ADAMTS8通过激活EGFR依赖通路部分促进心肌纤维化

动物研究

用于本研究的雄性Sprague-Dawley大鼠购自Jihui实验动物繁育有限公司（中国上海）。建立大鼠心肌梗死模型通过如前所述永久结扎冠状动脉左前降支(17). 在以50 mg/kg大鼠体重腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉后，将大鼠固定在垫子上，并对胸部进行剃毛和消毒。然后用正压人工呼吸器（潮气量7–8 mL，呼吸频率80次/min）对大鼠进行插管和通气。在大鼠胸骨左侧第三和第四肋间间隙进行开胸手术。然后，在左心耳根部下方2–3mm处用丝线缝合左冠状动脉前降支。结扎后心脏前壁立即变白，证明心肌梗死模型已成功建立。此外，如前所述，压力过载大鼠模型是由TAC诱导的(18). 简单地说，用戊巴比妥麻醉Sprague-Dawley大鼠，并将其置于呼吸机上。胸骨上切口暴露主动脉根部，并在升主动脉上放置内径为0.58mm的钽夹。假手术组的动物也经历了类似的过程，没有插入夹子。然后，闭合锁骨上切口，将大鼠送回笼子。

为了确定ADAMTS8是否促进心肌梗死后的心肌纤维化，在建立心肌梗死模型后，在大鼠心肌的明显缺血区注射腺病毒介导的ADAMTS9过表达或相应的对照，剂量为6.0×10¹⁰每只大鼠的载体基因组。两周后，再次注射。ADAMTS8过表达腺病毒由中国汉生物生物技术公司合成。

原代心脏成纤维细胞和心肌细胞的分离培养

如前所述分离和培养心脏成纤维细胞和心肌细胞(19). 从2天大的SD大鼠身上切除心室，清洗，切成小于1mm的小块^三，并在4°C的D-Hanks含0.5%胰蛋白酶的平衡盐溶液中培养过夜。然后收集小块，并在37°C下用II型胶原酶（100单位/ml；美国沃辛顿）进一步消化40分钟。用补充有10%FBS的DMEM（Gibco-Life）终止消化，用移液管重新悬浮小块。通过细胞筛（200毫升）过滤得到的细胞悬浮液，在含有10%FBS的DMEM中培养70分钟。去除悬浮液中的细胞，收集附着在底部的剩余细胞，以3-5×105细胞/ml的密度重新镀膜，并在含有10%的FBS、100单位/ml青霉素、，100μg/ml链霉素和0.1 mM溴脱氧尿苷（BrdU）。

ADAMTS8在心脏成纤维细胞和心肌细胞中的过度表达

根据制造商的腺病毒操作手册，用腺病毒转染心脏成纤维细胞和心肌细胞。感染的多重性约为70 pfu个/细胞。

小干扰RNA转染

根据RiboBio的产品说明书，将小干扰靶向ADAMTS8（序列：TAGGAGCAAGAG-ATTTGTA）转染到心肌细胞和成纤维细胞。为了进行转染，心脏成纤维细胞或心肌细胞培养到60-80%的融合。根据制造商的协议，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（Life Technologies）将100 nM ADAMTS8-siRNA或干扰siRNA输送到细胞中(20).

心肌细胞和成纤维细胞的共培养

共培养心肌细胞的方法之一是将成纤维细胞种植在插入物中（孔径为8μm），心肌细胞在24孔培养板的底部培养并共同培养。另一种方法是在孔中放置插入物（孔径0.4μm），以放置用过表达的ADAMTS8腺病毒或siRNA转染的心肌细胞。然后在6孔培养板的底室中培养心脏成纤维细胞，并共同培养。

