世界胃肠病杂志。2022年1月7日；28(1): 123–139.
局灶黏附激酶相关非激酶通过抑制有氧糖酵解改善肝纤维化通过FAK/Ras/c-myc/ENO1通路
，，，，，，，，、和
陶晃
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州医科大学，贵阳550004，中国贵州省
李元庆Xiao
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004
明玉周
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004
胡瑞涵
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004
邹高良
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004
李建超
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004
舒峰
贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004
刘永美
贵州医科大学附属医院临床实验室中心，贵州省贵阳市550004
长秦新
中国贵州省威宁市553100回族苗族自治县威宁县人民医院传染病科
黄涛，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004；
作者贡献：赵XK设计了该研究；黄T做了大部分实验并写了这篇文章；所有作者都对研究的设计和解释做出了贡献。国家自然科学基金资助项目81860115、82060116、81960118；贵州省科技支撑项目。[2021] 094.
通讯作者：赵学可，博士，贵州医科大学附属医院传染病科教授，中国贵州省贵阳市北京路9号，550004。在1ekeuxoahz条件下的最大电流361
2021年7月14日收到；2021年10月22日修订；2021年12月22日验收。
版权©作者2022。由Baisheding Publishing Group Inc.出版。保留所有权利。 摘要
背景
肝星状细胞（HSC）过度激活是肝纤维化发展的中心环节。HSC进行有氧糖酵解，为其活化提供能量。黏着斑激酶（FAK）促进癌细胞或成纤维细胞的有氧糖酵解，而FAK相关非激酶（FRNK）抑制FAK磷酸化和生物功能。
目标
从HSC有氧糖酵解代谢水平阐明FRNK对肝纤维化的影响。
方法
通过注射CCl建立小鼠肝纤维化模型4并评价FRNK对模型肝纤维化程度的影响。转化生长因子-β1用于激活LX-2细胞。检测397位酪氨酸磷酸化（pY397-FAK）以确定激活的FAK，并评估糖酵解相关蛋白单羧酸转运体1（MCT-1）和烯醇化酶1（ENO1）的表达。进行生物信息学分析以预测ENO1启动子区c-myc的假定结合位点，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双核糖核酸酶报告分析进行验证。
结果
人纤维化肝组织中pY397-FAK水平升高。FRNK基因敲除促进小鼠模型的肝纤维化。它还增加了原代肝星状细胞（pHSC）的活化、迁移、增殖和有氧糖酵解，但抑制了pHSC的凋亡。然而，在外源性FRNK处理LX-2细胞后，观察到这些现象的相反趋势。从机制上讲，FAK/Ras/c-myc/ENO1途径促进了有氧糖酵解，而外源性FRNK抑制了有氧糖解。
结论
FRNK通过抑制FAK/Ras/c-myc/ENO1途径抑制HSC中的有氧糖酵解，从而改善肝纤维化。FRNK可能是肝纤维化治疗的潜在靶点。
关键词：肝纤维化、肝星状细胞、局灶性黏附激酶、局灶黏附激酶相关非激酶、有氧糖酵解、烯醇化酶1
核心提示：我们发现，局灶性粘附激酶相关非激酶（FRNK）限制肝星状细胞（HSC）的激活、增殖和迁移，并通过抑制有氧糖酵解促进HSC凋亡，从而改善肝纤维化。FRNK可能是肝纤维化治疗的潜在候选药物。
简介
肝炎病毒、酒精和饮食对肝功能的长期损害可能导致慢性肝损伤，导致肝纤维化和肝硬化[1-4]其特征是肝星状细胞（HSC）活化并转化为肌成纤维细胞[5]. 这一过程持续损害肝脏，破坏肝脏自我修复的平衡，导致细胞增殖和迁移增加，凋亡率降低[6-8]. 目前，非肝硬化患者的慢性肝损伤相关的病理改变可以在清除病因后逆转，例如在一小部分乙型肝炎和酒精性脂肪肝患者以及大多数丙型肝炎患者中[1，9]，但其余的肝纤维化患者由于无法完全有效地逆转发病机制以及缺乏有效的抗纤维化药物而发展为不可逆的肝硬化[10]. 因此，研究肝纤维化的治疗尤其重要，其中调节HSC的相关生物学功能是最重要的抗纤维化方法[11，12].
