA1是上皮性卵巢癌（EOC）细胞单层快速生长所必需的。(A类)RT-qPCR评估一组细胞系和卵巢癌肿瘤中ABCA1的表达。将ABCA1 mRNA表达归一化为对照基因GUSB和HPRT，并绘制出与PEO4中ABCA1表达相关的图表。黑色代表该组ABCA1表达的中位数。(B类)Western blot显示浆液性HEY和子宫内膜样细胞27/87细胞系中两个独立的siRNA对ABCA1的敲除程度。(C类)抑制ABCA1可降低EOC细胞的集落形成能力。n个= 3.第页-数值来源于一个样本t吨-测试。(D类)根据细胞计数，ABCA1基因敲除降低了EOC细胞的生长。n个≥ 3.第页-通过Dunnett的多重比较测试，从双向方差分析中得出数值。(E类)siRNA-1和siRNA-2敲低ABCA1可降低EOC细胞的增殖速度。n个对于HEY＝4，n个27/87为3。第页-数值来源于一个样本t吨-测试。(F类)通过Annexin V和碘化丙啶染色检测到，siRNA-1和siRNA-2敲低ABCA1可增加27/87细胞的凋亡。n个= 3.第页-数值来自Dunnett多重比较试验的双向方差分析。所有结果均表示平均值±标准偏差（SD）。
通过监测转染ABCA1 siRNA后细胞在人工“伤口”上移动的能力，研究ABCA1抑制对EOC细胞运动的影响。限制每个细胞系的迁移分析时间，以确保细胞加倍对伤口闭合率的影响最小(图S1). ABCA1抑制使HEY细胞的伤口闭合能力降低20–35%(A；第页= 0.029; 0.009）和27/87个细胞的40–60%(B类；第页=0.001），表明ABCA1表达有助于EOC细胞迁移。
ABCA1支持上皮性卵巢癌细胞的迁移。对进行的伤口愈合分析(A类)嘿，还有(B类)27/87个EOC细胞有或没有ABCA1抑制。相对伤口大小的变化表示为对照组的百分比。n个= 3 (A类),n个= 4 (B类). 结果表示平均值±SD。第页-数值来源于一个样本t吨-测试。
3.2. ABCA1抑制阻碍了三维结构的发展
与单层培养的细胞相比，培养的EOC细胞具有更能代表患者肿瘤的特征，可以形成三维球体[27,28,29]. 因此，研究了ABCA1抑制对球体特性的影响。与对照细胞相比，HEY或27/87细胞中ABCA1的耗尽导致球体大小和每个球体的细胞数显著减少(A、 B和图S6鉴于这一结果，我们将研究扩展至对化疗无效的早期传代患者衍生的高浓度浆液性EOC细胞系WEHI-CS62[24]. 有趣的是，当WEHI-CS62细胞保持悬浮培养时，ABCA1蛋白表达增强(图S2). ABCA1抑制也导致该细胞系中球体体积和细胞数量减少(C） ●●●●。相反，当细胞暴露于肝X受体激动剂T0901317后诱导ABCA1表达时[30]在WEHI-CS62、HEY和27/87细胞中观察到较大球体的形成(D–F）。在HEY细胞中，经T090117处理后，siRNA对ABCA1的抑制可部分逆转(E、 左上面板），这反过来又导致了球体大小的恢复(E、 底部面板）。T0901117没有恢复27/87细胞中ABCA1的表达，这与球体大小缺乏恢复一致(F、 左上和下面板）。总之，这些数据表明ABCA1的高表达支持EOC细胞在三维结构中的生长。