Transwell迁移、刮伤试验和CCK-8试验

如前一研究所述，通过transwell系统和刮伤观察到成纤维细胞迁移(21). 心脏成纤维细胞以2.0×10的浓度制备⁵/ml，无血清培养基。然后将转染过表达ADAMTS8腺病毒或siRNA的心肌细胞培养在24孔培养板的底室中。将一个插入物（8μm孔径）放置在微孔中，以放置心脏成纤维细胞（100μl）。心肌细胞和成纤维细胞共培养24小时后，将插入物移入含有PBS的新的24孔培养板中，以去除未附着的细胞。然后用10%福尔马林固定心脏成纤维细胞15分钟，用0.25%结晶紫染色15分钟，再用无菌水再次冲洗，然后晾干。

安在体外采用刮伤试验评价细胞运动性。因此，心脏成纤维细胞的密度为5×10⁵/在六孔培养皿中。然后，当细胞达到90%的汇合时，用无菌的200μl微移液管尖端划伤一次，并在孔中放置一个插入物（0.4μm孔径），以放置转染过表达的ADAMTS8腺病毒或siRNA的心肌细胞。心肌细胞和成纤维细胞共培养24小时后，分别获得了亮场图像。

对于CCK-8方法，心脏成纤维细胞以5×10的密度被镀在96个钢板中^三细胞/孔。将细胞暴露于条件培养基（CM）中长达48 h。然后，每个孔补充10μl CCK-8，并在37°C下培养2 h。在450 nm处测量光密度并计算增殖。

条件培养基的制备

用ADAMTS8过表达腺病毒或ADAMTS8-siRNA转染心肌细胞。培养期结束后，收集培养基作为条件培养基（CM）。

逆转录定量PCR（qPCR）

使用TRIzol（Takara）从细胞中提取总RNA。cDNA使用PrimeScript合成^TM（TM）RT试剂盒（Takara）和定量PCR使用SYBR Green（Takar）进行。GAPDH被用作内部控制。引物序列如所示表1.

Western Blot分析

使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（MCE）的RIPA裂解缓冲液（中国贝约汀）从分离细胞和心室组织中提取蛋白质。蛋白质在8–12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%的牛奶封闭1小时后，在4°C下用一级抗体孵育细胞膜过夜。我们使用了以下抗体：ADAMTS8（Santa，sc-514717）、α-SMA（Abcam，ab32575）、胶原蛋白1（Abclonal，A1352）、CTGF（Abcam，ab6992）、p-EGFR（Abca姆，ab3257）、EGFR（Abcam，ab52894）、p-ERK l，A4771），p-AKT（Proteintech，66444-1-Ig）、AKT（Protentech，10176-2-AP）、p-YAP（Cell Signaling，#4911）、YAP（Cell Signaling，#14074）、TAZ（Cell信号，#4883）、增殖细胞核抗原（Santa，sc-56）、p27kip1（Abclonal，A19095）、动力相关蛋白1（DRP-1，Cell Signoaling，#8570，1:500）、，Ser616处磷酸化的DRP-1（细胞信号，#4494），Ser637处磷酸化DRP-1，GAPDH（Abcam，ab181602）。然后彻底清洗膜，并在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体孵育1小时。信号通过图像采集器（Tanon 5200）上的增强化学发光ECL（Thermo Scientific）显示，并通过密度测定软件（image-Pro Plus）量化。

组织学分析和免疫荧光染色

MI后4周或TAC后8周，处死大鼠，用10%福尔马林磷酸缓冲液固定左心室组织24 h，然后将固定组织石蜡包埋并切片为4μM切片。根据说明书通过PSR染色确定间质纤维化程度。根据上述方法，使用抗ADAMTS8和波形蛋白抗体进行免疫荧光染色(20). 通过Image-Pro Plus 6.0对免疫阳性区域进行量化。

二氢乙硫铵染色

ADAMTS8对活性氧生成的影响由二氢乙硫铵（DHE，BestBio，中国）检测。病毒转染24小时后，心脏成纤维细胞预加载DHE 20分钟。用PBS洗涤三次后，使用荧光显微镜（LSM780）获得DHE荧光图像。

甲苯咪唑治疗在体外

CFs接种在含有10%FBS的DMEM中的10 cm培养皿或6孔培养皿中。CFs粘附24 h，洗涤两次，在无血清培养基中饥饿24 h。然后用甲苯咪唑（5 mol/L，0.5%DMSO）或载体刺激静止细胞24 h(15).

