投资眼科视觉科学。2022年3月；63(3): 14.
泪腺导管阻塞后泪腺微环境的变化
,1,2,4 ,2,4,5 ,2,4 ,2,4 ,1 ,2,4 ,2,4 ,2,三,4 ,
1和2,三,4 新河
1厦门大学医学院厦门大学第一附属医院眼科，中国福建厦门
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
王少潘
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
5厦门大学人工智能研究所，中国福建厦门
孙惠民
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
惠和
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
石亚林
1厦门大学医学院厦门大学第一附属医院眼科，中国福建厦门
吴一鸣
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
韩武（Han Wu）
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
刘祖国
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
三厦门大学医学院厦门大学翔安医院，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
井仪庄
1厦门大学医学院厦门大学第一附属医院眼科，中国福建厦门
魏丽
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
三厦门大学医学院厦门大学翔安医院，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
1厦门大学医学院厦门大学第一附属医院眼科，中国福建厦门
2厦门大学医学院厦门大学眼科研究所，中国福建厦门
三厦门大学医学院厦门大学翔安医院，中国福建厦门
4福建省眼科与视觉科学重点实验室，福建厦门
5厦门大学人工智能研究所，中国福建厦门
通讯作者。 通信地址：中国福建省厦门市厦门大学医学院厦门大学翔安医院厦门大学眼科研究所魏丽，地址：中国厦门市翔安南路4221-122号4楼，邮编：361102；nc.ude.umx@8101iew. 2021年9月12日收到；2022年2月24日验收。
本作品是根据Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0国际许可证授权的。
- 补充资料
补充1
GUID:184A047D-376F-4587-9D82-744BF82ADDEF
补充2
GUID:E6232109-2D17-4A14-9CDB-8E78D818AB51
摘要
方法
用缝线结扎大鼠眶外泪腺导管，结扎时间不同。之后，松开一些动物的缝合线，并观察21天，以评估泪腺的恢复情况。采用裂隙灯和泪液分泌试验评估眼表和泪腺功能。采集泪腺和角膜进行苏木精-伊红染色、油红O染色、LipidTOX染色、Masson染色、实时定量聚合酶链反应和免疫荧光染色。
结果
泪腺导管阻塞后，泪液分泌和泪腺重量减少。7天后角膜新生血管的发生率增加。腺内导管扩张，腺泡破坏。长期结扎导致泪腺纤维化和脂质积聚。炎症细胞浸润，炎症因子上调。增殖细胞和凋亡细胞增加。肌上皮细胞和基底膜的结构被破坏。p63表达增加，而Pax6表达减少。缝合线松解后，结扎后不到7天，泪液分泌和腺泡结构即可恢复，炎症细胞浸润减少，纤维化减轻。5天后凋亡细胞和增殖细胞增加。结扎3天后，肌上皮细胞和基底膜结构无法恢复，结扎5～14天后间充质细胞数量增加。
结论
泪腺导管阻塞会导致泪腺腺泡细胞营养不良、炎症和泪腺微环境脂质积聚。长时间的泪道阻塞会导致不可逆的泪腺功能衰竭。
关键词：泪腺，微环境，导管阻塞
泪腺是一种外分泌腺，负责分泌泪液，包括蛋白质和离子。1它在维持健康眼表微环境的内稳态方面起着重要作用。2,三泪腺由四种不同类型的细胞组成：腺泡细胞、导管细胞、肌上皮细胞和间充质细胞。在人类，大约有12个微小的排泄管在上外侧穹窿结膜中开口，将水眼泪排入结膜囊。4大鼠泪腺包括眶外和眶内泪腺。眶外泪腺是位于眼睛颞侧皮下的主要泪腺。5泪腺靠近眶外泪腺，包含六个或更多的导管。距离眼睛较远的地方，它有三到五条管道。6