焦黏附激酶（FAK）是一类非受体细胞溶质蛋白酪氨酸激酶，属于蛋白酪氨酸蛋白激酶超家族[13，14]. 通过整合整合素、生长因子和机械刺激的信号，FAK在细胞信号转导中发挥重要作用，增强细胞和组织的增殖、迁移、伤口愈合和血管生成等生物学行为[15，16]. FAK通过聚集整合素受体与细胞外基质（ECM）蛋白结合形成FAK二聚体，进而诱导397位酪氨酸磷酸化（pY397-FAK）；pY397-FAK调节细胞中的这些生物功能[17，18]因此在多种恶性肿瘤细胞中起重要作用[18，19]. FAK相关非激酶（FRNK）是一种独立表达的蛋白质，其核苷酸序列与FAK的C末端相对应，但缺乏FAK的N末端功能位点[20]主要功能是抑制FAK磷酸化，从而在细胞激活后反向调节FAK的功能[21，22]. FRNK负性调节FAK信号轴功能，从而改善实验性小鼠模型的肺纤维化[23].
FAK在胰腺导管腺癌细胞中也过度表达[24，25]通过增加烯醇酶1（ENO1）、丙酮酸激酶2、乳酸脱氢酶和单羧酸转运体（MCT）-1的表达和乳酸转运，促进丙酮酸转化为乳酸，增强癌细胞的有氧糖酵解，抑制癌细胞线粒体氧化磷酸化[16]. 这种向有氧糖酵解的转变是肿瘤细胞获得能量的重要机制[17，26]，这一事实表明，即使在充足的氧气和正常的线粒体功能存在的情况下，氧化磷酸化也能同时为进行有氧糖酵解的细胞提供能量[27，28]. HSC也表现出有氧糖酵解增加，当它们分化为肌成纤维细胞时，导致乳酸积累和糖异生抑制[8，28]. 这种现象也发生在先天性肺纤维化患者中[29]. 因此，FRNK对FAK相关通路的抑制可能会减少HSC激活期间通过有氧糖酵解获得的能量，并可作为改善肝纤维化的靶向治疗。然而，很少有研究关注FRNK在肝纤维化过程中获取能量的生理或病理作用，其机制尚不清楚。
在本研究中，我们首次发现FRNK在人类肝纤维化组织中下调。然后，我们验证了FRNK击倒体内和体外促进有氧糖酵解和肝纤维化。外源性FRNK通过抑制FAK/Ras/c-myc/ENO1途径抑制有氧糖酵解，限制HSC活化、迁移和增殖，增加细胞凋亡以改善肝纤维化。总之，这些数据提供了FRNK发挥作用的详细机制，并表明FRNK是抑制HSC有氧糖酵解和治疗肝纤维化的潜在靶点。
材料和方法
人类肝脏样本
2019年3月至2019年9月，从贵州医科大学附属医院感染科采集了15例肝纤维化患者肝组织石蜡块；所有患者均无其他器官特异性或全身性疾病，肝纤维化均经病理活检确诊。从贵州医科大学附属医院肝胆外科患者手术切除的远端肝癌肝组织中获得15个健康肝脏样本，样本中无任何异常。上述受试者均无肝活检禁忌症，本研究经贵州医科大学附属医院伦理委员会批准（2018年伦理审查第032号批准），并按照1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则进行。获得患者的书面知情同意书。
动物
FRNK基因敲除（FRNK-/-)老鼠是美国亚拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学院呼吸和危重症护理医学中心赠送的礼物。所有小鼠干预均经贵州医科大学动物保护委员会（IACUC）批准（编号：1801109），方法和实验程序均按照相关指南和规定执行。使用相同基因型的野生型（WT）小鼠作为对照，所有实验小鼠均为C57BL/6背景。
小鼠保持在无致病条件下，控制温度（22±2°C），光周期一致（12:12 h光暗周期）；每个笼子里有五只老鼠，笼子里装有柔软的床上用品。在纳入实验之前，小鼠对这些条件习惯了2天。选择健康雄性小鼠（8-11周龄，体重20±3 g），腹腔注射1.5μL/g 10%四氯化碳（CCl）4)在玉米油溶液中每周三次建立肝纤维化模型。对照组小鼠每周注射1.5μL/g玉米油溶液三次。在每个时间点，即0、2、4和6周，收获肝脏进行实验。每组使用六只小鼠。
