有效的促凋亡联合治疗对多种癌症都非常有效

TRAIL–CDK9i在胰腺癌体内模型中比目前的标准药物更有效

由于PDAC通常在晚期被诊断，并且经常对吉西他滨（目前的一线治疗方法）表现出原发性耐药性，因此PDAC仍然是最致命的人类癌症之一[39]. 为了确定TRAIL–CDK9i在PDAC临床相关实验模型中是否能有效杀伤癌细胞，我们使用了与PDAC肿瘤三维体内结构非常相似的类器官培养物[40]. 我们首先测试了来自喀斯特^{LSL-G12D/重量}; 第53页^{LSL-R172H/重量}; Pdx-Cre公司（KPC）小鼠和KRas公司^{LSL-G12D/重量}; 第53页^前/后; Pdx-Cre公司;Rosa26-LSL-YFP公司（KPCY）小鼠对TRAIL–CDK9i的敏感性与体外吉西他滨的标准治疗进行比较。虽然这些PDAC类有机物对吉西他滨表现出高度耐药性，但它们对重组小鼠TRAIL（mTRAIL）与迪那西布林或NVP-2联合使用而不是单独使用这三种药物时的杀灭非常敏感（图2a、b).

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图2

TRAIL联合CDK9抑制在体内外显示出对胰腺类器官的治疗效果。

一,b条Sytox阳性的KPCY或KPC类有机物用DMSO、iz-mTRAIL（1000 ng/ml）和/或dinaciclib（100 nM）和/或者NVP-2（100 nM）或吉西他滨（1μM）处理24小时。比例尺，200µm（左侧面板）。通过CellTiter-Glo（右面板）测定KPCY或KPC类有机物的细胞活力。数据为平均值±SEM，n个 ≥ 三。c（c）实验方案：iz-mTRAIL（5 mg/kg）和/或dinaciclib（30 mg/kg）；皮下注射1×10⁶KPC单元。d日KPC肿瘤组织学分析及相应的CK19和AB/PAS染色。黑框表示底部区域放大。e（电子）第28天肿瘤重量量化。点代表单个老鼠。误差线代表平均值±SEM。

接下来，我们评估了TRAIL–CDK9i与吉西他滨在体内对KPC衍生类有机物的治疗效果。在免疫活性C57BL/6小鼠皮下注射KPC-衍生类有机物一周后（图2厘米和补充图2)小鼠发生皮下肿瘤，其特征是细胞角蛋白19（CK19）表达的导管网络和AB/PAS阳性病变，这是胰腺上皮内瘤变（PanINs）的两个特征（图二维). 这些PDAC前体病变对吉西他滨、mTRAIL、迪那西卜或NVP-2单独治疗基本耐药。然而，mTRAIL–CDK9i联合治疗，即mTRAIL-dinacilib和mTRAIL-NVP-2，均取得了高度显著的体内抗肿瘤效果（图第二版). 这些结果表明，TRAIL-R激动剂与CDK9-抑制药物联合治疗PDAC可能比目前对此类癌症的一线治疗更有效。

TRAIL–CDK9i在体内诱导显著的抗肿瘤治疗效果，但不会引起全身毒性

除了对新型癌症治疗方法的临床前体内疗效进行评估外，确定其可能诱导的潜在毒性对于评估其临床适用性至关重要，尤其是当涉及死亡配体家族成员时[20,21,41,42]. 因此，我们接下来评估了mTRAIL–CDK9i组合的治疗效果和潜在毒性。为此，我们皮内注射来源于KP小鼠（Kras）的小鼠NSCLC细胞^{LSL-G12D/重量}; 第53页^前/后)（补充图3a年)移植到受体同基因小鼠中，在肿瘤形成后（补充图3亿)，连续两周每隔一天用载体或mTRAIL和/或dinacilib对荷瘤小鼠进行系统治疗（图3a年). 这表明，小鼠对mTRAIL与dinacilib的联合耐受性良好，因为我们无法观察到体重的变化（图3亿)治疗组之间血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平无显著差异（图3立方厘米). 值得注意的是，虽然用mTRAIL或dinacilib进行单药治疗实际上是无效的（图三维)，mTRAIL与地那昔布联用取得了显著的抗肿瘤效果（图三维). 因此，我们得出结论，联合TRAIL-R激动剂和CDK9抑制药物的治疗可以在体内实现高抗癌疗效，重要的是不会引起可检测的不良事件。