许多眼表疾病，如Stevens-Johnson综合征、瘢痕性类天疱疮、严重感染性结膜炎、眼部化学烧伤或热烧伤，都可能对眼表组织造成严重损伤。7,8除了严重的结膜损伤外，泪腺导管的管口也很容易受累，在这些疾病的不同阶段可能会阻塞泪腺导管。9事实上，临床上对严重眼表损伤时泪道或其管口的保护很少关注。在疾病晚期，即使开口重新打开，泪腺通常也无法恢复分泌眼泪的功能。因此，泪道阻塞或孔口关闭成为这些眼表疾病导致严重水泪缺乏性干眼症的最常见原因之一。
目前，如果患有严重眼表疾病的泪道或泪道阻塞，我们可以遵循什么时间点来挽救泪腺的结构和功能，还不知道。先前的研究发现，泪腺损伤后可以由祖细胞修复。10我们还可以从腮腺和舌下腺的研究中了解到，结扎导管可能导致腺体萎缩和功能障碍；然而，在适当的情况下，去除堵塞物后，腺体可以通过腺体细胞的增殖再生。11–14在之前的一项研究中，使用兔泪腺主排泄管结扎三天，然后重新开放来研究短期泪腺管结扎诱导的损伤后的泪腺组织修复，发现泪腺干/祖细胞可以被激活，泪腺可以恢复正常的结构和功能。15另一项研究发现，小鼠泪腺在结扎7天后可以再生。16然而，在相对长期的导管阻塞后，泪腺是否能够再生，恢复过程是否会发生尚不清楚。
在本研究中，我们制作了眶外泪腺导管阻塞的大鼠泪腺损伤模型，观察结扎后不同时间点的病理变化和恢复过程。我们目前的研究可以模拟临床患者泪腺导管的阻塞情况，并为及时治疗阻塞的导管提供证据。
材料和方法
材料
抗多形核白细胞（PMN）抗体（1:1200，20R-PR020）来自菲茨杰拉德（美国马萨诸塞州阿克顿）。抗-CD68（1:200，ab31630）、抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA，1:200，ab184675）、抗p63（1:200、ab124762）、抗Ki67（1:400，ab16667）、抗β-III微管蛋白（1:200；ab52623）和抗波形蛋白（1:2000，ab8978）抗体均来自Abcam（英国剑桥）。抗lamin5抗体（1:200，sc-13587）来自圣克鲁斯（美国德克萨斯州达拉斯）。抗AQP5抗体（1:100，A9927）来自Abclonal（中国武汉）。Alexa Fluor 594-结合IgG（1:300，A11058，A21207）和Alexa Fluor 488-结合IgC（1:300 A11055，A21206）抗体来自Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。DAPI来自Vector（美国加利福尼亚州旧金山）。
大鼠泪腺导管阻塞模型
本研究选用60只雄性SD大鼠（7～8周龄，购自中国上海SLAC实验动物中心）。在整个研究过程中，所有动物都被保存在标准环境下的单独通风笼子中，环境如下：室温25°±1°C，相对湿度60%±10%，交替进行12小时的光/暗循环（上午8点到下午8点）。所有实验程序均按照ARVO《关于在眼科和视力研究中使用动物的声明》进行，实验方案得到了中国厦门大学实验动物伦理委员会的批准。
戊巴比妥钠全身麻醉诱导后，结扎组用5-0尼龙线结扎右侧眶外泪腺导管，假手术组缝合泪腺周围结缔组织。未手术的左侧眶外泪腺为对照组。结扎组、假手术组和对照组在术后1、3、5、7、14和21天通过颈椎脱位处死大鼠。释放组在结扎或假手术后1、3、5、7、14和21天取出缝合线，动物在处死前保存21天(A） ●●●●。处死前用裂隙灯显微镜观察所有动物。采集双侧泪腺进行组织学研究、免疫染色和RNA提取。
泪腺导管结扎和释放后泪液分泌和泪腺重量发生变化。(A类)图片显示了实验的模式图。结扎组于术后1、3、5、7、14和21天处死大鼠。对于释放组，在结扎后1、3、5、7、14和21天取出缝合线，并在处死前将动物保存21天。(B类)酚红线泪液分泌试验显示，结扎导管并松开缝合线后有泪液分泌。(C类)阻塞和通畅后泪腺重量在整个过程中发生变化（n=5*P（P）< 0.5; **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). 使用t吨-测试方法。(B、 C类).