试剂和抗体
CCl公司4玉米油和OptiPrep从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。转化生长因子-β1（TGF-β1）购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。从Abcam（英国剑桥）购买了针对以下蛋白质的一级抗体：Desmin兔单克隆抗体（ab32362）、FAK兔单抗（ab40794）、ENO1小鼠单克隆抗体和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）兔多克隆抗体（ab9485）。抗c-myc（13987）兔单克隆抗体购自Cell Signaling Technology（中国上海）。MCT-1兔多克隆抗体（20139-1-AP）购自Proteintech（中国武汉）。pY397-FAK兔多克隆抗体（AF3398）购自Affinity Bioscience（美国俄亥俄州辛辛那提）。所有其他化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）和Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。
免疫组织化学（IHC）、苏木精和伊红（H&E）、马森三色和天狼星红染色和羟脯氨酸测定
H&E染色试剂盒、Masson三色染色溶液和Sirius Red染色溶液购自Solarbio生物技术有限公司（中国北京），并根据制造商指南使用。使用南京建成生物科技（中国南京）羟脯氨酸试剂盒进行羟脯氨酸检测。所有套件均按照使用说明使用。肝脏样本用中性缓冲福尔马林固定，并包埋在石蜡中进行IHC。简言之，用所示抗体培养切片。辣根过氧化物酶偶联抗体被用作次级抗体。最后，使用二氨基联苯胺比色试剂溶液，然后进行苏木精复染。然后对幻灯片进行扫描，并获取代表性图像。
细胞和细胞培养
LX-2细胞购自中国上海中桥新洲。人类HSC（ZQ0026）和LX-2细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中培养（FBS；Biological Industries，Kibbutz Beit-Haemek，Israel）。从C57BL/6 WT或FRNK中提取原代肝星状细胞（pHSC）-/-如前所述，8-11周龄小鼠[30，31]. 简单地说，用一个“交叉”切口打开腹腔，从左心室插入一个18号套管针，注入预灌注液，通过放血冲洗肝脏中的血液，直到组织变黄。然后，用蛋白酶和胶原酶替换预灌注液15-20分钟，取出肝脏并用生理盐水清洗。取出肝包膜和结缔组织，在37°C下用消化液充分消化，摇动并研磨，形成单细胞悬浮液。在1500 rpm离心5 min后，丢弃上清液，并将颗粒重新悬浮在D-Hank溶液中。通过离心去除肝细胞，并直接添加梯度淋巴细胞分离液。用单层梯度离心法一步分离HSC，用DMEM洗涤细胞两次，用含10%FBS的DMEM培养细胞。用台盼蓝染色评价细胞存活率，用结蛋白免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。所有细胞在含有5%CO的培养箱中培养237°C时。
重组FRNK腺病毒载体转染及HSC活化
利用腺病毒介导的基因传递系统将FRNK cDNA有效地传递到HSC中。携带FRNK蛋白和绿色荧光蛋白（Ad-FRNK）以及绿色荧光蛋白结合腺病毒（Ad-GFP）的腺病毒载体购自Jikai Gene（中国上海）。所有转染均按照制造商的说明进行，在TGF-β1治疗前24 h，用Ad-FRNK或对照载体（Ad-GFP）转染无血清培养基（含1%BSA的DMEM）中的细胞。20小时后，用含有2 ng/mL TGF-β1的完整培养基培养细胞，并处理36小时[31].