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图3

TRAIL和CDK9i联合治疗耐受性良好，并在体内发挥治疗作用。

一实验方案：皮下注射0.5×10后7天，腹腔注射iz-mTRAIL（5 mg/kg）和/或dinacilib（30 mg/kg）或200µl缓冲液⁶KP单元。b条从基线检查到给药结束后1周，每周测量一次携带KP小鼠的平均体重。c（c）最后一次给药24小时后的血清ALT值。d日显示了单个KP肿瘤的生长曲线（左图）和第25天的肿瘤体积定量（右图）。点代表单个老鼠(n个 = 每组5人）。误差线代表平均值±SEM。e（电子）实验方案：严重联合免疫缺陷（Scid）小鼠注射2×10⁶A549细胞稳定表达萤光素酶进入侧尾静脉。肿瘤接种7天后，用iz-huTRAIL（5 mg/kg）和/或dinaciclib（30 mg/kg）或200µl缓冲液对小鼠进行连续4天的腹腔注射治疗。（f）28天后通过生物发光成像评估肿瘤负担。点代表单个老鼠(n个 = 每组11人）。误差线代表平均值±SEM。

为了进一步评估TRAIL–CDK9i在体内的疗效，我们将荧光素酶表达的A549细胞（A549-luc第三版和补充图3立方厘米). 而TRAIL–CDK9i治疗在第28天实现了肺部肿瘤的完全消退（图3英尺和补充图三维)，这并不是TRAIL或CDK9i单独治疗的情况，这进一步支持了该治疗组合在体内的高协同作用和疗效。

TRAIL–CDK9i在杀伤化疗和靶向治疗耐药癌细胞方面非常有效，与耐药因子无关

对不同癌症治疗方式的获得性耐药性，包括对化疗、放疗或靶向治疗，以及最近对免疫检查站的封锁，仍然是有效癌症治疗的主要障碍[6,43]. 因此，要想显著提高癌症患者的生存率，就需要确定治疗策略，以便在可能的情况下，同时克服或绕过目前对上述多种治疗方式产生耐药性的主要僵局。受到迄今为止TRAIL–CDK9i的结果的鼓舞，包括内在化疗耐药PDAC（图2a–e)下一步，我们询问这种联合疗法是否有机会有效杀死对当前疗法耐药的癌症，如果有，这种疗法的适用范围有多广。为了解决这个问题，我们从几个不同的癌症实体中产生了对治疗有抵抗力的癌症细胞系。尽管其中一些细胞系对化疗具有耐药性，但其他细胞系对各种不同类型的靶向治疗具有耐药性。

为了评估TRAIL–CDK9i协同杀伤化疗耐药细胞的能力，我们建立了人PDAC细胞系Panc89的吉西他滨耐药变体（补充图第4页). 耐吉西他滨的Panc89细胞保持了亲本Panc89对TRAIL–CDK9i的高度敏感性，而TRAIL和CDK9i-单独对癌细胞存活没有任何显著影响（图第4页). 值得注意的是，TRAIL–CDK9i也显著降低了Panc89细胞的克隆形成能力。有趣的是，这与吉西他滨的敏感性或耐药性无关，这意味着TRAIL–CDK9i有效地干扰克隆的存活，即使克隆已经进化为对吉西他宾产生耐药性（图4b个). 为了评估TRAIL–CDK9i是否也能有效杀伤对索拉非尼耐药的细胞，索拉非尼布是一种用于肝癌一线治疗的靶向治疗药物，我们接下来衍生出索拉非宁耐药的Huh7肝癌细胞（补充图4b个). 同样，TRAIL–CDK9i高效地杀死了亲代和索拉非尼耐药的Huh7细胞（图4c、d).

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图4

TRAIL–CDK9i协同杀伤化疗和靶向治疗耐药细胞。

a、 b条对吉西他滨敏感或耐药的胰腺癌细胞和c（c）,d日将索拉非尼敏感或耐药的肝细胞癌细胞与二甲基亚砜（DMSO）或迪那昔布（25 nM）预先孵育1 h，然后用指定浓度的iz-huTRAIL处理。24小时后对细胞活力进行量化（左侧面板）。7天后，通过结晶紫染色观察长期存活率（右侧面板）。e–j化疗和靶向治疗敏感与耐药黑色素瘤细胞的治疗：达布苯尼敏感与耐药(e（电子）和小时)，曲美替尼敏感和耐药(（f）和我)以及对顺铂敏感和耐药(克和j个)将黑色素瘤细胞与DMSO或dinaciclib（25nM）预孵育1小时，随后用所示浓度的iz-huTRAIL处理。24小时后对细胞活力进行量化（左侧面板）。数据为平均值±SEM，n个 ≥ 3.通过结晶紫染色观察7天后的长期存活情况（右侧面板）。显示了三个独立实验中的一个代表。