泪液分泌测量
在标准环境中牺牲之前，使用棉线（Zone-Quick；日本东京横田）在类似的时间点（下午3点），通过苯酚红线撕裂试验测量眼泪生成。全身麻醉诱导后，将下眼睑轻轻拉下，在距下眼睑外眦约三分之一距离的指定点，在眼睑结膜上放置一根30 mm的线15秒。以毫米为单位记录由线上的含水前沿的红色位置指示的值。
裂隙灯显微镜评价和角膜荧光素染色
用裂隙灯显微镜（中国重庆康华科技有限公司）观察眼表面。将0.1%2µL液体荧光素钠滴入结膜囊。然后用手眨了眨老鼠的眼睑三次。闭上大鼠眼睑后，用盐水冲洗眼睑外溢出的过量荧光素钠。90秒后，在裂隙灯显微镜下用钴蓝滤光片评估角膜上皮荧光素染色。
光染色法
所有免疫荧光染色均在泪腺和眼球的冷冻切片（6µm厚）上进行。切片在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗后，将切片在0.2%Triton X-100中培养10分钟。用PBS清洗三次，每次5分钟后，用2%牛血清白蛋白孵育所有切片，以阻止非特异性染色60分钟。然后将切片与抗体在4°C下孵育过夜。在用PBS分别清洗三次10分钟后，在室温下用Alexa Fluor 594-共轭IgG或Alexa Fluor 488-共轭IgG-覆盖切片60分钟，然后用PBS清洗三次，每次10分钟。所有切片均用DAPI染色，并用激光共焦显微镜（Olympus Fluoview 1000；日本东京奥林巴斯）进行安装和拍照。
原位末端脱氧核苷酸转移酶dUTP Nick End标记（TUNEL）分析
在结扎导管的不同时间点，对泪腺进行TUNEL染色，以检测终末期细胞凋亡。冷冻切片用4%多聚甲醛孵育20分钟，然后用三次PBS洗涤，每次5分钟。然后在室温下用20µg/mL蛋白酶K覆盖所有切片15分钟。按照制造商的说明，用PBS进行三次洗涤，每次洗涤五分钟后，用试剂混合物（终端荧光TUNEL系统G3250；美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在37°C下培养一小时。然后用生理盐水柠檬酸钠终止反应15分钟。组织在PBS中冲洗三次，并用DAPI进行复染，安装并用激光共焦显微镜（Olympus Fluoview 1000）拍照。
LipidTOX染色
LipidTOX染色观察泪腺中性脂质分布。用4%多聚甲醛固定冰冻切片20分钟，丢弃固定剂后，用PBS清洗切片三次，每次5分钟。我们用PBS将脂质TOX溶液稀释至×1。将溶液滴在标本上，染色30分钟后丢弃，然后用PBS洗涤三次，每次5分钟。用DAPI（美国加利福尼亚州向量）安装载玻片，并用激光共焦显微镜（Olympus Fluoview 1000）拍摄。
油红O染色
油红O染色观察泪腺脂质积聚情况。17所有冰冻切片用4%多聚甲醛固定5分钟，然后PBS冲洗5分钟。然后用60%异丙醇孵育组织20秒，用0.5%油红O溶解在异丙醇中染色15分钟，然后用PBS冲洗5分钟。切片用苏木精共同染色，用甘油固定，并在光学显微镜下观察（蔡司Axio实验室A1；蔡司，德国Oberkochen）。
Masson三色染色
为了研究胶原蛋白纤维的分布，将Masson三色染色试剂盒（D026；南京建成生物工程研究所，中国南京）应用于泪腺组织。简言之，石蜡切片在染色前脱蜡。组织在37°C下用双蒸馏水冲洗2分钟，然后根据制造商的说明进行核染色、细胞质染色、分色和复染。用纯乙醇冲洗后，用固定介质（H-5000；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）固定切片，并在光学显微镜下观察。
定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）
泪腺的总RNA在TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中提取，并通过使用ExScript RT试剂盒（Takara Bio，Otsu，Shiga，Japan）逆转录为cDNA。根据制造商的说明，使用StepOne实时PCR检测系统（德国Applied Biosystems），使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（Takara Bio）进行实时PCR。扩增程序包括在95℃下初始变性30秒，然后在95℃变性10秒，在60℃退火30秒，以及在60℃下延伸15秒40个周期。用于扩增特定基因产物的引物如采用比较循环法对相对定量实时PCR结果进行分析，并将其归一化为β-actin作为参考基因。
表。
| 基因名称 | 正向底漆 | 反向底漆 |
|---|
| β-肌动蛋白 | 5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′ | 5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′ |
| 第63页 | 5′-CAGCACGATCGAGACGTA-3′ | 5′-CGGACTCCAAGCTCATT-3′ |
| 第6页 | 5′-AGTTCTCGCAACCTGGCTA-3′ | 5′-TTGTGTTTTCTCCCTGTCC-3′ |
| 肿瘤坏死因子α | 5′-TGCCTCAGCCTCTCTCATT-3′ | 5′-GGGCTTGTCACTCGAGTTT-3′ |
| IL1β | 5′-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3′ | 5′-GGCTGTTCCACTAGCTTT-3′ |