Transwell、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和流式细胞术测定
根据制造商的协议，Transwell迁移实验使用8.0μm孔径的膜（美国科宁）。总共10个5将细胞接种在每个孔的上腔中的100μL无血清培养基中，同时将600μL完整培养基作为化学引诱剂添加到下腔中。在37°C下孵育6小时后，用棉签清除留在膜上表面的细胞，膜下表面的细胞被视为迁移细胞。在用4%多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫溶液染色后，在倒置显微镜下获得图像。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自Dojindo（中国上海），104将细胞（100μL/孔）接种在96周板中。将培养板置于培养箱中进行预培养后（37°C，5%CO2)向每个孔中加入10μL CCK-8溶液，然后用微孔板阅读器评估培养板，以检测450 nm处的吸光度。总共10个5各组细胞按使用说明用Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒（中国浙江省杭州市杭州市莲科）进行染色，用流式细胞仪（美国贝克曼）进行分类，并用flow Jo软件（Tree Star）进行分析；根据前向散射和侧向散射数据排除死亡细胞。
蛋白质印迹分析
如前所述进行蛋白质印迹分析[30]. 简言之，1%NP-40处理的全肝组织裂解物或全细胞裂解物用于Western blot分析。总蛋白提取后，使用BCA蛋白质检测试剂盒（马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）对蛋白质水平进行量化。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离20毫克每个蛋白质样品。GAPDH被用作所有斑点的负荷控制。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，在4°C下与一级抗体孵育过夜。第二天，用适当的二级抗体孵育后，用电化学发光检测试剂盒产生信号。
葡萄糖消耗、2-NBDG摄取和乳酸测定
根据制造商的说明，使用乳酸比色测定试剂盒（BioVision，Milpitas，CA，United States）检测培养基中的乳酸水平。2-NBDG葡萄糖摄取试剂盒（BioVision，Milpitas，CA，United States）用于检测细胞对葡萄糖的摄取，葡萄糖比色分析试剂盒（BioVision，Milpitas，CA，U.S.）用于检测培养基中的葡萄糖浓度，从而测量细胞葡萄糖的消耗。根据制造商的协议使用2-NBDG葡萄糖摄取试剂盒和葡萄糖比色测定试剂盒。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
JASPAR公司(网址：http://jaspar.genereg.net)和促销(网址：http://algen.lsi.upc.es)数据库分析预测ENO1启动子区有两个推测的c-myc结合位点。总共10个7根据制造商手册，将用甲醛固定的细胞收集在500μL裂解缓冲液中，该缓冲液来自Magna ChIP HiSens Kit（美国马萨诸塞州贝德福德市Millipore）。然后以6秒的通电间隔30秒和200 W的强度对细胞进行超声处理25个周期。然后，将上清液稀释并与蛋白a/G珠彻底混合。然后，添加5μg IgG或抗c-myc抗体，并在4°c下与混合物孵育过夜。第二天清洗珠子后，将混合物与洗脱缓冲液在62°C下孵育2小时，然后在95°C下培养10分钟。然后纯化洗脱的DNA，并进行PCR分析以评估结合序列。使用特定引物序列进行PCR。
双荧光素酶报告分析
c-myc对ENO1启动子的影响是通过将pcDNA-c-myc或pcDNA-vector（NC）与含有空序列（NC）或WT或MT1/MT2 ENO1基因启动子序列的pGL3构建物以及肾素荧光素酶报告质粒共同转染到LX-2细胞来确定的。转染24小时后，用萤光素酶报告基因测定试剂盒（Genomedicech，中国上海）测量萤火虫和雷尼拉萤光素酶活性。根据仪器说明书进行荧光检测，设置参数，测量时间为10 s，测量间隔为2 s。将每个样品加入总体积为20μL的测量管中（每次测量中样品体积一致），然后加入20μL萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀2-3次（无涡流），再次混匀并评估以确定相对光单位（RLU）1。将细胞裂解缓冲液设置为空白对照。在测量RLU2之前，将受试样品与20μL制备的Renilla荧光素酶测定工作液混合2-3次并充分混合。将测量的RLU1值与相应的RLU2值进行比较，得出的比率决定了报告者的激活程度。计算每个样本的萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的比率。
统计分析
使用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行统计分析吨测试用于不同组之间的比较。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。数据表示为平均值±SD。
