前列腺癌雄激素受体和OGT下游VPRBP对p53激活的抑制作用

细胞系

LNCaP和22Rv1细胞从ATCC购买，并在37°C和5%CO的湿化培养箱中在含有10%FBS和1%铅笔-链霉素的RPMI中培养₂从ATCC中获得VCaP细胞，并在37°C和5%CO的湿化培养箱中，在含有10%FBS和1%铅笔-链霉素的DMEM中培养₂细胞通过ATCC使用短串联重复序列（STR）分析进行鉴定。TP53 CRISPR敲除的LNCaP细胞由Peter Nelson博士（华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心）提供，并通过测序和核型鉴定。对所有细胞进行常规测试支原体使用MycoAlert控制集进行污染（Lonza；LT07–518）。

ChIP分析

按照制造商的说明进行ChIP分析（详见补充材料和方法）。ChIP-qPCR引物来自Eurofins基因组学和补充表S2中列出的序列。

实时qPCR

细胞在Qiazol中进行裂解，并使用Qiagen-miRNeasy迷你试剂盒（目录号217004）分离RNA。转录因子第一链cDNA合成试剂盒（目录号04897030001，罗氏生命科学）用于cDNA制备。SYBR Green 1 Master（目录号4887352001，Roche Life Science）用于通过实时PCR（qPCR）比较罗氏LightCycler 480 Instrument II中VPRBP、OGT、CAMKK2、UAP1、COPS3、p53和p21的基因表达变化。采用人大型核糖体蛋白（RPLPO）作为内部对照。qPCR引物购自Sigma（KiCqStart预先设计）或Eurofins基因组学。补充表S3和S4分别提供了底漆的详细信息。

siRNA转染

将LNCaP细胞接种到6孔板上进行siRNA敲除。第二天，根据制造商的说明，在OPTI-MEM中使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂，以30 pmol siRNA/well进行正向转染。隔夜培养后，将培养基更换为含有10%FBS和抗生素的RPMI。针对每个感兴趣的靶点使用两个单独的siRNA。所使用的siRNA为OGT si1、OGT si2、DCAF1 si1、DCAF1 si2和Silencer Select阴性对照No.1 siRNA（详细信息见补充表S5）。对于涉及雄激素治疗的研究，在用1 nmol/L R1881刺激24小时之前，将培养基改为雄激素缺乏的木炭处理培养基3天。在转染后的给定天数后对细胞进行裂解，以通过Western blot或qPCR进行分析。

蛋白质印迹分析

细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）和PhosSTOP（西格玛）的RIPA缓冲液（西格马）中进行裂解；使用Bradford试剂（Bio-Rad）和30µg裂解液估计蛋白质浓度，并使用预制的4%–12%NuPage迷你凝胶进行电泳（生命科技）。然后将分解的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭，并在4°C下用相应的一级抗体隔夜探测。三次洗涤后，用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体探测印迹，并在Syngene G盒中用增强化学发光检测免疫反应性。

环己酰亚胺追踪试验

用OGT si1或阴性对照1号siRNA转染LNCaP细胞。在指定的时间点用50µg/mL环己酰亚胺处理细胞，并在转染开始后72小时收集裂解液进行Western blot分析。

免疫沉淀

简单地说，LNCaP细胞在IP裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl pH7.5、140 mmol/LNaCl、1 mmol/LEDTA、1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠）中进行裂解。用蛋白A琼脂糖珠在旋转器中在4°C下预处理裂解液1小时。使用蛋白A sepharose珠，使用1 mg裂解液和1µg VPRBP抗体进行免疫沉淀（IP）。将裂解液与VPRBP或IgG阴性对照抗体在4°C的旋转器中孵育3小时，然后与40µL洗涤蛋白a琼脂糖珠孵育过夜。在IP洗涤缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，150 mmol/L-NaCl，0.5%Triton X-100）中短暂造粒并洗涤三次。蛋白质在20µL Laemmli缓冲液中在95°C下加热5分钟进行洗脱。