| TSG6型 | 5′-GAAGCAGAGGCAGGTATGTGA-3′ | 5′-TCAATGATGGCCGGTTTTGCC-3′ |
| Ki67号机组 | 5′-CCTAAGCAGCCTTCACGA-3′ | 5′-TCTGCTCTCTCTCCTTC-3′ |
| IL10号机组 | 5′-CCTGGTAGAAGTGCCCC-3′ | 5′-TTGAGGTCACGTAGGCTTCT-3′ |
| α形状记忆合金 | 5′-AGAGCCAGCCAGCTCCATCA-3′ | 5′-AGCAAGCCCGCCTTACAGCC-3′ |
图像分析
为了分析泪腺的阳性免疫染色率，通过软件Image J（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）处理Ki67和TUNEL染色的图像。总之，将荧光图像转换为灰度，通过软件调整阈值。然后我们使用Watershed模块将染色分为单个细胞。细胞数量由“分析粒子”模块自动计数。为了分析免疫荧光强度（PMN、CD68、AQP5、β-III微管蛋白），图像由Image J（美国国立卫生研究院）处理。简单地说，在分割图像通道后，我们使用软件中的自动阈值并测量平均荧光强度。随机选择至少三个或更多区域，用Image J软件分析所有阳性染色。使用共焦激光扫描显微镜（Fluoview 1000；Olympus）在相同曝光时间下拍摄所有样品。每个样品至少记录三个不同区域。
统计分析
定量数据以平均值±标准偏差表示。独立样本t吨-采用方差检验和单因素方差分析（ANOVA）评价各组间的显著性。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。使用Prism软件版本8（GraphPad software，San Diego，CA，USA）进行统计分析。
结果
泪腺导管结扎和松解术后泪液分泌的变化
泪腺导管结扎后第1天到第5天，泪液分泌量逐渐减少。然而，在第7天时有轻微增加，并在第21天之前保持大约一半的假手术组。结扎不同时间的泪腺导管后，取出泪腺导管的缝合线，并保持动物21天恢复。然后检测泪液分泌。我们发现，如果在7天内解除结扎，泪液分泌可以恢复到正常水平。经过14天的封闭，泪液分泌量可能略有增加，但无法恢复到正常水平。阻塞21天后，再恢复21天后，泪液分泌约为假手术的一半(B、，补充图S1A） ●●●●。
水通道蛋白5（AQP5）是一种参与泪液分泌的水通道蛋白。18,19在这里，我们观察到AQP5在泪腺中的表达。正常组AQP5在腺泡和导管中分布均匀。尽管AQP5阳性表达在结扎后一天导管处增强，腺泡处下调。在第7天和第14天发现了类似的模式。第21天，AQP5表达显著降低。在释放组中，AQP5在7天内均匀分布在腺泡和导管中，14天后AQP5仅分布在部分腺泡和导管中(A） ●●●●。荧光强度的半定量分析显示，导管结扎后AQP5表达逐渐下降，释放组在第14天和第21天显著下降(C） ●●●●。神经调节泪腺的泪液分泌。20对于神经分布，我们观察到结扎组在第14天和释放组在第21天之后β-III微管蛋白表达减少，表明这些时间点的神经分布减少(B、D） ●●●●。这些结果表明，结扎一天后腺泡的泪液分泌功能受到影响，如果泪道阻塞超过14天，分泌功能就无法恢复到正常状态。
泪腺导管结扎和释放后AQP5和神经分布的变化。(A类)图像显示泪腺AQP5免疫荧光染色(红色：AQP5；蓝色：DAPI）。(B类)β-III微管蛋白免疫荧光染色显示泪腺神经分布(红色：β-III微管蛋白；蓝色：DAPI）。比例尺：40微米(C类)图中显示了AQP5的平均荧光强度。(D类)图中显示了β-III微管蛋白的平均荧光强度（n=5*P（P）< 0.5, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001 ****P（P）< 0.0001). 使用单向方差分析测试方法对实验进行统计分析(C、 D类).
泪腺导管结扎和释放后泪腺重量的变化
与对照组相比，结扎组泪腺重量在结扎1天后迅速增加至1.32倍，在结扎5天后呈波动性下降。七天后，体重逐渐下降，直到21天。阻塞1天或3天后解除结扎，恢复21天后泪腺重量略有下降。然而，如果结扎时间超过三天，泪腺的重量就无法逆转(C、，补充图S1B） 提示结扎导管三天以上可能存在不可逆的泪腺营养不良。
泪腺导管结扎和松解术后的眼部表现
然后我们观察了泪道阻塞不同持续时间后的眼表变化。角膜在七天内保持透明。泪道阻塞七天后，可以观察到新生血管从鼻侧长入角膜基质(A） ●●●●。结扎7天后角膜新生血管的发病率约为25%，结扎21天后约为35%(B） ●●●●。角膜荧光素钠评分显示，结扎导管三天后，角膜上皮缺损程度随时间逐渐加重。在释放组中，角膜上皮缺损的程度在14天内得到改善。然而，角膜荧光素钠评分在14天后显著增加(E） ●●●●。苏木精和伊红（H&E）染色显示，这些动物的中心角膜基质中血管正在生长，并且可以观察到细胞浸润(C） ●●●●。PMN染色进一步证实中央角膜基质中浸润的细胞含有大量多形核白细胞(D） ●●●●。
泪腺导管结扎和松解术后的眼部表现。(A类)角膜裂隙灯和荧光素钠染色显示阻塞后和缝线松解后的眼表改变。(B类)阻塞导管和重新打开导管后角膜新生血管的发生率。(C类)H&E染色显示中央角膜和角膜缘的表现。比例尺：100µm。(D类)PMN免疫荧光染色显示结扎组多形核白细胞增多，缝线松解后明显减少(绿色：PMN；蓝色：DAPI）。比例尺：50µm。(电子)图表显示结扎组和释放组的角膜荧光素评分（n=5****P（P）< 0.0001). 使用单向方差分析测试方法对实验进行统计分析(B、 E类).