结果
人纤维化肝组织中pY397-FAK蛋白水平升高，而FRNK蛋白水平降低
我们首先研究了纤维化肝组织中pY397-FAK的水平，以探讨pY397-2FAK在肝纤维化中的作用。与正常肝组织相比，肝纤维化组患者的肝组织样本表现出典型的病理特征，包括显著的脂肪变性、炎症坏死、显著的胶原沉积、肝纤维化和肝细胞疏松。Masson’s三色染色显示正常组胶原沉积较少，细胞形态正常，而肝纤维化组可见大量蓝色胶原纤维，组织中积聚了广泛的胶原纤维，延伸并分布在肝小叶中。天狼星红染色显示正常受试者胶原沉积较少，细胞形态正常，但大量红色染色显示纤维化肝组织门脉区胶原沉积。值得注意的是，IHC显示纤维化肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和pY397-FAK的表达高于正常肝组织（图和)。Western blot分析显示，纤维化肝组织中的pY397-FAK蛋白水平高于正常肝组织。相反，在纤维化肝组织中，FRNK的表达水平低于正常组织(P（P）<0.05，图和)。这些结果表明，纤维化肝组织中pY397-FAK蛋白表达增加，FRNK蛋白表达降低。
FAK 397位的酪氨酸磷酸化上调，而FRNK在人纤维化肝组织中表达下调。A： 肝活检后进行H&E、Masson’s三色和Sirius Red染色，在200倍放大镜下评估正常人和肝纤维化患者的组织；B： 免疫组织化学显示，与肝纤维化患者相比，在200倍或400倍放大镜下，正常人肝脏中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达和FAK（pY397-FAK）397位酪氨酸磷酸化的变化；C和D：用Western blotting分析活检组织中的蛋白表达。显示了三个独立重复测定的代表性结果。一P（P）<0.05. 数据以平均值±SD表示。FAK：粘着斑激酶；FRNK：粘着斑激酶相关非激酶；GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。
FRNK基因敲除后小鼠体内肝纤维化和有氧糖酵解加剧
我们通过注射CCl建立了一个纤维化模型4进入WT小鼠和FRNK-/-老鼠。两周后，pY397-FAK蛋白表达达到峰值，而FRNK蛋白表达处于低水平(P（P）<0.05，图和)。因此，在随后的实验中使用注射四周的小鼠模型。通过H&E、Masson’s三色和Sirius Red染色，我们发现FRNK中有更大的肝纤维化区域和更广泛的肝纤维化-/-CCl后小鼠比WT小鼠4干预(P（P）<0.05，图和)而FRNK中的羟脯氨酸含量-/-纤维化小鼠大于纤维化WT小鼠(P（P）<0.05，图)。蛋白质印迹分析显示FRNK肝组织中pY397-FAK、MCT-1、ENO1和α-SMA蛋白水平较高-/-CCl治疗小鼠4比WT小鼠(P（P）<0.05，图和)。根据这些结果，FRNK-/-CCl后小鼠出现更严重的肝纤维化4干预，以及有氧糖酵解相关蛋白MCT-1和ENO1的表达增加。这表明肝脏中可能存在更活跃的有氧糖酵解。
FRNK基因敲除后，小鼠肝纤维化加重。A和B:WT小鼠建模6周，pY397-FAK和FRNK蛋白表达水平体内每两周用Western blotting法测量一次；C和D：FRNK-/-和WT小鼠通过注射CCl建立肝纤维化模型4（1.5μL/g），4周后用H&E、Masson三色染色和天狼星红对这些小鼠的肝组织进行染色，并在光学显微镜下观察×200放大倍数。分析相关纤维化区域；E： 测定肝纤维化模型肝组织中羟脯氨酸的含量；F和G：Western blotting检测FRNK建立的肝纤维化模型中蛋白质的相对表达-/-小鼠和WT小鼠。显示了三个独立重复分析的代表性结果(n个= 6).一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01之间。数据表示为平均值±标准偏差。MCT-1：单羧酸转运蛋白-1；ENO1：烯醇化酶1。
FRNK基因敲除在体外促进肝纤维化和有氧糖酵解
我们从WT小鼠和FRNK中提取了pHSC-/-鼠标用于体外实验(补充图1)。TGF-β1治疗36小时后，pHSC从FRNK中迁移-/-Transwell室中的组数增加(P（P）<0.05，图)。如细胞增殖水平所示，FRNK的pHSC-/-组表现出细胞活性增加(P（P）<0.05，图)。从FRNK向pHSC中添加TGF-β1后-/-小鼠36 h后，细胞凋亡率低于对照小鼠的pHSC(P（P）<0.05，图)。此外，来自FRNK的pHSC-/-与对照pHSC相比，小鼠的葡萄糖摄取和消耗增加。此外，FRNK pHSC培养基中的乳酸水平-/-与对照组pHSC培养基中的乳酸水平相比，小鼠的乳酸水平升高(P（P）<0.05，图和)。Western blot分析显示FRNK的pHSC中MCT-1、ENO1和α-SMA蛋白水平较高-/-小鼠高于WT小鼠的pHSC(P（P）<0.05，图和)。上述结果表明，FRNK基因敲除可增加小鼠pHSC的活化、迁移和增殖，并减轻pHSC凋亡，同时增强其有氧糖酵解能力体外.