VPRBP O-GlcNA酰化反应分析

简单地说，使用NE-PER核和细胞质提取试剂从含有或不含10µmol/L PUGNaC生长24小时的LNCaP细胞中制备细胞质提取物。根据Click-iT O-GlcNAc酶标记系统协议标记五微克细胞质提取物，并按照前面描述的Click-iT蛋白质分析检测试剂盒协议与炔烃-生物素化合物结合(16). 使用氯仿/甲醇沉淀生物素化裂解产物，在1%SDS、50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）中重新溶解，并用1体积的中和缓冲液（100 mmol/L-NaCl、50 mmol/L Tris-HCl（PH7.4）、5 mmol/LEDTA、6%NP-40）淬火SDS。然后将裂解产物与高容量琼脂糖链霉亲和素树脂在4°C下进行端到端旋转培养过夜。然后在1 mL低盐缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，150 mmol/L.NaCl，0.1%SDS，1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠）中洗涤树脂四次，并在1 mL高盐缓冲液中洗涤一次生物素化蛋白在2×Laemmli缓冲液中用二硫苏糖醇煮沸树脂洗脱。用抗VPRBP和抗G6PD抗体进行Western blotting分析。在没有标记酶GalT1的情况下平行进行对照实验。

细胞计数

在转染后4至5天，对12孔板中的siRNA转染细胞进行细胞计数。在Countess II Lifetechnologies中，对细胞进行胰蛋白酶处理，并通过细胞计数评估细胞数量的变化。

免疫荧光

LNCaP细胞接种在12孔板的玻璃盖玻片上。在达到70%至80%的融合后，用打乱或VPRBP siRNA转染细胞。3天后，用4%多聚甲醛在BSA中固定10分钟，然后在PBS中三次洗涤，每次5分钟。然后将固定细胞在PBS中的0.1%Triton X-100中溶解10分钟，并在封闭缓冲液（5%山羊血清/1%BSA/0.1%Trito X-100 PBS）中封闭1小时。然后在室温下将细胞在抗VPRBP（1:80）和纤维蛋白原（1:100）的一级抗体中培养2小时，然后再培养Alexa Fluor 594山羊抗鼠抗体（Invitrogen，目录号A11020）或Alexa Fuor 488山羊抗R（Invitro gen，目录号A11070）二级抗体。使用Vectashield和DAPI将盖玻片安装在载玻片上。

患者、IHC、TCGA分析和其他数据集可在补充材料和方法中找到。

VPRBP稳定性需要OGT

为了确定VPRBP表达是否需要OGT，我们使用siRNA进行OGT敲除。这表明OGT siRNA转染细胞中的基础VPRBP mRNA水平与打乱对照相比没有显著变化（补充图S2A）。有趣的是，OGT敲除降低了(图2A)和雄激素诱导的(图2B)VPRBP蛋白表达。OGT siRNA转染导致两种siRNA的基础OGT蛋白表达减少>90%，总O-GlcNAc水平减少>80%（补充图S2B）。转染后5天，OGTsiRNA1和OGT siRNA2的VPRBP蛋白表达分别减少约57%和54%（补充图S2B）。由于蛋白质水平的降低可能反映翻译的减少或蛋白质降解的增加，我们使用环己酰亚胺追踪实验（0-8小时）来评估OGT敲除对VPRBP半衰期的影响。我们发现，OGT敲除后，VPRBP蛋白水平从6小时后显著降低，而在对照siRNA转染细胞中，VPRBP水平在任何测试时间点都没有显著变化(图2C; 补充图S2C）。这表明OGT在稳定VPRBP方面发挥着关键作用。