泪道阻塞后泪腺结构的变化
为了进一步研究泪道结扎术后泪腺的变化，我们首先对泪腺组织进行H&E染色。结扎导管后第1天，腺泡细胞明显水肿。三天后，可以清楚地看到许多扩张的导管，腺泡的结构变得不规则，一些腺泡细胞的细胞核也呈不规则形状。结扎五天后，腺泡的一些边界变得模糊。结扎7天后，腺泡基质中渗入了许多纺锤状核细胞，14天后变得更加突出。几乎所有导管都明显扩张，结扎21天后未发现正常的腺泡结构(A） ●●●●。
泪道阻塞后泪腺结构发生改变。(A类)H&E染色显示结扎组泪腺导管扩张，细胞浸润，腺泡萎缩。(B类)H&E染色显示，释放组的导管扩张和腺泡萎缩在7天前有所改善。比例尺：100µm。箭头显示浸润细胞；星号表示腺管扩张（n=5）。
然后我们研究了结扎后21天不同时间结扎解除后泪腺的结构。H&E染色显示，如果在7天之前解除结扎，可以观察到腺泡和导管的结构，而腺泡之间的间隙随着结扎时间的延长而增大。然而，导管不断扩张，大多数腺泡严重萎缩，如果14天后解除结扎，大量炎性细胞浸润。此外，如果在21天后解除结扎，则没有留下腺泡结构，有大量扩张的导管和浸润的细胞(). 这些结果表明，如果泪道阻塞超过7天，泪腺结构会严重受损，无法恢复正常。
泪道阻塞后泪腺的纤维化过程
然后我们进行了Masson三色染色以确定泪腺的纤维化。结果显示，结扎导管5天后逐渐出现阳性染色，胶原纤维包裹扩张导管。然而，腺泡内的胶原蛋白逐渐减少。结扎14天后，血管和主要扩张导管周围出现明显的纤维化斑块，结扎21天后病情加重。然而，在封闭三天后进行的释放结扎中，纤维化非常明显，并且随着释放时间从7天推迟到21天，纤维化变得更加明显().
泪道阻塞后泪腺纤维化过程。(A类)Masson染色显示结扎组第三天开始泪腺纤维化。(B类)Masson染色显示，释放组的纤维化在7天内有部分改善。箭头表明泪腺胶原纤维化。比例尺：100µm，n=5。
泪道阻塞后泪腺脂质积聚
泪腺冰冻切片用脂质TOX和油红O溶液染色，观察中性甘油三酯。正常大鼠泪腺中弥散分布的小脂点很少。泪道阻塞一天后，腺泡周围可见少量脂滴斑块。随着时间的推移，脂滴斑块增加并合并成较大的斑块，聚集在腺泡周围或间质周围，扩张导管。在结扎组的第7天和第14天，脂沉积在腺泡中广泛分布，而在第21天观察到脂簇。在缝合线释放组中，第一天出现少量脂滴，而第七天在部分扩张的导管和萎缩的腺泡中观察到大量脂滴。在第14天和第21天，脂滴呈簇状沉积。这些结果表明，泪道阻塞可导致泪腺中异常的脂质积聚，结扎时间超过7天时，脂质可以滞留().
泪道阻塞后泪腺脂质积聚。(A类)LipidTOX染色显示，结扎组和释放组在7天后中性脂质分布增加(红色：脂毒素，蓝色：DAPI）。比例尺：40微米。(B类)油红O染色显示泪腺中性脂质积聚。比例尺：100µm，n=5。
泪道阻塞后泪腺炎症细胞浸润
在正常泪腺中，炎症细胞很少。21PMN染色显示正常大鼠泪腺中散在的多形核白细胞，但从泪道结扎的第一天开始增加，并在第七天达到峰值。14天后PMN阳性细胞略有减少(A、C） ●●●●。在释放组中，从第一天到第七天，PMN阳性细胞远少于结扎组，尽管在第14天和第21天没有明显差异。为了进一步评估浸润细胞的种类，我们对CD68进行免疫染色以评估单核巨噬细胞。我们发现，巨噬细胞在五天后逐渐增加，在第七天后保持在较高水平(B、D） ●●●●。释放组的巨噬细胞浸润模式与结扎组相似。
泪道阻塞后泪腺炎症细胞浸润。(A类)PMN染色显示，结扎组泪腺组织中浸润的多形核白细胞在1天后增加，释放组在14天前减少(红色：PMN；蓝色：DAPI）。比例尺：200µm。(B类)CD68染色显示，结扎组和释放组浸润泪腺的巨噬细胞在7天后增加(绿色：CD68；蓝色：DAPI）。比例尺：200µm。(C类)图中显示了PMN染色的平均免疫荧光强度。(D类)图中显示了CD68染色的平均免疫荧光强度。(电子)qRT-PCR结果显示泪腺IL1β、TNFα、IL10和TSG6的表达（n=5*P（P）< 0.5, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.001）使用单向方差分析测试方法对实验进行统计分析(C、 D类). 使用t吨试验方法(电子).