甲苯咪唑治疗体内

MI或TAC模型1周后，成年雄性Sprague-Dawley大鼠（6周龄，150-170 g）随机接受甲苯咪唑（1%二甲基亚砜，25 mg/kg/天，腹腔注射）或溶媒治疗3周(15). 年龄匹配的对照大鼠接受等量的载药。采用简单的随机方法将大鼠分为每组。在拟定方案后，进行超声心动图检查。所有分析均以盲法进行。

左心室超声心动图测量

第28天，使用超声仪器（Vivid7，GE Healthcare）进行超声心动图检查。通过腹腔注射戊巴比妥麻醉大鼠，并将其放置在加热垫上，以保持37°C的体温(22). 从胸骨旁长轴视图获得左心室的M模式描记，以测量左心室舒张末期直径（LVEDD）尺寸和左心室收缩末期直径（LVESD）尺寸。左心室缩短分数（FS）计算为（LVEDD–LVESD）/LVEDD×100，并以百分比表示。左室射血分数计算如下：LVEF（%）=[（LVEDD3–LVESD3）/LVEDD3]×100。

心肌梗死大鼠模型中ADAMTS8表达增加与心肌纤维化相关

为了探讨ADAMTS8的表达是否与心肌梗死损伤和压力超负荷后的心肌纤维化相关，采用MI和TAC诱导的心力衰竭大鼠模型来表示上述两种不同的心肌纤维化反应。首先，通过Masson染色证实建模成功(图2A). 在心肌梗死大鼠模型中，我们通过western blot检测了ADAMTS8在梗死边缘区和远离梗死区域的空间表达。心肌梗死后第3天边缘区ADAMTS8水平升高，第7天显著升高，第14天达到峰值，第28天略有下降。然而，心肌梗死后28天，梗死区远端的ADAMTS8水平没有显著变化(图2B). 心肌梗死后边缘区α-SMA和胶原蛋白1的表达逐渐增加(图2C). 免疫荧光分析检测偏远地区ADAMTS8的弱染色，偏远地区未检测到波形蛋白阳性成纤维细胞(图2D). 然而，心肌梗死后28天大鼠边缘区的ADAMTS8染色呈强阳性(图2D). 此外，我们还研究了缺氧暴露后不同时间点心脏成纤维细胞和心肌细胞中ADAMTS8的表达。ADAMTS8表达在缺氧24小时后增加，48小时后保持升高，在心肌细胞中增加更为显著(图2E、F). 综上所述，上述结果提示ADAMTS8可能参与心肌梗死。

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图2

在MI大鼠模型中，ADAMTS8表达增加与心肌纤维化相关。（A）心肌梗死大鼠模型心脏的典型Masson染色图像（比例尺=100μm）。（B）心肌梗死后指定时间点边界区和偏远地区ADAMTS8蛋白表达的变化。（C）大鼠心脏梗死区和边缘区α-SMA和胶原蛋白I表达的Western blotting和量化。（D）ADAMTS8（绿色）和波形蛋白（红色）双重免疫荧光染色的代表性图像（比例尺=200μm）。（E、F）评估缺氧条件下12、24和48小时心肌细胞和心肌成纤维细胞中ADAMTS8蛋白水平通过西方印迹法。数据以平均值±SEM表示*P（P）<0.05 vs.0天（Sham）**P（P）<0.01 vs.0天（Sham）或ctrl组。