FRNK基因敲除促进肝纤维化和有氧糖酵解体外.A： 用TGF-β1（2 ng/mL）培养36小时后，在×200放大倍数的光学显微镜下（105每个孔的细胞数）；B： 用CCK-8法评估pHSC的增殖；C： 干预36 h后用流式细胞仪分析pHSC的凋亡；检测在相同干预条件下培养的D和E:pHSC的葡萄糖摄取和消耗，并评估细胞培养液中的乳酸水平；F:MCT-1、ENO1和α-SMA在pHSC中的水平通过Western blotting进行评估。显示了三个独立重复分析的代表性结果。一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01结果表示为平均值±标准偏差。
外源性FRNK改善体外实验性肝纤维化和有氧糖酵解
我们用含有FRNK的腺病毒转染LX-2细胞，诱导外源性FRNK基因的表达，并用TGF-β1孵育细胞36小时。然后对转染细胞进行Transwell、CCK-8和流式细胞术分析，以评估迁移、增殖和凋亡。与对照组相比，引入外源性FRNK后LX-2细胞的迁移受到抑制，细胞凋亡增加(P（P）<0.05，图和)。此外，增殖也受到抑制(P（P）<0.01，图)。基于这些结果，外源性FRNK抑制细胞迁移和增殖，并促进细胞凋亡。Ad-FRNK组细胞摄取和消耗葡萄糖的能力降低，细胞培养液中的乳酸水平降低(P（P）<0.05，图和)。随后提取细胞蛋白，用Western blotting检测细胞内pY397-FAK、MCT-1、ENO1和α-SMA蛋白的相对水平。上述蛋白质在Ad-FRNK组中的相对表达低于对照组(P（P）<0.05，图和)。因此，将外源性FRNK引入HSC可抑制细胞增殖和迁移，并促进细胞凋亡。它还抑制细胞有氧糖酵解，从而抑制细胞能量生成体外.
外源性FRNK改善实验性肝纤维化和有氧糖酵解体外.用同样编码FRNK基因的绿色荧光蛋白结合腺病毒载体（Ad-GFP）转染LX-2细胞。A： 用TGF-β1（2 ng/mL）培养36 h（105每个孔的细胞数）。通过在光学显微镜×200倍放大镜下分析细胞来测量迁移；B： 介绍了干预条件下培养的LX-2细胞的增殖情况；C： 流式细胞仪检测干预36 h后LX-2细胞的凋亡情况；检测在相同干预条件下培养的D和E:LX-2细胞的葡萄糖消耗和摄取能力，并评估细胞培养液中的乳酸水平；F和G：用Western blotting检测LX-2细胞中pY397-FAK、MCT-1、ENO1和α-SMA的水平。显示了三个独立重复测定的代表性结果。一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01之间。结果显示为平均值±SD。
FRNK不直接针对ENO1
为了探索FRNK调控ENO1蛋白的确切分子机制，采用TGF-β1刺激LX-2细胞激活FAK。TGF-β1刺激后pY397-FAK水平升高。还检测了FAK下游K-Ras、c-myc和ENO1蛋白的表达(P（P）<0.05，图和)。在检测FRNK是否直接抑制ENO1蛋白表达时，在LX-2细胞中引入外源性c-myc后，观察到ENO1蛋白质表达增加，但在继续引入外源性FRNK后，ENO1的蛋白表达没有降低(P（P）<0.05，图和)表明外源性FRNK并不直接抑制ENO1蛋白表达以发挥其生物学功能。作为研究c-myc是否直接调控ENO1的一种方法，对ENO1启动子进行生物信息学分析，以预测ENO1基因启动子中c-myc的假定结合位点，然后进行ChIP和双荧光素酶报告分析，以验证c-myc转录激活ENO1启动子(P（P）<0.05，图和)。结果表明，TGF-β1通过诱导397位FAK磷酸化激活FAK。然后，pY397-FAK增加下游K-Ras和c-myc蛋白的表达，随后c-myc转录激活ENO1表达，促进HSC中的有氧糖酵解和活化。外源性FRNK的引入抑制了pY397-FAK及其生物功能，限制了HSC中的有氧糖酵解和活化，并改善了肝纤维化（图).