我们进一步使用qRT-PCR观察了泪腺中炎性细胞因子的表达。结果显示，泪道结扎第一天时，白细胞介素-1β（IL-1β）立即显著升高，IL-1β基因表达从第一天到第21天逐渐下降，但在第21天仍高于对照组。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达从第1天到第21天逐渐增加。抗炎因子的表达，例如IL-10，与IL-1β的表达模式相似。三天后TSG6表达明显增强，第七天达到峰值，然后逐渐下降。在释放组中，qRT-PCR显示TNF-α和IL-1β的表达从第1天到第14天逐渐增强。有趣的是，从第一天到第21天，抗炎因子IL-10的表达也逐渐增加。如果在第三天进行释放，TSG6表达显著增加(E） ●●●●。
泪腺导管阻塞后泪腺细胞增殖与凋亡
泪腺腺泡内出现凋亡细胞，导管阻塞5天后凋亡细胞逐渐增多。随着导管梗阻的解除，凋亡细胞在5天后不断出现，数量明显高于梗阻组(A、C） ●●●●。Ki67是一种经验证的细胞增殖生物标记物。Ki67阳性细胞在结扎导管三天后逐渐增加，并在第7天到第21天保持较高水平。在释放组中，Ki67阳性细胞在第五天增加，并在第21天保持较高水平，而从第七天到第21天，Ki67的阳性细胞百分比低于梗阻组(B、D） ●●●●。
泪腺导管阻塞后泪腺细胞增殖和凋亡。(A类)TUNEL染色显示结扎组和释放组泪腺中的凋亡细胞在7天后增加(绿色：隧道；蓝色：DAPI）。比例尺：200µm。(B类)Ki67免疫荧光染色显示，结扎组和释放组泪腺中的增殖细胞在7天后增加(绿色：Ki67；蓝色：DAPI）。比例尺：200µm。(C类)图表显示了泪腺中TUNEL阳性细胞的数量。(D类)图表显示了泪腺中Ki67阳性细胞的数量（n=5****P（P）< 0.001). 使用单向方差分析测试方法对实验进行统计分析(C、 D类).
泪腺导管阻塞后泪腺肌上皮细胞的变化
为了观察泪腺肌上皮细胞的变化，采用αSMA和p63免疫荧光双重染色。在正常组，αSMA阳性细胞位于腺泡基底部，表达ΔNp63。22泪腺管阻塞一天后，p63阳性染色减少。随着时间的推移，更多的αSMA阳性细胞减少并失去其正常形态，尤其是结扎导管5天后，从第7天到第21天，αSMA染色很弱。另一方面，从第三天到第21天，p63的表达增加(A） ●●●●。qRT-PCR结果证实，从结扎导管的第一天到第21天，p63的表达逐渐增加，而Pax6的表达在第一天下降，并在第三天到第二十一天保持在低水平，αSMA基因的表达在第五天显著下降，在第五天至第二十一天维持在非常低的水平(D） ●●●●。此外，我们应用层粘连蛋白5研究泪腺腺泡基底膜的改变。层粘连蛋白5在正常泪腺腺泡的基底侧表达。虽然层粘连蛋白5的表达在结扎7天后逐渐减少，但在结扎14天后只有零星的阳性表达(B） ●●●●。此外，我们用波形蛋白荧光染色观察泪腺间充质细胞的变化。结扎导管后7天内，泪腺内可见波形蛋白阳性细胞散在分布。14天时，波形蛋白阳性细胞显著增加，并分布在腺泡、导管和基质中。然而，阳性细胞在21天时显著减少(C、，补充图S2).
泪腺导管阻塞后，泪腺祖细胞和基膜发生变化。(A类)图像显示泪腺中p63阳性细胞和肌上皮细胞的免疫荧光染色(绿色：αSMA；红色：第63页；蓝色：DAPI）。比例尺：200微米(B类)层粘连蛋白5的免疫荧光染色显示泪腺基底膜的变化(红色：层粘连蛋白5；蓝色：DAPI）。比例尺：20微米。(C类)波形蛋白免疫荧光染色显示泪腺间充质细胞在7天后增加，21天后减少(红色：波形蛋白；蓝色：DAPI）。比例尺：40微米。(D类)qRT-PCR结果显示结扎组泪腺中p63、Pax6和αSMA的表达。(电子)qRT-PCR结果显示释放组泪腺中p63、Pax6和αSMA的表达（n=5*P（P）< 0.5, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.001). 使用t吨试验方法(D、 E类).