TAC诱导的大鼠心肌纤维化模型中ADAMTS8表达增加

在TAC诱导的心脏纤维化中获得了与MI大鼠模型相似的结果。天狼星红和马森染色证实了建模成功(图3A、B). 免疫荧光染色检测肥厚心肌组织中ADAMTS8的表达增加(图3C). 同样，western blot结果显示纤维化心脏中ADAMTS8、α-SMA和胶原蛋白1的表达增加(图3D). 同时，我们检测了血管紧张素Ⅱ（1μM）刺激的心肌细胞和心肌成纤维细胞中ADAMTS8的表达；Ang-II刺激后，这些细胞中ADAMTS8的蛋白表达上调(图3E、F). 总之，这些结果表明，ADAMTS8表达增加与心脏损伤或压力过载大鼠的心脏纤维化有关。

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图3

在TAC诱导的心肌纤维化大鼠模型中，ADAMTS8表达增加。（A、B）来自假心脏和TAC诱导心脏的代表性天狼星红和马森染色图像（比例尺=200μm）。（C）正常和TAC诱导大鼠ADAMTS8（绿色）和波形蛋白（红色）的免疫荧光染色（比例尺=100μm）。（D）假手术组和TAC模型组的ADAMTS8、α-SMA和胶原蛋白1表达通过western印迹并根据免疫印迹定量。（E、F）经PBS或Ang-II治疗的心肌细胞和心肌成纤维细胞中ADAMTS8蛋白水平。数据以平均值±SEM表示**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001 vs.假手术。

ADAMTS8促进肌成纤维细胞形成在体外

在之前的一项关于慢性低氧诱导肺动脉高压模型的研究中，心肌细胞ADAMTS8特异性敲除小鼠的右心室纤维化明显低于对照小鼠(15). 我们的研究结果表明，在缺氧和血管紧张素II刺激下，心肌细胞中ADAMTS8的表达变化比心肌成纤维细胞中更明显。考虑到心脏纤维化主要由常驻心脏成纤维细胞的激活介导，ADAMTS8的主要功能是降解细胞外基质的关键成分(23)我们推测ADAMTS8可能由心肌细胞分泌，然后通过旁分泌激活心脏成纤维细胞，从而影响心脏纤维化。为了证实这一假设，我们首先探讨了ADAMTS8是否影响成纤维细胞。使用三种ADAMTS8特异性siRNA转染心脏成纤维细胞。转染48 h后，qPCR和western blot证实si2敲除效率最高(图4A). 我们还构建了一个含有过表达ADAMTS8（Ad-ADAMTS8）和阳性对照腺病毒（Ad-v）的腺病毒。通过免疫荧光和WB验证病毒转染效率(图4B). 将培养的新生大鼠心脏成纤维细胞转染Ad-ADAMTS8或si-ADAMTS48，以进一步探讨ADAMTS8在心脏纤维化中的作用及其机制。ADAMTS8过表达促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，表现为α-SMA、胶原1和CTGF的表达增加(图4C). 相反，ADAMTS8敲除抑制肌成纤维细胞活化(图4D)免疫荧光染色显示，ADAMTS8-siRNA组中α-SMA的表达与干扰siRNA组相比显著降低。同时，与Ad-v组相比，Ad-ADAMTS8治疗诱导α-SMA表达显著升高，表明ADAMTS8可以促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞(图4E). 这些结果为ADAMTS8加重心脏纤维化提供了证据在体外.

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图4

ADAMTS8促进肌成纤维细胞形成在体外.（A）qPCR和western blotting检测ADAMTS8三种不同干扰序列的敲除效率。（B）通过荧光和Western blotting验证ADAMTS8的过表达效率。（C、D）在感染ADAMTS8过表达腺病毒或si-ADAMTS8的培养的心脏成纤维细胞中检测到α-SMA、I型胶原和CTGF水平通过西方印迹法。（E）免疫荧光检测α-SMA（红色）和细胞核（DAPI：蓝色）的表达（标尺=20μm）。数据以平均值±SEM表示*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS与Ctrl或两组之间无显著性差异。