ABCA1抑制降低了上皮性卵巢癌（EOC）球体的大小。(A类)代表性照片（左侧面板）和柱状图（右侧面板）显示了ABCA1抑制对HEY和27/87 EOC球体大小的影响，在植入低粘附板后72小时和转染后96小时。n个= 3.第页-数值来源于一个样本t吨-测试。(B类)HEY和27/87细胞中ABCA1抑制后每个球体的细胞数变化。同时进行的分析(A类).n个= 3.第页-数值来源于一个样本t吨-测试。(C类)代表性照片（左面板）和柱状图（右面板）显示了ABCA1抑制对WEHI-CS62患者衍生的高级浆液性EOC球体大小的影响，植入低粘附板后72小时和转染后96小时。n个= 3.第页-数值来源于一个样本t吨-测试。(D类)使用T0901117实现的ABCA1过度表达对WEHI-CS62球体大小的影响。n个= 3.第页-值来自未配对、双尾t吨-测试。(E类)使用T090117实现的ABCA1重新表达对HEY球体大小的影响。n个= 3. (F类)使用T090117实现的ABCA1重新表达对27/87球体大小的影响。n个= 3. 所有结果均表示平均值±SD。第页-通过Dunnett的多重比较测试从单向方差分析得出的值。比例尺表示500µm。
3.3. ABCA1抑制诱导EOC细胞胆固醇积累
为了从机理上了解ABCA1高表达在EOC细胞生物学中的意义，使用TCGA中公开的高级别浆液性EOC数据集进行了基因集富集分析（GSEA）(n个=498），ABCA1高表达与不良预后相关[21]. 测定并富集ABCA1高表达和低表达水平的EOC肿瘤之间差异表达的基因，以确定与EOC中ABCA1表达高相关的途径和生物过程。参与胆固醇稳态的基因出现在排名最高的癌症标志性途径中(A） 以及与高ABCA1表达相关的前五个生物学过程（即，单核细胞迁移的调节、破骨细胞分化、参与免疫反应的B细胞激活、甾醇转运和血管内皮生长因子受体信号通路的正调节；B和图S3). 该分析表明，ABCA1的高表达水平可能会影响预后不良肿瘤的胆固醇途径。
基因集富集分析（GSEA）显示ABCA1高的EOC肿瘤富含与胆固醇代谢相关的基因集表达。(A类)GSEA显示参与胆固醇稳态的Hallmark基因集富集。第页=0.008，错误发现率（FDR）=0.021。(B类)GSEA显示，参与固醇转运正向调节的基因本体（GO）基因集富集。第页<0.001且FDR=0.069。n个= 498.
为了研究ABCA1在EOC细胞中是否作为胆固醇转运蛋白发挥作用，在ABCA1抑制后测量细胞内胆固醇水平。在HEY和WEHI-CS62浆液性卵巢癌细胞系中均观察到胆固醇蓄积，但在高级子宫内膜样27/87细胞系中未观察到胆固醇积聚(A） ●●●●。因此，进一步研究了ABCA1抑制介导的胆固醇积聚对浆液性HEY和WEHI-CS62细胞的影响。
ABCA1抑制导致浆液性卵巢癌细胞中胆固醇积聚，这与EOC细胞生长减少有关。(A类)ABCA1抑制后细胞内胆固醇水平的变化。n个=5，对于浆液性HEY和WEHI-CS62细胞。n个子宫内膜样细胞27/87为3。(B类)使用甲基-B-环糊精（MBCD）去除胆固醇可逆转ABCA1抑制对HEY（上部面板）和WEHI-CS62（下部面板）3D生长特性的影响。实验在3D培养中144小时或转染HEY后168小时进行，在3D培养中72小时或转染WEHI-CS62后96小时进行。n个=5，HEY和n个=3（对于WEHI-CS62电池）。(C类)在与(B类).n个=5，HEY和n个=3（对于WEHI-CS62电池）。所有结果均表示平均值±标准偏差。第页-的值(A类)来源于一个样本t吨-测试，而所有其他第页-这些值是通过Tukey的多重比较测试从双向方差分析得出的。比例尺表示500µm。
为了测试ABCA1介导的细胞内胆固醇平衡紊乱是否是阻碍浆液性EOC球体生长的潜在因素，研究了在ABCA1抑制的情况下使用甲基B环糊精（MBCD）消耗细胞内胆固醇的效果。事实上，MBCD抵消了ABCA1抑制后EOC细胞积累的胆固醇，将其胆固醇含量降低到与对照细胞相似的水平(图S4). 反过来，MBCD降低胆固醇使HEY和WEHI-CS62球体的大小恢复到对照siRNA处理细胞中观察到的水平(B） 导致每个球体的细胞数量增加(C） ●●●●。