如果在三天内释放缝合线，肌上皮细胞的形态可以恢复。然而，如果在5天后释放，αSMA阳性细胞几乎完全消失，并且直到21天后αSMA才恢复(A） ●●●●。对于p63的表达，我们发现阳性细胞的数量在5天后增加，7天后达到峰值，14天后逐渐减少(A） ●●●●。qRT-PCR证实了与免疫染色相似的p63基因表达模式(E） ●●●●。Pax6基因表达在第一天出现短暂增加，但在第14天和第21天逐渐降至低于正常水平(E） ●●●●。即使在一天后解除结扎，αSMA基因的表达也会降低，并且在21天之前一直保持在很低的水平(E） ●●●●。即使缝合线在结扎一天后松开，层粘连蛋白5的表达也无法恢复到正常阶段，如果在七天后松开，则会出现点状染色(B） ●●●●。波形蛋白染色在结扎组和释放组之间没有显示出明显的差异，尽管荧光强度分析显示释放组在第5天和第7天的表达更高(补充图S2).
讨论
在本研究中，我们阻断大鼠泪腺导管长达三周，观察泪腺的病理变化。此外，我们研究了不同时间点结扎释放后泪腺损伤的可逆性。我们发现，结扎导管后，泪液分泌减少到正常水平的一半左右。因为在我们的实验中只结扎了眶外泪腺的导管，所以眶下泪腺仍可能会在眼表面产生眼泪。然而，这种泪液减少已经导致25%至35%的动物角膜新生血管，这表明充足的泪液对于维持眼表的内环境稳定至关重要。
在本研究中，泪腺的损伤主要源于导管阻塞。然而，不能排除一些小血管阻塞引起的缺血。在模型构建过程中，我们结扎了泪腺的所有导管，以及难以分离的小血管，并伴有导管。这些小血管的阻塞可能会对泪腺产生一些影响。23,24这可能与临床上单纯泪道出口阻塞的病理变化不一致。
缝合线松开后，如果在14天之前松开缝合线，泪液分泌可以恢复，但如果结扎延长到21天，泪液无法恢复到正常水平。AQP5在维持泪腺稳态和泪液分泌方面起着重要作用，当AQP6缺乏时，会导致干眼症的发生。25,26我们发现，短期导管阻塞促进了腺泡顶端AQP5的表达，但长期阻塞导致AQP5的不可逆性降低。神经对维持泪腺的正常分泌功能也至关重要。27我们还发现，长时间的导管阻塞会导致泪腺神经的不可逆复位。这支持了长期泪道阻塞后可能存在永久性泪腺损伤和功能丧失的观点。由于导管阻塞，一天后泪腺重量略有增加。这可能是由于腺泡水肿所致。然而，结扎7天后泪腺重量逐渐下降，结扎21天后仅达到正常对照的30%左右。虽然堵塞物已解除，但如果结扎5天后解除，泪腺重量仍无法恢复到正常阶段。尽管有报道称泪腺在炎症或损伤后具有强大的再生能力，28我们的结果表明，长期结扎会在21天内导致泪腺不可逆萎缩。泪腺损伤是否能在较长时间内修复，尚需进一步研究。
H&E染色和Masson染色进一步证实了泪腺结扎后的组织学变化。首先，泪腺的大导管扩张，结扎三天后出现许多新的小导管，并随着结扎时间的延长而变得突出。这可能是由于导管结扎导致逆行性导管内压力增加所致。肾脏也有类似的病理变化，因为输尿管结石或癌症阻塞了输尿管。29此外，涎腺导管阻塞也会引起组织炎症和纤维化。30,31长时间的引流管堵塞最终导致腺泡萎缩，并导致大导管周围的纤维化。阻塞导管也会导致泪腺发炎，PMN和巨噬细胞浸润以及炎症细胞因子（如IL-1β和TNFα）表达上调就是明证。炎症与许多泪腺疾病有关，如与高脂饮食相关的干眼症、与自身免疫性疾病相关的干眼症和与移植物抗宿主病相关的干眼症。32–34泪道阻塞引起的炎症也可能导致腺泡细胞凋亡和纤维化。