尽管在过去的十年中，各种新形式的靶向治疗以及免疫检查点封锁已被添加到黑色素瘤治疗的临床设备中，但黑色素瘤仍是一种难以治疗的癌症，尤其是因为对这些新的治疗方法产生耐药性已经成为目前治疗这种恶性肿瘤的主要临床挑战[44]. 因此，我们接下来测试了TRAIL–CDK9i是否能够杀死对化疗或靶向治疗产生耐药性的黑色素瘤细胞，以及是否有这种效果，如果我们观察到的话，取决于耐药因子的性质。使用BRAF抑制剂达布雷尼、MEK抑制剂曲美替尼和化疗药物顺铂，我们首先获得了一组黑色素瘤细胞系，这些细胞系分别对这三种疗法产生了耐药性（补充图4c、d). 随后，我们用TRAIL、CDK9i或TRAIL–CDK9i-组合治疗这些细胞系及其相应的治疗敏感性亲代对应物。值得注意的是，只有TRAIL–CDK9i，而不是TRAIL或CDK9i单独，在杀死所有父母以及所有测试的抗治疗黑素瘤细胞系方面都非常有效，重要的是，无论这两种细胞系的性质如何，它们各自的致癌驱动突变以及各自获得的化疗或靶向治疗耐药性（图4e-g). 在检查联合治疗对这些黑色素瘤细胞克隆存活的影响时，我们观察到TRAIL–CDK9i完全抑制了治疗敏感和耐药黑色素瘤的克隆生长能力（图4h-j小时). 因此，我们得出结论，TRAIL受体激动剂与CDK9抑制药物的联合可能成为对现有治疗产生耐药性的各种癌症的有效治疗方法。

TRAIL–CDK9i联合治疗增加癌细胞的凋亡启动

接下来，我们旨在揭示TRAIL–CDK9i在化疗或靶向治疗耐药的黑色素瘤细胞中诱导凋亡的机制。为此，我们采用了动态BH3谱分析，该谱分析可确定线粒体“启动”水平的促凋亡信号的早期变化，以响应癌症细胞中不同的凋亡刺激，从而预测特定治疗的细胞毒能力[45]. 增加BH3-only蛋白Bim（0.1–3.0μM）的Bcl-2同源域3（BH3）肽的浓度表明，化疗耐药和靶向治疗耐药黑色素瘤细胞的基本启动状态没有显著差异（图第5页和补充图5a–c级). 然而，当用化疗或靶向治疗药物治疗时，耐药细胞系需要浓度至少为1μM的Bim肽来实现凋亡启动，而在敏感的对应物中，在100-300 nM时，凋亡启动已经很明显（图第5页和补充图5a–c级). 相比之下，TRAIL–CDK9i显著增强了线粒体去极化，即使在所有六种黑色素瘤细胞系中都没有外源性添加Bim肽的情况下也能显著实现去极化，这三种细胞系代表了三种化疗/靶向治疗敏感和耐药黑色素瘤的细胞系对（图第5页和补充图5a–c级). 这些结果表明，TRAIL与CDK9i结合能够显著降低癌细胞的凋亡阈值，重要的是，包括耐药癌细胞。