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图2。

VPRBP稳定性需要OGT。A、，将OGT siRNAs瞬时转染LNCaP细胞，转染后5天采集细胞，通过免疫印迹分析检测基础条件下的蛋白表达。B中，为了检测雄激素刺激条件下的蛋白表达，在1 nmol/L R1881刺激24小时之前，用OGT siRNA或干扰siRNA（scr-si）转染LNCaP细胞，然后去除雄激素72小时。C中，在0至8小时内进行环己胺（50µg/mL）追逐实验，以评估OGT敲低（72小时）对VPRBP降解的影响。D、，用RL2抗体通过免疫印迹（IB）检测LNCaP细胞中IP VPRBP的O-GlcNAcylation。E、，从LNCaP细胞质提取物中检测到O-GlcNAcylated VPRBP。在下拉（输入）和捕获蛋白（洗脱）之前，用VPRBP抗体和阳性对照G6PD对裂解液进行免疫印迹（IB）。在没有GalT的对照实验中，显示了在VPRBP和G6PD上选择性标记O-GlcNAcylation。F、，通过免疫印迹分析检测OGT抑制剂40µmol/L OSMI2和10µmol/L OSMI3对24小时治疗后VPRBP蛋白水平的影响。G、，免疫印迹分析OGT敲除对22Rv1细胞VPRBP蛋白表达的影响。

O-GlcNA酰化已被证明直接影响像p53这样的蛋白质的稳定性(10)，c-Myc公司(三)和EZH2(19). 为了确定VPRBP是否为O-GlcNAcylated，我们使用总细胞裂解物进行IP。IP表明VPRBP是一种O-GlcNA酰化蛋白(图2D). 为了进一步确认VPRBP是否为O-GlcNAcylated，我们进行了Click-IT O-GlcNA酶标记分析。用叠氮-N-乙酰氨基半乳糖对LNCaP细胞溶质提取物中的所有O-GlcNAc修饰蛋白进行酶标，这些蛋白在PUGNAc存在和不存在的情况下处理24小时。标记的蛋白质被生物素化，并用链霉亲和素-琼脂糖珠捕获。随后用VPRBP抗体对捕获的蛋白质进行免疫印迹，清楚地显示VPRBP的O-GlcNA酰化(图2E). G6PD，之前通过该方法显示为O-GlcNACyclated(16)，用作阳性对照。与未经处理的样品相比，PUGNAc处理的样品显示VPRBP和G6PD的O-GlcNACylation水平较高（约2倍）和（约2.7倍）。为了进一步证实O-GlcNA酰化在VPRBP稳定性中的作用，我们用OGT活性抑制剂OSMI2和OSMI3处理细胞(20). 我们发现，治疗24小时后，40µmol/L OSMI2蛋白水平的VPRBP表达降低约73%，10µmol/L OSMI3蛋白水平的表达降低约62%(图2F; 补充图S2D）。OSMI治疗通过OGT表达的代偿性上调降低了总O-GlcNA酰化水平(图2F; 补充图S2D）。尽管OSMI2显示VPRBP转录物减少约11%，但OSMI3治疗在转录水平上的VPRBP表达没有显著变化（补充图S2E）。我们还检查了OGT敲除对另一种细胞系22Rv1中VPRBP蛋白表达基础水平的影响，发现OGTsiRNA1和OGT siRNA2分别降低了约87%和76%(图2G; 补充图S2F）。总的来说，这些结果表明VPRBP可能存在双重调节，即VPRBP由AR在mRNA水平上诱导，并通过OGT活性在翻译后稳定。

VPRBP下调稳定p53并抑制LNCaP细胞增殖

在确定VPRBP为AR和OGT靶点后，我们继续测定VPRBP敲除在LNCaP细胞中的表型效应。用VPRBP siRNA敲除导致VPRBP转录物减少约75%，而OGT转录物没有任何显著变化(图3A). 当细胞在含有雄激素的完整生长介质中生长时，VPRBP siRNAs可使细胞数量减少约57%，而雄激素缺乏本身可导致细胞数量减少大约38%(图3B). 此外，B32B3（VPRBP激酶活性的一种有效和选择性抑制剂）的化学抑制作用(17)在5µmol/L浓度下，导致LNCaP细胞增殖减少约64%（补充图S3A）。B32B2 5µmol/L还降低了组蛋白H2A苏氨酸120的磷酸化，Kim和同事们之前已经证明了这一点(17)在DU145电池中（补充图S3B）。与单独的B32B3相比，B32B3和OGT抑制剂的组合没有显示出细胞数量的显著减少（补充图S3A）。