其次，我们发现泪道阻塞可能导致脂质积聚。我们最近的研究表明，高脂肪饮食和睡眠剥夺可能会导致泪腺中异常脂质积聚，34,35导致氧化应激和炎症，进而导致泪腺损伤，如腺泡凋亡和肌上皮损伤。高脂饮食或睡眠剥夺模型中的脂质沉积模式在腺泡细胞和细胞外基质中扩散，尽管在当前的泪道结扎模型中显示为斑块。不同的发病机制可能导致不同的脂质沉积模式。导管结扎可引起导管内高压，导致逆行性腺泡功能障碍；因此一线受累的腺泡可能靠近主导管。据报道，肾脏也出现了类似的变化，这是由于肾管阻塞所致。36,37导管阻塞也会导致胰腺和肝脏纤维化、腺体萎缩和导管扩张。38另一方面，高脂肪饮食和睡眠剥夺会引起血液循环引起的病理变化，从而可能影响所有腺泡细胞，导致弥漫性脂质沉积。
第三，结扎泪道导致肌上皮细胞αSMA显著下调。众所周知，肌上皮细胞的收缩有助于催泪。39一些研究表明，肌上皮细胞在泪腺修复和体内平衡中发挥着重要作用。10,39也有研究表明，肌上皮细胞是泪腺腺泡细胞的祖细胞。22,39我们发现αSMA对导管结扎非常敏感。结扎5天后，αSMA的mRNA和蛋白表达显著降低。在释放组中，即使结扎一天，在观察21天后，αSMA也会显著降低，从第三天到第21天没有恢复。未来的研究可能会应用该模型进一步研究肌上皮细胞的病理生理学，并确定肌上皮细胞在泪腺伤口愈合过程中的功能。
ΔNp63和Pax6在泪腺的肌上皮细胞和腺泡细胞中表达。它们在维持泪腺的功能和发育方面起着重要作用。22,40我们的数据显示，从第1天到第21天，结扎导管后p63 mRNA表达上调，ΔNp63阳性细胞增加，这与Ki67的表达一致。虽然增殖细胞增多，但凋亡细胞也增加。此外，扩张的细胞没有形成正常的腺泡结构，Pax6丢失，表明它们缺乏正常的表型，因此可能无法正常发挥功能。这可能解释了为什么结扎21天后或结扎解除21天后泪液分泌没有恢复到正常水平。
发现正常泪腺中存在干细胞，在泪腺损伤修复过程中干细胞数量增加。16研究发现，注射间充质干细胞或间充质细胞分泌物可以帮助泪腺再生。41,42在目前的研究中，间充质细胞的数量在泪道阻塞刺激两周后增加。然而，长期的导管阻塞会导致波形蛋白阳性细胞数量减少，推测此时泪腺内稳态的失衡会导致细胞分化或死亡。在缝线释放的第七天，我们看到波形蛋白增加，表明此时间充质细胞可能参与了泪腺的损伤修复过程。虽然长期泪道阻塞会导致间充质细胞的不可逆减少。未来还需要更多的研究来研究间充质干细胞在该模型中的作用。
上皮细胞和基底膜之间的相互作用调节上皮细胞的迁移、增殖、粘附和分化。43层粘连蛋白5在复层上皮和移行上皮的基底膜中表达。层粘连蛋白5缺乏或异常可诱发瘢痕性类天疱疮。44乳腺上皮细胞层粘连蛋白5表达的抑制导致重组细胞外基质介导的生长控制和凋亡的丧失。45此外，它也是角膜上皮祖细胞和间充质干细胞分化的关键因素。46,47在这里，我们发现以层粘连蛋白5为代表的基底膜在导管阻塞后被破坏，这意味着泪腺上皮细胞的微环境稳态失衡，这可能会进一步影响泪腺腺泡细胞的表型和功能。在释放组，即使结扎仅一天，层粘连蛋白5的表达也无法恢复到正常水平，表明泪腺腺泡基底膜脆弱，损伤后较难再生。泪腺创伤愈合与其基底膜的关系尚需进一步探讨。
总之，泪腺导管阻塞可能导致泪腺腺泡营养不良、炎症和泪腺微环境脂质积聚。长时间的泪道阻塞会导致不可逆的泪腺功能衰竭。及时干预泪腺导管阻塞对恢复功能性泪腺单位和改善化学烧伤、Stevens-Johnson综合征和类天疱疮等相关疾病的预后至关重要。
致谢
部分由国家重点研发计划（2018YFA0107301[至W.L.]，2018YFA0107304[至Z.L.]）、国家自然科学基金（科学基金，编号81970773，编号81770894[至W.L.]，编号81870627[至Z.L.]）和厦门大学第一附属医院科研基金（编号XYY2017011[至Y.S.]）资助。
披露：X.他，无；S.Wang，无；H.Sun，无；H·何，无；石毅，无；吴彦祖，无；H.Wu，无；刘总，无；庄杰，无；李伟，无
工具书类
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