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图5

TRAIL–CDK9i组合致敏的分子机制。

一在曲美替尼（10 nM）治疗48小时或联用迪那西布利（25 nM）和TRAIL（10 ng/ml）治疗12小时后，对曲美替尼敏感和耐药的SKmel2细胞进行动态BH3分析。采用不同浓度（0.1–3.0μM）的Bim-衍生BH3-only肽评估线粒体凋亡启动状态。结果表示为Δ%启动（与未处理细胞相比启动增加）。数据为平均值±SEM，n个 ≥ 三。b条曲美替尼敏感和耐药SKmel2细胞用曲美替尼特（10 nM）或替那昔布（25 nM）处理指定时间。细胞被裂解，并用针对所示抗原的抗体进行免疫印迹。显示了两个独立实验中的一个代表。星号表示未指定的带。c（c）将SKmel2细胞与二甲基亚砜或二萘西利（25 nM）预孵育1 h，然后用所示浓度的iz-huTRAIL处理。24小时后对细胞活力进行量化（左侧面板）。数据为平均值±SEM，n个 ≥ 3.用DMSO或dinacilib（25 nM）预处理SKmel2细胞4 h，然后用iz-huTRAIL（10 ng/ml）刺激6 h。细胞被裂解并进行western blotting。显示了两个独立实验的一个代表（右面板）。d日将HT29细胞与二甲基亚砜或替尼昔布（25 nM）预孵育1 h，然后用所示浓度的iz-huTRAIL处理。24小时后对细胞活力进行量化（左侧面板）。数据为平均值±SEM，n个 ≥ 3.用二甲基亚砜（DMSO）或替那昔布（25 nM）预处理HT29细胞3 h，然后用iz-huTRAIL（10 ng/ml）刺激指定时间。对细胞进行裂解并进行western印迹（右侧）。显示了两个独立实验中的一个代表。e（电子）HCT-116野生型（WT），HCT-116-Bax^−/−，HCT-116烘焙^−/−或HCT-116 Bax^−/−贝克^−/−细胞用二甲基亚砜（DMSO）或替那昔布（25 nM）预孵育1 h，然后用所示浓度的iz-huTRAIL处理。24小时后对细胞活力进行定量（左图）。数据为平均值±SEM，n个 ≥ 3.显示了击倒效率的代表性western印迹（右侧面板）。

我们之前表明，cFLIP和Mcl-1的下调是CDK9i介导的TRAIL诱导细胞凋亡敏化所必需的[35]. 因此，我们接下来分析了TRAIL凋亡途径中不同抗凋亡成分在治疗敏感和耐药肿瘤细胞中的表达水平。这表明，CDK9i不仅在治疗敏感的黑色素瘤细胞中有效地抑制了Mcl-1和cFLIP的水平，而且重要的是，在治疗耐药的黑色素细胞中也有效地抑制Mcl-1与cFLIP水平（图5亿和补充图6a-b类). 此外，虽然cFLIP和Mcl-1的下调很容易发生在caspase-8缺陷的癌细胞中，但caspase-8的缺失完全阻止了促凋亡tBid、裂解多聚腺苷核糖聚合酶（PARP）和裂解caspase-3依赖TRAIL的出现，从而使这些细胞对TRAIL–CDK9i诱导的凋亡产生抵抗（图5c天). 此外，通过缺失Bax和/或Bak抑制线粒体凋亡途径的激活，也使癌细胞对CDK9i介导的TRAIL诱导的细胞死亡敏化产生抵抗（图第五版). 总之，这些结果表明，CDK9i介导的TRAIL增敏依赖于抗凋亡因子cFLIP和Mcl-1的下调以及caspase-8和Bax/Bak的活性。

细胞系

人类肺腺癌细胞系Calu-1、H460和H322由J.Downward善意提供，A549-luc细胞购自Caliper Life Science，并在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI（Gibco™，Thermo Fisher Scientific）中培养。Colo357细胞由Bak HCT116野生型A.Trauzold善意提供^-/-，Bax^-/-和Bax^-/-贝克^-/-细胞由A.J.GarcíA-Sáez，HT29 Caspase-8善意提供^-/-由M.Pasparakis善意提供，所有细胞在补充有10%FCS的DMEM（Gibco™，Thermo Fisher Scientific）中培养。所有卵巢癌细胞系均在添加10%FCS和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺（10000 U/ml，Gibco™，Thermo Fisher Scientific）的RPMI 1640中培养。HeLa、MDA-MB 231和所有人肝癌和胰腺癌细胞在添加10%FCS的DMEM中培养。从Gibco/Invitrogen（英国佩斯利）购买原代人肝细胞，并按照制造商的说明进行培养。黑色素瘤细胞系在添加10%FCS的RPMI 1640中培养。耐药细胞系是通过使用指定药物持续治疗至少6个月而产生的。根据MycoAlert公司™支原体检测试剂盒（LONZA）。原代PDAC细胞系609和1157由A.Liss善意提供，之前是从手术切除的PDAC衍生的异种移植瘤中建立的[53]. 细胞系在补充有10%胎牛血清（Biochrom，Merck）和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中培养，培养温度为37°C和5%CO₂.