3.4. FDA批准的药物阻断胆固醇外流对EOC细胞恶性表型的影响
ABCA1介导的胆固醇积聚能够损害浆液性EOC细胞的生长，这提出了一个问题，即模拟这种作用的药物是否对EOC有效。据报道，盐霉素和氟哌啶醇是几种治疗性干预措施之一，可诱导胆固醇积聚，并抑制三阴性乳腺癌的侵袭性表型[20]. HEY细胞中氟哌啶醇和盐霉素的IC50浓度分别为48.72µM和11.13µM(A） ，并且对肿瘤细胞的选择性从测试对非恶性HOSE6.3细胞的细胞毒性的类似测定中是明显的，其中IC50值被确定为显著更高(图S5). 将HEY细胞暴露于IC50或亚致死剂量的药物（即30µM氟哌啶醇；5µM盐霉素）可诱导细胞内胆固醇显著升高(B） ，与ABCA1 siRNA抑制后观察到的结果一致(A） ●●●●。此外，培养成3D球体的HEY细胞暴露于盐霉素或氟哌啶醇会导致细胞数量的剂量依赖性减少(C） ●●●●。这些药物在WEHI-CS62细胞中也观察到类似的抗生长作用(D） 。为了确定这些药物对非恶性细胞的杀伤作用是否较低，我们对非恶性人类卵巢表面上皮（HOSE6.3）细胞进行了基于resazurin的活性测定。氟哌啶醇在153.9µM时的IC50显著高于HEY细胞，而盐霉素的IC50稍高（IC50=17.37µM，图S5).
据报道，诱导胆固醇积聚的药物对EOC球体形成和细胞生长的影响。(A类)基于雷沙祖林的测定产生的剂量-反应曲线显示，治疗72小时后，氟哌啶醇和盐霉素对恶性浆液性EOC HEY细胞的半数最大抑制浓度（IC50）。细胞在单层条件下培养。存活率是指药物处理细胞的存活率，表示为DMSO处理细胞存活率的百分比。(B类)48-72小时后胆固醇定量显示盐霉素和氟哌啶醇对HEY细胞的影响。细胞在单层条件下培养。(C类)柱形图表示HEY细胞在使用载体或其中一种指定药物治疗72小时后形成的每个球体的细胞数变化。(D类)柱形图表示WEHI-CS62细胞在使用载体或其中一种指定药物治疗后形成的每个球体的细胞数变化。n个对于所有实验均为3。第页-的值(B类–D类)来源于一个样本t吨-除了达沙替尼和EPA联合用药与单药单独用药之间的细胞计数比较外，对其进行了单因素方差分析和Dunnett的多重比较试验。结果表示平均值±SD。
最近在三阴性乳腺癌模型中发现，达沙替尼和二十碳五烯酸（EPA）联合使用可诱导胆固醇积聚，导致癌细胞活性比单独使用更大的损失[19]. 达沙替尼已被临床用于耐铂EOC患者，15%的患者表现出完全缓解[29]这表明，将这种药物与EPA结合可能会带来额外的好处。用达沙替尼或EPA处理HEY和WEHI-CS62细胞可显著降低这两种细胞系在3D培养中的生长，尽管这两种药物联合使用未观察到进一步的增强作用(C、 D）。这表明添加EPA不会进一步增强达沙替尼在这些模型中的作用。综上所述，这些数据支持盐霉素和氟哌啶醇作为治疗浆液性EOC和ABCA1高表达患者的潜在选择。
4.讨论
几十年来，EOC患者的五年生存率没有提高，这表明迫切需要针对这种疾病的新型高选择性、分子靶向治疗。富含脂肪的大网膜是EOC细胞表现出胆固醇摄取增加、胆固醇和脂质代谢改变的首选播散部位。许多研究表明，胆固醇或脂质水平升高会增强癌症的侵袭性。然而，这项研究证明了ABCA1转运体在去除细胞内胆固醇和维持胆固醇稳态以实现细胞快速生长和运动方面的关键重要性。这项工作还强调了目前用于其他疾病的几种FDA批准的药物，这些药物可能被证明对EOC细胞有效，因为它们具有诱导胆固醇积聚的能力。因此，ABCA1是EOC的潜在治疗靶点，已知可诱导细胞内胆固醇积聚的药物的再利用可能有助于治疗这种侵袭性疾病。