ADAMTS8介导心肌细胞与心肌成纤维细胞的相互作用

心肌细胞和成纤维细胞是心脏中的关键细胞类型，它们协同调节正常心脏功能和心脏对致病性刺激的反应(24). 据报道，ADAMTS8作为旁分泌介质，在肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）和肺动脉内皮细胞（PAECs）之间的相互作用中在肺动脉高压（PH）的发生发展中起着关键作用(15). 缺氧、Ang-II或刺激后心肌细胞ADAMTS8的表达增加更明显。先前的研究表明，ADAMTS8特异性敲除小鼠心肌细胞后，与对照小鼠相比，右心室纤维化明显减少。因此，我们接下来评估了ADAMTS8心肌细胞衍生的旁分泌信号对心脏成纤维细胞的影响。我们将心脏成纤维细胞与转染过表达ADAMTS8腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）或siRNA（si-ADAMTS_8-co。正如预期的那样，转染过表达ADAMTS8腺病毒的心肌细胞共培养增强了SD大鼠心脏成纤维细胞的迁移能力，但si-ADAMTS8-co抑制了成纤维细胞迁移(图5A、B). 为了证实我们的发现，我们从转染了Ad-ADAMTS8（Ad-ADATS8-CM）或si-ADAMTS48（si-ADAMS8-CM）的心肌细胞中制备条件培养基（CM），用于CCK8分析。结果表明，与对照组相比，用si-ADAMTS8-CM培养的心脏成纤维细胞的细胞增殖也降低(图5C). 此外，与转染过表达ADAMTS8腺病毒的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞增加了增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，但降低了kip27（细胞周期素依赖性激酶抑制剂）的表达。相反，与si-ADAMTS8-co共培养降低了CFs的PCNA表达，增加了p27Kip1的表达(图5D、E). 因此，这些数据表明，心肌细胞分泌ADAMTS8可能与心肌细胞和心脏成纤维细胞在心肌纤维化发展过程中的相互作用有关。

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图5

ADAMTS8介导心肌细胞和心脏成纤维细胞之间的相互作用。（A）创伤修复试验评估心脏成纤维细胞与转染ADAMTS8过表达腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）或siRNA（si-ADAMTS4-co）的心肌细胞共同培养的心肌细胞的迁移能力。（B）Transwell迁移分析和迁移心脏成纤维细胞的量化（比例尺=50μm）。（C）CCK-8测定法定量(n个=每组4人）。（D、E）检测与转染ADAMTS8过表达腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）或siRNA（si-ADAMTS4-co）的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞中p27kip1和PCNA的水平通过西方印迹法。数据以平均值±SEM表示*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）两组之间<0.001。

ADAMTS8介导的心脏成纤维细胞线粒体功能障碍和激活Ros敏感通路调节纤维反应

ADAMTS8促进肺动脉平滑肌细胞的线粒体分裂，导致ROS生成和细胞增殖增加(15). 最近的研究表明，活性氧（ROS）和线粒体功能在CF增殖和激活中发挥着新的作用。同时，线粒体分裂诱导的活性氧生成激活p38-MAPK的磷酸化，增加大鼠心脏成纤维细胞的增殖和胶原生成(25,26). 在肺成纤维细胞中，TGFβ转录诱导的线粒体ROS生成导致NOX4表达增加，这被认为是维持细胞内ROS水平升高以激活PI3K-AKT和MAPK信号通路的一种方法(27). 因此，我们探讨了ADAMTS8对心脏成纤维细胞的作用是否与细胞内线粒体分裂与融合之间的平衡有关，从而激活PI3K-AKT和MAPK信号通路。众所周知，drp1在Ser637被磷酸化，从而抑制线粒体的分裂(28). 我们发现ADAMTS8-siRNA处理激活了drp1磷酸化（Ser637）(图6A). RT-PCR显示，与SCR组相比，si-ADAMTS8组的融合前基因（Mfn1和Mfn2）显著上调(图6B). 与这些发现一致的是，ADAMTS8的过度表达显著降低了drp1在Ser637的磷酸化水平(图6C). 此外，ADAMTS8过表达增加了NOX4表达和ROS水平(图6D、E). 为了阐明ADAMTS8对成纤维细胞的潜在分子机制，我们分析了ADAMTS9是否影响上述PI3K-AKT和MAPK信号通路。与以往研究一致(29,30)si-ADAMTS8组ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平降低，而ADAMTS8过表达组则显著升高(图6F). 同时，在si-ADAMTS8组中AKT信号通路被抑制，而在ADAMTS8过度表达组中则显著激活(图6G). 最后，MAPK途径抑制剂SB203580和AKT抑制剂LY294002基本上消除了ADAMTS8对成纤维细胞活化的影响(图6H). 总之，这些结果表明，ADAMTS8是线粒体功能障碍的一种可能作用机制，它导致ROS依赖性激活p38-MAPK和AKT通路，以增加CFs的增殖和胶原生成。