胰腺肿瘤细胞分离和类器官培养

KPCY类有机物源自于年开发的PDACKRas公司^{LSL-G12D/重量}; 第53页^前/后; Pdx-Cre；Rosa26-LSL-YFP公司KPC类有机物来源于PDAC以克拉为单位^{LSL-G12D/重量}; P53基因 ^{LSL-R172H/重量}; Pdx-Cre公司简单地说，对PDAC肿瘤进行了解剖，并按照所述进行了细胞分离[54]进行了一些修改。将切除的肿瘤立即放入5ml冷G溶液中，并置于冰上。机械分离后，将组织转移到50 ml Falcon中，加入15 ml胶原酶V（DMEM中的1 mg/ml加上1%[V/V]青霉素/链霉素[10000 U/ml，无FCS]），并在37°C水浴中培养20分钟。为了钝化消化，添加15毫升冰镇G溶液。细胞相关PDAC在300×克以低减速持续5min，丢弃上清液，并在室温下将颗粒在胰蛋白酶-EDTA中培养5min。为了停止反应，加入2ml大豆胰蛋白酶抑制剂，然后加入15ml冰镇G溶液，在300×克将颗粒重新悬浮在含有2%（v/v）FCS的10 ml PBS中，并通过70μm过滤器。将细胞接种在生长因子诱导的基质中，使其生长为所述的三维有序培养物[55].

抑制剂和抗体

除非图或图图例中另有规定，否则以下抑制剂在所示的最终体外浓度下使用：Dinaciclib（Selleck Chemicals Cat#S2768，25µM，100µM）、NVP-2（25µM，100μM，）、zVAD-fmk（Abcam Cat#ab120382，20µM。使用了针对以下抗原的抗体：RNA-Pol II、pSer2（Thermo Fisher Scientific Cat#A300-654A-M；BioLegend Cat#920204）、RNA Pol II RPB1（BioLenged Cat#664906）、cFLIP（Enzo Life Sciences Cat#ALX-804-961-0100；AdipoGen Cat#AG-20B-0056）、Caspase‐8（Enzo-Life Scences Cat#ADI-AAM-118-E）、cIAP（R and D Systems Cat#MAB3400）、，FADD（BD Biosciences Cat#556402）、胱天蛋白酶-3（R and D Systems Cat#AF-605-NA）、裂解的胱天蛋白酶-3（细胞信号传导Cat#9429）、β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich Cat#A5441）、GAPDH（Sigma-Aldrich Cat#G9545）、Bid（细胞信号传导技术Cat#2002）、Bak（细胞信号传导技术Cat#3814）、Bax（细胞信号传导技术Cat#5023），Mcl-1（细胞信号技术分类号5453）、Bcl-2（圣克鲁斯生物技术分类号sc-7382）、Bcl-xL（细胞信号发送技术分类号2764）、XIAP（细胞信号传递技术分类号2042）、PARP（BD生物科学分类号556362）、CDK1（细胞信号发挥技术分类号77055）、CDK2（细胞信号传输技术分类号2546）、CDK 5（细胞信号传送技术分类号12134）和CDK9（小区信令技术类别号2316）。

RNA干扰

从Dharmacon购买了siRNA库（ON-TARGET plus），其中包含针对每个感兴趣基因的四个不同siRNA序列。根据制造商的说明，使用Dharmafect试剂转染细胞。细胞转染后48小时或72小时用于进一步分析。在每个实验中，通过western印迹法评估敲除效率。

细胞活力和细胞死亡分析

根据制造商的说明，使用Cell Titer Glo分析（Promega Cat#G7571）测定细胞活力。作为细胞死亡的直接测量，在实验前一天将细胞接种在96孔板的每孔10000个细胞。第二天，用指示的抑制剂对细胞进行预处理，并在5µM SYTOX®Green（Thermofisher Cat#S7020）的存在下用重组iz-huTRAIL（0.1 ng/ml-10 ng/ml）或iz-mTRAIL（1000 ng/ml）处理。使用IncuCyte FLR通过荧光信号在指定时间内实时成像死亡细胞，时间间隔为1小时或2小时。计算细胞死亡百分比，计算SYTOX®绿色阳性细胞数/孔。

克隆形成试验

为了分析长期存活率（克隆形成试验），将细胞接种到6孔板中。第二天，在添加iz-huTRAIL之前，用二甲基亚砜或地那昔单抗预先培养细胞1小时。24小时后，将死亡细胞洗掉，存活细胞在新鲜培养基中再培养6天，无需任何处理。7天后，用PBS洗涤细胞两次，用甲醇/乙酸3:1（体积/体积）溶液在室温下固定10分钟，并用结晶紫（0.5%在20%甲醇中）染色。