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图3。

VPRBP敲除导致细胞增殖减少和p53稳定。A、，用VPRBP siRNA转染LNCaP细胞，转染后3天采集细胞，检测VPRBP、OGT、p53和p21的mRNA表达(n个= 4).B中，转染后5天通过细胞计数评估VPRBP敲除对LNCaP细胞增殖的影响；细胞在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM）的条件下生长；n个= 4).C中，通过对转染后3天制备的细胞裂解物进行免疫印迹分析，评估VPRBP敲除对LNCaP p53、细胞周期标记物和其他相关蛋白的影响。D、，通过在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM；n个= 4).E、，通过免疫印迹分析评估VPRBP敲除对LNCaP和TP53-KO LNCaP-相关蛋白的影响。F、，在有雄激素（CM）和无雄激素（ADM；n个= 3).G、，通过免疫印迹分析评估VPRBP敲除对相关VCaP蛋白的影响。结果表示为平均值±标准偏差*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001. 统计分析由Student执行t吨Tukey进行qPCR和单向方差分析测试临时的细胞增殖分析。

因为T淋巴细胞中VPRBP的缺失以前被证明可以使p53稳定(13)，我们检测了LNCaP中VPRBP敲除后p53的表达。LNCaP中VPRBP的敲低导致p53蛋白表达及其下游靶点细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的显著增加(21)和Mdm2（参考。22; 小鼠双分2同源；图3C; 补充图S3C）。VPRBP敲除并不影响p53转录水平，而p21转录水平上调约6倍(图3A). 虽然Mdm2在蛋白水平上是p53的负调控因子，但Mdm2和p53之间存在复杂的反馈关系，p53转录激活稳定百万平方米基因(22). 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21因其在诱导G₁逮捕(21). 反映出这一点，我们观察到细胞周期标记物如磷酸化CDK2 Thr160（参考文献。23; 激活CDK2复合物和G标记物₁–S），细胞周期蛋白B1（参考。24; G的标记₂–M相），polo-like激酶1（PLK1；参考。25; 晚G的标记₂促进有丝分裂进入），磷酸-FoxM1（参考。26; G的标记₂–M相）和磷酸-PP1αThr320（参考。27;图3C; 补充图S3C）。磷酸组蛋白H3 ser10（参考。28; VPRBP敲除后，有丝分裂染色质凝集标记也显著降低，其中作为另一组蛋白标记的三甲基-K27 H3保持不变(图3C; 补充图S3C）。总之，VPRBP可能通过调节p53的表达和活性来严格控制细胞增殖。

为了确定这种情况是否属实，我们继续在先前特征化的TP53敲除（TP53-KO）LNCaP细胞系中进行VPRBP敲除(29). 如前所述，TP53 KO LNCaP细胞在完全生长培养基中的生长速度高于野生型（WT）LNCaP（补充图S3D）。在TP53 KO细胞中，我们观察到VPRBP敲除导致细胞数量减少约22%(图3D)而WT LNCaP细胞中约57%(图3B). TP53 KO和WT细胞裂解物的Western blot比较证实敲除细胞中没有p53和p21诱导(图3E). Han及其同事最近的一项研究表明，VPRBP的丢失通过核糖体组装因子PWP1的积累损害核糖体的生物发生，从而增加大核糖体亚单位蛋白RPL11，使其与MDM2结合，从而抑制p53泛素化和降解，从而诱导p53活化(14). 我们还观察到，在WT LNCaP中，随着VPRBP的敲低，PWP1蛋白表达增加，这表明这些细胞中也可能存在这种情况(图3E; 补充图S3E）。为了进一步评估VPRBP敲除的生长效应是否需要WT p53，我们继续在p53突变细胞系VCaP中敲除VPRBP。VCaP中的VPRBP敲除未能引起细胞数量的显著变化(图3F)和细胞周期标记(图3G). 然而，与LNCaP类似，VCaP细胞中的VPRBP敲低降低了c-Myc水平(图3G). 与LNCaP不同，这种下调不会导致细胞数量的显著变化，这可能反映了两种细胞系中Myc依赖的生物过程的差异，或者说，VCaP细胞系中的Myc表达和Myc活性之间的相关性较弱。敲除表达WT p53、22Rv1的另一种细胞系中的VPRBP确实导致细胞数量显著减少（补充图S3F），PWP1、p53、p21稳定，细胞周期标记物如Cyclin B1和PLK1随之减少（补充图纸S3G）。总之，这些结果表明VPRBP敲除的生长抑制效应高度依赖于p53的稳定和激活。