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图6

ADAMTS8介导心脏成纤维细胞线粒体功能障碍并激活ROS敏感性通路以调节纤维化反应。（A、C）感染si-ADAMTS8或ADAMTS8-过表达腺病毒的培养心脏成纤维细胞中DRP-1（p-drp1）在Ser637和总drp1（t-drp1。（B）感染si-ADAMTS8的培养心脏成纤维细胞Mfn1和Mfn2 mRNA的实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析。平均表达值归一化为GAPDH mRNA。（D）对感染ADAMTS8-过表达腺病毒的培养心脏成纤维细胞中NOX4 mRNA的RT-PCR分析平均表达值归一化为GAPDH mRNA。（E）感染ADAMTS8-过表达腺病毒的CFs的二氢乙硫醚（DHE）染色的代表性图像。（F、G）培养的心脏成纤维细胞中MAPK和AKT的激活检测到ADAMTS8过表达或下调通过西方印迹法。（H）培养的心脏成纤维细胞感染ADAMTS8过表达腺病毒，在静止后用MAPK途径抑制剂SB203580或AKT抑制剂LY294002处理（25 uM），然后用指示的抗体分析细胞裂解物。数据以平均值±SEM表示*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）两组之间<0.001。

ADAMTS8激活YAP并抑制EGFR表达阻断ADAMTS8-诱导的培养心肌成纤维细胞YAP激活

众所周知，作为ECM关键成分的蛋白聚糖可以被ADAMTS8降解(23). ECM在生理和病理过程中影响细胞行为并提供结构支持。ECM还可以局部释放生长因子，如表皮生长因子（EGF），它可以作为与EGFR结合的可溶性配体。因此，通过蛋白水解降解的ECM重构可以释放这些生长因子，从而影响细胞增殖和迁移(31). 此外，ADAMTS8激活的ERK和PI3K-AKT通路是EGFR激活的不同效应通路(32). 因此，我们假设ADAMTS8释放的ECM蛋白片段可以作为可溶性配体与EGFR相互作用，然后激活ERK和PI3K信号通路。因此，我们将心脏成纤维细胞与用过表达的ADAMTS8腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）转染的心肌细胞共同培养。结果表明，成纤维细胞EGFR磷酸化水平升高。同时，EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼预处理可部分下调ADAMTS8诱导的p-Akt/Akt、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-p38/p38比值(图7A、B). 吉非替尼预处理也显著减弱ADAMTS8诱导的α-SMA和胶原蛋白1表达增加(图7C). 这些发现表明，ADAMTS8诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞至少部分是通过激活EGFR信号通路介导的。对果蝇和糖尿病肾间质纤维化的几项研究表明，激活PI-3激酶-Akt和MAPK通路导致YAP激活(33,34)EGFR是这两条通路的上游。同时，一项研究表明，心肌梗死后阻断成纤维细胞YAP可减轻心肌纤维化(35). 因此，我们假设ERK和PI3K-Akt信号的激活依赖于EGFR，并且它们的相互作用是ADAMTS8过表达后YAP激活的上游。正如我们所料，在与转染过表达ADAMTS8腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）的心肌细胞共同培养的CFs中，丝氨酸127（s127）处的YAP表达和YAP磷酸化上调，而TAZ（另一个河马信号效应器）下调。吉非替尼（一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂）治疗逆转CFs中YAP表达和YAP磷酸化的增加以及TAZ表达的降低(图7D). 此外，我们发现与转染过表达的ADAMTS8腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）的心肌细胞共同培养的CFs中I型胶原和a-SMA的上调通过YAP抑制剂verteporfin的治疗被显著抑制，这表明YAP是上述途径的下游(图7E). 同时，用SB203580抑制MAPK或用LY294002抑制PI3K也可以抑制与转染过表达ADAMTS8腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞中诱导的YAP表达增加和YAP磷酸化(图7F). 这些结果表明，ADAMTS8介导了YAP的表达，EGFR位于上游。