这项研究有助于阐明为什么ABCA1的高表达以前与该病的不良临床结局有关[23]. 有相互矛盾的证据表明ABCA1在癌症生物学中的生物学作用。虽然某些研究表明ABCA1的高表达促进了人类前列腺癌和乳腺癌细胞的迁移和生长[21,22,31]，其他研究表明ABCA1抑制p53野生型大肠肿瘤和口腔癌细胞的生长[30,32]或者在某些情况下，ABCA1超甲基化可能与EOC细胞生长增加有关[33]. 本研究详细描述了高水平ABCA1表达如何通过增强细胞生长和运动性来促进EOC恶性肿瘤。这是第一份将维持胆固醇平衡作为EOC潜在致命弱点的报告。由于网膜脂肪细胞产生归巢脂肪因子，如IL6和IL8，人类浆液性EOC细胞倾向于转移到网膜，人们认为它们从脂肪细胞中摄取脂质并转向氧化磷酸化以产生能量[8]. 与非恶性卵巢上皮细胞相比，卵巢上皮细胞胆固醇水平也较高[12]. 这些观察结果支持了这样一个概念，即在EOC生物学中，胆固醇主要起促进肿瘤进展的作用。然而，巨噬细胞中胆固醇水平过高会诱导细胞毒性[20,34,35,36]. 这里提供的新数据表明，浆液性EOC细胞中存在细胞内胆固醇的上限，超过该上限，胆固醇会限制生长或迁移。关于三阴性乳腺癌中ABCA1的抑制也有类似的观察[21,22]与目前的研究一起表明，对于在富含胆固醇的环境中生长的癌症，阻断胆固醇流出可能是一种可行的治疗策略。
胆固醇积累影响浆液性EOC生长的一种可能机制与胆固醇和磷脂之间的比率有关，后者决定了细胞膜的流动性以及细胞改变形状和迁移的能力。在三阴性乳腺癌中，细胞膜中胆固醇水平升高会降低膜流动性，导致细胞迁移问题[22]. 据报道，细胞内胆固醇升高可通过多种途径诱导细胞凋亡。例如，Fas/CD95死亡受体可以聚集在富含胆固醇的细胞的脂筏中，触发细胞凋亡，这种现象通过MBCD-介导的胆固醇耗竭是可逆的[37,38]. 内质网或线粒体中胆固醇超载引起的压力也会触发细胞凋亡[35,38,39,40]. 进一步研究EOC细胞中观察到的胆固醇积累是否会通过这些途径损害细胞生长和迁移，进而为靶向治疗提供额外的途径。
由于ABCA1不是唯一具有胆固醇外排功能的转运蛋白，同时靶向其他胆固醇转运蛋白可能会对胆固醇积累产生更有效的影响。例如，已知ABCG1会排出胆固醇，并且需要ABCA1和ABCG1的表达来耗尽肿瘤相关巨噬细胞中的脂筏[41]. 识别能够补偿EOC中ABCA1丢失的转运体将确定哪些转运体可能与ABCA1一起作为靶点，以增强ABCA1抑制的抗肿瘤作用。
通过发现胆固醇积聚损害浆液性EOC细胞生长的能力，这项研究提出了一个问题，即发挥这种功能的药物是否可以有效治疗这些EOC。事实上，这里我们显示氟哌啶醇和盐霉素可以减缓浆液性EOC细胞的生长。由于这些化合物得到了美国食品和药物管理局（FDA）的批准，它们可能适合EOC患者的临床转化。虽然没有研究报告在EOC细胞上使用氟哌啶醇或达沙替尼和EPA的联合用药，但盐霉素和达沙替尼可作为单一药物降低EOC的侵袭性。虽然这项研究还发现达沙替尼可以在浆液性EOC细胞中发挥强大的抗癌功能，但在这里研究的细胞系中未观察到EPA进一步增强其功效。这与三阴性乳腺癌的观察结果相反，EPA与达沙替尼联合使用导致细胞内胆固醇积聚，这可能是三阴性乳腺肿瘤模型中观察到的高抗生长作用的一个潜在解释[21]. 缺乏证据表明这种药物组合可以诱导EOC细胞中胆固醇积聚，这可能是缺乏增强作用的原因。总的来说，我们已经表明，尽管本研究中测试的四种药物的作用模式和适应症不同，但盐霉素和氟哌啶醇诱导胆固醇积聚的能力使它们能够对EOC细胞产生选择性的抗生长作用。