因为我们之前显示雄激素治疗导致VPRBP表达增加，所以我们继续评估R1881是否改变了p53表达。我们观察到R1881刺激后LNCaP细胞中p53蛋白（附图S4A）和mRNA表达（附图S4B）降低，并且通过ChIP-qPCR（附图S4C）在p21（CDKN1A）启动子处p53富集相应减少这表明雄激素的促增殖作用是通过在某些情况下抑制p53活性而产生的，并且VPRBP可能是这种作用的介质。由于雄激素调节VPRBP的表达，进而对p53产生影响，我们试图确定稳定p53是否对VPRBP水平具有相互抑制作用。为此，我们用p53稳定剂Nutlin-3a处理雄激素分泌型LNCaP细胞，这导致VPRBP表达降低（补充图S4F和S4G），尽管我们在这些处理细胞生成的ChIP-seq数据集中没有发现VPRBP启动子中的p53结合位点的证据（补充图C4D和S4E）。总之，VPRBP在某些情况下似乎是AR和p53之间相互反馈的中介。

p53 ChIP-seq揭示VPRBP敲除后p53对染色质的补充增加

为了在全基因组范围内评估VPRBP对p53活性的影响，我们在VPRBP、OGT的siRNA敲除或非靶向siRNA或nutlin-3a治疗后，在LNCaP细胞中进行p53 ChIP-seq。典型p53靶基因p21(CDKN1A公司)作为阳性对照，通过ChIP-qPCR验证ChIP效率(图4A). 这是在前列腺癌细胞系中生成的第一个p53 ChIP-seq数据集。总的来说，LNCaP中的p53峰值较少(图4B)比其他细胞类型的报告(30, 31)这表明这些细胞中p53募集的可接近染色质景观存在根本性差异。nutlin-3a处理的LNCaP细胞中的ChIP-seq出现582个峰值，其中大多数（>80%）与其他细胞系中nutlin-3 a p53的ChIP-seq结合位点重叠，证实它们是真正的p53结合位点(图4C; 补充图S5A）。相比之下，VPRBP敲除导致p53基因组结合位点的数量增加了约4.7倍(图4B). 两个VPRBP敲除样品（si1和si2）之间有1387个一致的p53结合位点，代表这些条件之间约85%的位点重叠（补充图S5B）。绝大多数（～95%）LNCaP nutlin-3a p53 ChIP-seq位点存在于si1和si2生成的一致p53位点中(图4D). 然而，VPRBP击倒后p53结合位点的数量要多得多(图4D)尽管nutlin-3a和VPRBP敲除条件下的p53蛋白水平相当（补充图S5C），但表明敲除增强了p53招募的染色质可及性。重要的是，VPRBP敲除的大多数位点与nutlin-3a MCF7 p53 ChIP-seq峰重叠(图4E)这表明VPRBP基因敲除只是允许通过p53位点占用参与更大比例的p53调节蛋白。OGT击倒产生的峰值数量与加扰控制相似(图4B)OGT si1和OGTsi2站点的大部分重叠（补充图S5B）。

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图4。

VPRBP敲除增加p53染色质募集并诱导核仁应激。A、，显示不同转染条件下p53 ChIP后p21和阴性位点引物（CCND1）回收率的条形图(n个= 1).B中，表中显示了在不同条件下获得的峰数。C中，文氏图显示了我们在LNCaP细胞中的nutlin-3a p53 ChIP-seq与之前报道的MCF7细胞中的nutlin-3a-p53 ChIP-seq的重叠({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE86164”，“term_id”：“86164“}}通用电气86164).D、，Venn图显示LNCaP中nutlin-3a p53 ChIP-seq与VPRBPsi p53 ChIP-seq共有位点的重叠。E、，Venn图显示MCF7细胞中VPRBPsi p53 ChIP-seq共识位点与之前报道的nutlin-3a p53 ChIP-seq重叠。F、，显示VPRBP相互作用组与核仁蛋白质组重叠的维恩图。G、，典型的免疫荧光图像显示转染后3天，打乱和转染VPRBP siRNA的LNCaP中VPRBP和纤维蛋白染色（比例尺，10µm）。