FRNK并不直接针对ENO1。A和B：从LX-2细胞中提取蛋白质，并测定pY397-FAK、K-Ras、c-myc和ENO1蛋白质的相对水平；C和D：用pcDNA-C-myc或pcDNA-vector（NC）转染LX-2细胞后，转染含有FRNK基因（Ad-FRNK）或阴性对照（Ad-GFP）的腺病毒载体，并用提取的蛋白通过Western blotting评估ENO1的表达；E： 人类ENO1启动子中假定c-myc结合位点的结构示意图，以及用抗c-myc或IgG进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析；F： 双荧光素酶报告子分析显示，转染c-myc或NC质粒的LX-2细胞中WT、突变（MT）1和MT2 ENO1启动子的荧光素素酶活性。显示了三个独立重复分析的代表性结果。一P（P）<0.05和b条P（P）<0.01之间。结果显示为平均值±SD。
FRNK抑制FAK/Ras/c-myc/ENO1通路改善肝纤维化的示意图。
讨论
肝损伤与自我修复之间的失衡是肝纤维化发展的关键，从失衡状态中恢复平衡是肝脏疾病的潜在治疗方法。在本研究中，我们证实FRNK通过调节肝纤维化过程中的有氧糖酵解来改变HSC的激活、增殖、迁移和凋亡。FRNK通过FAK/Ras/c-myc/ENO1途径抑制ENO1激活，从而抑制HSC中的有氧糖酵解。
我们小组的早期研究证实，FAK在HSC的激活和肝纤维化的发展中起着重要作用，并且FAK基因表达的抑制抑制了肝纤维化的发生[30]. 丁等[23]证实FRNK在肺纤维化过程中负调节FAK磷酸化诱导的肺纤维化。如果FRNK抑制FAK在肺纤维化中的生物学功能，并使用类似机制抑制肝纤维化，则可能是肝纤维化的潜在治疗靶点。先前对FRNK的研究集中在抑制血管平滑肌的迁移功能上[32，33]结合HSC激活期间细胞外乳酸的积累[28，34]FAK激活肿瘤细胞的有氧糖酵解功能[35-37]. FRNK可能通过抑制HSC中有氧糖酵解和FAK激活来改善肝纤维化，但FRNK发挥这种作用的机制尚不清楚。
在当前的研究中，我们首先观察到肝纤维化患者组织中pY397-FAK蛋白表达增加，FRNK蛋白表达减少（图)。使用CCl的后续实验4在小鼠模型中复制肝纤维化产生了相同的结果（图)。因此，我们推测肝纤维化的发生与FRNK表达下调之间可能存在相关性，并随后在WT小鼠和FRNK中进行了实验-/-老鼠。CCl后4干预后，WT小鼠的肝纤维化程度低于FRNK小鼠-/-鼠标（图和)。FRNK肝组织中有氧糖酵解相关蛋白MCT-1和ENO1的表达-/-小鼠数量增加（图和)提示FRNK基因缺失可能促进肝内有氧糖酵解，加重肝纤维化的发生发展。我们从WT小鼠和FRNK中提取pHSC-/-鼠标用于体外进一步探讨FRNK对HSC生物学功能的影响的实验。经TGF-β1处理后FRNK中pHSC的生物学功能-/-小鼠比来自WT小鼠的pHSC更活跃，迁移和增殖增加，凋亡率降低（图-)。此外，FRNK对葡萄糖的摄取和消耗以及细胞外乳酸水平-/-pHSC增加（图和)表明缺乏FRNK的HSC表现出更活跃的有氧糖酵解，为其生物功能提供能量，如活化、增殖和迁移。另一方面，我们用携带FRNK基因的腺病毒转染LX-2细胞，以验证外源性FRNK是否是肝纤维化的一个有希望的治疗靶点。FRNK过度表达后，细胞增殖和迁移减少，而凋亡细胞的百分比增加（图-)。LX-2细胞对葡萄糖的吸收和利用以及细胞外乳酸水平也降低（图和)pY397-FAK在这些细胞中的表达降低（图和)。这些结果进一步表明，外源性FRNK表达的增加阻止了HSC通过有氧糖酵解获得能量，并减少了细胞活化和活化后一系列生物功能所需的能量供应，从而抑制了肝纤维化。在研究FRNK调节HSC有氧糖酵解的机制时，我们发现在TGF-β1刺激的LX-2细胞中FAK被磷酸化，下游蛋白K-Ras、c-myc和ENO1被激活。引入FRNK后，ENO1蛋白表达降低（图和)。我们将c-myc和FRNK基因转染到LX-2细胞中，以确定FRNK是否直接抑制ENO1表达，并发现外源性FRNK表达增加时ENO1蛋白表达没有降低（图和)因此表明FRNK并不直接抑制ENO1蛋白的表达。因此，我们进一步假设c-myc直接改变ENO1蛋白的表达。早期研究表明，c-myc参与多种生物功能的调节，包括代谢、细胞生长、细胞周期调节和凋亡[38，39]，与我们的研究结果一致。越来越多的研究表明，c-myc作为转录因子参与启动子的调控。因此，我们通过进行生物信息学分析预测了ENO1启动子区域中假定的c-myc结合位点，随后通过执行双荧光素酶报告子和ChIP分析证实了我们的假设，即c-myc转录激活ENO1，随后促进HSC中的肝纤维化（图和)。因此，我们的研究表明FRNK减轻了肝纤维化通过FAK/Ras/c-myc/ENO1途径。FRNK调控ENO1和MCT-1表达的分子机制应在未来进行更复杂的研究来证实，我们小组将致力于研究这一途径。