虽然我们的研究主要集中于ABCA1的胆固醇流出功能，但值得注意的是，27/87细胞系中的数据表明ABCA1可能独立于其胆固醇流出功能而参与EOC生物学。由于在该细胞系中没有观察到胆固醇的积聚，尽管ABCA1的抑制阻碍了生长和迁移，因此在这种情况下，可能是胆固醇以外的ABCA1底物（如鞘氨醇-1-磷酸）的流出减少造成了这些影响[41,42,43,44]. 相反，由于我们的数据显示ABCA1对27/87恶性肿瘤的作用是非胆固醇依赖性的，并且我们的重点是ABCA1的这种特殊功能，因此我们尚未研究诱导胆固醇在该细胞系中积聚的影响。如果在该细胞系中诱导胆固醇积累具有细胞杀伤作用，那么氟哌啶醇或盐霉素等化合物可以作为这种子宫内膜样EOC的潜在治疗方法。
5.结论
总之，抑制ABCA1可以减少EOC细胞的生长和迁移，在浆液性EOC细胞中，这些影响部分是由细胞内胆固醇积聚引起的。总之，本文提供的数据表明，ABCA1可以通过维持胆固醇稳态来支持浆液性EOC细胞的生长，这可能是为什么发现ABCA1肿瘤表达升高的浆液性卵巢癌患者生存率较低的潜在解释。因此，ABCA1是该病的潜在治疗靶点，FDA批准的诱导胆固醇积聚的药物应进一步研究EOC。
补充资料
以下内容可在线获取，网址为https://www.mdpi.com/article/10.3390/cancers14081878/s1图S1:HEY和27/87 EOC细胞的倍增时间；图S2：在单层或球体培养条件下生长的各种EOC细胞系中ABCA1蛋白表达的蛋白质印迹和各自的密度测定分析（柱状图）；图S3：在上皮性卵巢癌中ABCA1高表达的EOC肿瘤中富集的其他基因集富集分析（GSEA）途径；图S4：细胞内胆固醇水平的量化显示了甲基-B-环糊精（MBCD）抵消ABCA1抑制引起的胆固醇积聚的能力；图S5：治疗72小时后，氟哌啶醇和盐霉素对恶性HEY和非恶性人类卵巢表面上皮（HOSE6.3）细胞的差异作用。图S6：原始WB。
作者贡献
获得项目、M.J.H.、M.D.N.和M.H.的资金、概念化和监督。；方法、实验、验证和分析，J.G.、R.T.W.、D.H.、A.J.R.、A.JN.、M.C.和A.B。；生物信息学分析。；项目指南，A.K.、W.J.、G.H.和C.L.S。；澳大利亚卵巢癌研究（G.H.and C.L.S.）患者样本采集。；写作和编辑，J.G.、M.J.H.和M.J.所有作者都审阅了这份手稿。所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项研究由国家卫生和医学研究委员会（APP1016699和APP1132608，M.H.和M.D.N.）、新南威尔士州癌症研究所（10/TPG/1-03，M.H.和M.D.N）和澳大利亚癌症研究院（1067110，M.J.H.）资助。
机构审查委员会声明
该项目由新南威尔士大学人类研究伦理委员会（HC12551）批准。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可从相应作者处获得(mhenderson@ccia.org.au)应合理要求。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
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