评估p53峰的分布表明，大多数存在于远端基因间区域（45%–54%），近端启动子中约6%的结合事件（补充图S5D），类似于AR ChIP-seq数据中观察到的全基因组位点分布。VPRBP si p53 ChIP-seq峰与H2K27Ac峰重叠约53%，与H3K27me3峰重叠约0.7%，表明大多数结合位点存在于转录活性位点，当表达VPRBP时，p53无法访问这些位点（补充图S5E）。确定了VPRBP敲除条件下p53位点10 kb内的基因（补充数据S2）。这些包括已建立的p53靶基因，如CDKN1A和MDM2。敲除条件下p53位点的基序富集分析显示TP53、TP73和TP63结合基序过度表达（补充图S5F）。总之，这些表明VPRBP可能通过阻断染色质来抑制p53活性，并且VPRBP的敲除扩大了受p53表达增加影响的基因调控网络。

VPRBP敲除诱导LNCaP细胞核仁应激

众所周知，核仁应激通过干扰核糖体生物发生，通过干扰Mdm2-p53相互作用，导致细胞周期阻滞和凋亡，从而诱导p53稳定(32)众所周知，VPRBP击倒也能做到这一点(14). VPRBP以前被证明定位于细胞质(33)以及原子核(34). 从BioGRID数据库获得的VPRBP相互作用组（147个蛋白质）的比较（参考。35; 补充数据S3）和来自细胞图谱的人类细胞核仁蛋白质组（1314蛋白质）(36)表明大约14%的VPRBP相互作用物也显示核仁定位(图4F). 在全基因组RNAi筛选研究中，VPRBP与其他CRL4 E3泛素连接酶和COP9信号体成分一起参与40S核糖体亚单位的生物生成(37). 因此，我们假设VPRBP敲除可能通过破坏核仁的稳定性来增强p53的稳定性并减少核糖体的生物生成。我们的免疫荧光研究显示VPRBP的细胞质和核定位(图4G)如前所述(33, 34). 核仁数目减少和/或核仁结构解体是核仁应力的一些特征(38). 我们发现VPRBP siRNA敲除后核仁蛋白纤维蛋白染色模式发生显著变化，表明核仁应激(图4G). 纤维素酶在VPRBP敲除细胞中显示出独特的核仁定位，并重新分布到小的核质实体，类似于之前用放线菌素D治疗时所描述的情况(39). 为了量化核仁分裂，我们根据纤维蛋白染色测量了单个核仁面积，如前所述(40)，这表明VPRBP敲除细胞的核仁大小比（～1.7µm²)使用打乱的si转染细胞（9.8µm²; 补充图S6A）。VPRBP siRNA2也观察到原纤维蛋白和40S核糖体蛋白S8（RPS8）表达显著降低（~25%）（补充图S6B和S6C）。这表明p53激活可能是VPRBP敲除诱导的核仁应激的下游结果。