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图7

ADAMTS8激活了YAP，抑制EGFR表达阻断了ADAMTS8-诱导的培养心肌成纤维细胞中YAP的激活。（A、B）吉非替尼组EGFR及其下游MAPK和AKT的磷酸化水平均减弱。（C）EGFR抑制剂减轻了ADAMTS8诱导的心脏成纤维细胞活化。（D）与转染ADAMTS8过表达腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞用或不用吉非替尼处理，然后用指示的抗体分析细胞裂解产物。（E）维替泊芬组胶原蛋白1和α-SMA的蛋白水平均部分下降。（F）与感染ADAMTS8过表达腺病毒的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞在静止后用MAPK途径抑制剂SB203580或AKT抑制剂LY294002处理，然后用指示的抗体分析细胞裂解产物。

ADAMTS8过度表达促进心肌纤维化和心功能受损体内

为了探讨ADAMTS8在损伤后心肌纤维化中的作用，在结扎大鼠LAD动脉后，我们在梗死边缘区的多个位置向心肌注射携带过表达ADAMTS8+阳性对照腺病毒的腺病毒(补充图1A). 心肌梗死后7天用western blot检测ADAMTS8的表达水平(补充图1B). 天狼星红染色和Masson染色结果表明，ADAMTS8的过度表达加重了心肌纤维化的程度(图8A–C). 进行超声心动图检查以评估ADAMTS8过度表达是否影响心脏功能。与注射阳性对照病毒的大鼠相比，注射过表达ADAMTS8腺病毒大鼠心肌梗死后心功能显著下降(图8D). 与上述结果一致，与注射对照病毒的大鼠相比，注射过表达ADAMTS8腺病毒大鼠的Collage1和α-SMA表达水平高于注射对照病毒大鼠，表明ADAMTS9在激活心脏成纤维细胞中起关键作用体内(图8E). 此外，我们检测了大鼠心肌梗死模型中的EGFR、MAPK和AKT通路，发现与干扰心肌梗死组相比，ADAMTS8过表达心肌梗死组中EGFR、ERK、JNK、p-38和AKT的磷酸化水平显著升高(图8F). 总之，上述结果表明ADAMTS8的过度表达促进了心脏纤维化和心功能受损体内.

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图8

ADAMTS8过度表达促进心脏纤维化和心功能受损体内.（A–C）Ad-v Sham、Ad-ADAMTS8 Sham、Adv-v MI和Ad-ADATS8 MI大鼠梗死边缘区天狼星红和Masson染色的代表性图片以及间质纤维化区域的定量分析（比例尺=50μm）。（D）Ad-v Sham、Ad-ADAMTS8 Sham、Adv-v MI和Ad-ADATS8 MI组的代表性M模式图像；EF已量化通过超声心动图。（E）western blotting定量Collage1和α-SMA表达水平。（F）检测腺病毒注射后MI大鼠模型EGFR、MAPK和AKT信号通路的激活通过西方印迹法体内数据表示为平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,^#P（P）< 0.05,^##P（P）<0.01，NS表示两组之间无显著性差异。