结论
总之，本研究首次揭示了FRNK在代谢水平上对肝纤维化的影响。实验结果表明，FAK/FRNK基因是肝纤维化潜在的治疗靶点，并为未来相关药物的开发提供了一些理论依据。
文章亮点
研究背景
肝星状细胞（HSC）过度活化是肝纤维化发展的核心环节。HSC进行有氧糖酵解，为其活化提供能量。
研究动机
黏着斑激酶（FAK）促进癌细胞或成纤维细胞的有氧糖酵解，而FAK相关非激酶（FRNK）抑制FAK磷酸化和生物功能。
研究目标
从HSC有氧糖酵解代谢水平阐明FRNK对肝纤维化的影响。
研究方法
通过注射CCl建立小鼠肝纤维化模型4并评价FRNK对模型肝纤维化程度的影响。转化生长因子-β1用于激活LX-2细胞。检测397位酪氨酸磷酸化（pY397-FAK）以确定激活的FAK，并评估糖酵解相关蛋白单羧酸转运体1（MCT-1）和烯醇化酶1（ENO1）的表达。进行生物信息学分析以预测ENO1启动子区c-myc的假定结合位点，并通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双核糖核酸酶报告分析进行验证。
研究结果
人纤维化肝组织中pY397-FAK水平升高。FRNK基因敲除促进小鼠模型的肝纤维化。它还增加了原代肝星状细胞（pHSC）的活化、迁移、增殖和有氧糖酵解，但抑制了pHSC的凋亡。然而，在外源性FRNK处理LX-2细胞后，观察到这些现象的相反趋势。从机制上讲，FAK/Ras/c-myc/ENO1途径促进了有氧糖酵解，而外源性FRNK抑制了有氧糖解。
研究结论
FRNK通过抑制FAK/Ras/c-myc/ENO1途径抑制HSC中的有氧糖酵解，从而改善肝纤维化。FRNK可能是肝纤维化治疗的潜在靶点。
研究视角
FRNK调控ENO1和MCT-1表达的分子机制应在未来进行更复杂的研究来证实，我们小组将致力于研究这一途径。
致谢
作者感谢美国阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学院丁强教授的实验室赠送FRNK-/-并提供实验技术指导。
脚注
机构审查委员会声明：本研究经贵州医科大学附属医院机构审查委员会审查批准（批准2018伦理审查第032号）。
机构动物护理和使用委员会声明：动物护理和实验程序由贵州医科大学动物伦理委员会授权（编号1801109）。
利益冲突声明：作者没有要声明的利益冲突。
ARRIVE指南声明：作者已经阅读了ARRIVE.指南，手稿是根据ARRIVE-指南编写和修订的。
原产地和同行审查：未经请求的文章；外部同行评审。
同行评审模式：单盲
同行评审开始时间：2021年7月14日
第一次决定：2021年10月3日
新闻稿：2021年12月22日
专业类型：胃肠病和肝病
原产国/地区：中国
同行评审报告的科学质量分类
A级（优秀）：0
B级（非常好）：B、B
C级（良好）：C
D级（一般）：0
E级（差）：0
P-审核人：Morozov S，Truong NH S-编辑：Wang LL L-编辑：A P-编辑：王LL
参与者信息
黄涛，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004。
李元庆，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004。
周明宇，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004。
胡瑞涵，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004。
邹高良，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州医科大学，贵阳550004，中国贵州省。
李建超，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004。
舒峰，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州省贵阳市550004。
刘永美，贵州医科大学附属医院临床实验中心，贵州省贵阳市550004。
长秦新，中国贵州省威宁市回族苗族自治县威宁彝族人民医院传染病科，邮编553100。
赵学可，贵州医科大学附属医院传染病科，贵州医科大学，贵阳550004，中国贵州省。moc.361@1ekeuxoahz.
工具书类
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