VPRBP的表达与临床样本中AR的表达相关，并与预后相关

为了进一步了解VPRBP在前列腺癌中的预后潜力，我们通过IHC分析了其在组织芯片（TMA）中的表达。VPRBP阴性、低、中、高染色的代表性图像如补充图S6D所示。我们评估了其与前列腺癌病理学、AR和OGT的相关性。在评估TMA中VPRBP的表达时，我们观察到，46%的所有肿瘤都强烈染色以检测VPRBP表达，并且随着肿瘤分期和定量Gleason分级，蛋白质水平在统计学上显著增加（补充表S6）。尽管很少有Gleason评分为7的肿瘤具有第三级Gleason模式5（生化复发的有力预测指标；参考文献。41)，均为VPRBP阳性。在手术切缘阳性的病例中观察到较高的VPRBP染色（补充表S6）。然而，在无区域淋巴结转移（N0）和有转移（N+）的患者中，VPRBP的表达没有显著差异。VPRBP表达与术前PSA水平之间也没有显著相关性（补充表S6）。为了确定VPRBP的表达是否与预后不良的疾病相关，我们评估了其表达与术后生化（PSA）无复发生存率的关系。我们观察到，与阴性患者相比，任何VPRBP表达的患者的PSA无复发生存率均显著降低（补充图S6E）。我们继续评估了VPRBP与AR或OGT在TMA中的共表达。对于这两种情况，我们观察到染色的统计显著正相关，这表明这些蛋白的表达和活性可能与患者亚群有关(图5A和​和B）。B类). 此外，与VPRBP阴性/AR低组相比，VPRBP阳性/AR高组PSA无复发生存率在统计学上显著降低(P（P）= 0.0019); 与VPRBP阴性/OGT-阴性组相比，VPRBP阳性/OGT-高组也如此(P（P）= 0.0013) (图5C和​和DD类).

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图5。

VPRBP蛋白表达与AR扩增、OGT过度表达和不良预后相关。显示VPRBP表达与AR正相关的条形图(A类)和OGT表达式(B类)由IHC在TMA部分进行。C中，表达低或高AR水平且VPRBP表达存在或缺失的患者的PSA无复发生存曲线和生存曲线(D类)在无OGT、低OGT或高OGT的患者中，VPRBP表达存在或不存在。E、，TCGA胰腺癌图谱前列腺数据集中AR mRNA表达与VRPBP mRNA表达的散点图比较。F、，盒子图显示VPRBP表达四分位数与139个来自heatmap上调的AR基因之间的关联。这个P（P）-中的值C类和D类指出总体意义。

接下来，我们试图确定临床样本中VPRBP转录表达是否与反映AR活性的活性基因特征相关。首先，我们比较了TCGA数据集中VPRBP mRNA的表达，发现与AR mRNA的表达呈正相关(图5E). 已有多项研究报告AR活性基因特征。为了确定在VPRBP高表达肿瘤中高度表达的AR活性基因特征子集，我们结合了Dorothea AR调节子、KEGG前列腺癌途径中的AR活性基因组特征和来自分子特征数据库（MSigDB；参考文献。42–44)并将其聚集在VPRBP高表达和低表达四分位上作为热图（补充数据S4中的组合AR基因列表；补充图S7）。这些研究将467个基因的表达归因于AR活性。由于尚不清楚哪一个可能在给定的患者组中最相关，我们评估了TCGA前列腺癌数据集中与VPRBP四分位表达相关的所有因素（补充图S7）。这467个基因中有139个与VPRBP表达呈正相关，92个与VPRBP表达负相关（补充数据S5）。VPRBP表达四分位数和139个基因之间的关联如方框图所示，并且四分位数之间具有统计显著性图5F重要的是，139个基因与AR反应途径最显著相关，但不包括一些典型的AR靶点，如KLK2和KLK3。为了进一步完善这种关联，我们为TCGA数据集生成了共表达表，根据Spearman秩相关系数对与VPRBP共表达的所有基因进行排序。我们还对另外两个数据集进行了此项研究，即来自cBioPortal的SU2C/PCF Dream Team，Cell 2015和MSKCC，Cancer Cell，2010。在所有三项研究（补充数据S5）中，139个基因中有48个基因与VPRBP显著共存（Spearman秩系数阈值>0.4）。这代表了推测的VPRBP依赖性AR调节区，将为将来对VPRBP和AR活动之间相互作用的机制研究奠定基础。

这项研究得到了挪威研究委员会（230559）的支持。I.G.Mills还得到英国前列腺癌/Movenber卓越中心（CEO13_2–004）和约翰·布莱克慈善基金会的支持。作者希望感谢贝尔法斯特皇后大学基因组核心技术部门对ChIP-seq研究的帮助。我们衷心感谢Michael Nyquist博士和Peter Nelson教授为我们提供TP53敲除LNCaP细胞。

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