BH3动态剖面

简言之，3×10⁵将细胞置于6孔板孔中，用TRAIL–CDK9i处理12小时，或用指示的化学或靶向治疗药物处理48小时。随后将细胞胰蛋白酶化，并用1×10⁶细胞/ml用于BH3动态剖面分析。使用Bim衍生的仅BH3肽（Ac-MRPEIWAQELRRIGDEFNA酰胺）来评估启动状态。Bim肽在MEB缓冲液（150 mM甘露醇、10 mM HEPEs-KOH pH 7.5、50 mM KCL、0.02 mM EGTA、0.02 M M EDTA、0.1%BSA、5 mM琥珀酸）中稀释，并以（0、）0,1、0,3 1和3μM的浓度使用。细胞在进一步含有20 mg/ml寡霉素、50 mg/ml洋地黄素、100 mM JC-1、5 M 2-巯基乙醇的MEB缓冲液中稀释。AUC值是通过使用TECAN平板读取器M1000在545-560 nM的激发下测量JC-1化合物的相对荧光及其在590 nM下的发射来获得的。

蛋白质印迹分析

按照指示处理细胞，然后在裂解缓冲液中进行裂解（30 mM Tris-HCl[pH7.4]、150 mM NaCl、2 mM EDTA、2 mM-KCl、10%甘油、1%Triton X-100、1×COMPLETE蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche Cat#5056489001））。使用4–15%Mini-或Midi-PROTEAN®-TGXTM-gels（BioRad Cat#4561086，Cat#5671085）和Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液分离蛋白质。使用BioRad的Trans-Blot®Turbo™转移系统将蛋白质转移到Mini-或Midi-0.2µm硝化纤维素膜上（BioRad-转移包，产品目录号1704158，产品目录编号1704159）。如图所示，用抗体检测蛋白质。用50 mM甘氨酸（pH 2.3）剥离膜，然后用其他抗体进行再防护。

肿瘤挑战与治疗

初步数据显示，组大小≥5足以达到统计显著性。然而，更多的小鼠被纳入，并可靠地再现了相同的结果。根据肿瘤光子通量值或肿瘤大小（mm）将小鼠随机分为治疗组^三).

研究批准：动物福利

所有小鼠均被饲养在单独通风的笼子（IVC）中，Scid米黄色根据相关动物许可证下的机构指南，小鼠接受高压灭菌食品、水和床上用品。根据修订后的（2013）《动物（科学程序）法案》（ASPA）和英国伦敦大学学院癌症研究所的机构指南，所有动物实验均在英国内政部批准的适当动物项目许可证下进行。已获得本研究所需的风险评估。

患者和组织样本

本研究包括1999年1月至2014年10月在乌尔姆大学医院普通和内脏外科接受手术的结直肠癌患者的组织标本。本研究仅包括腺癌患者，排除新辅助治疗或肿瘤复发患者。CDK9表达的比较包括随机选择的20例CRC患者的肿瘤和正常组织。手术切除期间，根据所有患者的知情同意书立即采集样本。本研究获得乌尔姆大学独立地方伦理委员会的许可（批准号：268/2008和235/2015）。

组织定量和免疫组织化学（IHC）

将标本固定在10%福尔马林中过夜，24小时后转移到70%乙醇中。石蜡包埋、切片制备和H&E染色是国家心肺研究所组织学染色服务的一部分。肺部肿瘤负担以肿瘤组织在肺部的百分比进行量化。H&E染色由一位经验丰富的病理学家（M.A.El-Bahrawy）进行检查和量化，他对该研究一无所知。

对于IHC，通过将载玻片穿过二甲苯并降低酒精等级，然后用水冲洗，对4µm厚的切片进行脱蜡和再水化。将载玻片在95°C的10 mM柠檬酸钠（pH 6.2）中孵育15分钟，进行热介导抗原回收。用1.6%的H灭活内源过氧化物酶₂O（运行）₂持续10分钟，然后在室温下用1%的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich Cat#A7030）、5%的正常驴血清（EMD-Millipore Cat#S30）和0.4%的Triton X-100（Sigma Aldrich Cat#9002-93-1）稀释在PBS中进行表位封闭1小时。在4°C，然后在室温下与生物素结合抗体二次孵育45分钟，或用荧光结合抗体孵育2分钟h.使用亲和素-生物素复合物（ABC）溶液（Vectastain ABC试剂盒，类别号LS-J1018）获得IHC信号，并使用来自Vector（类别号SK-4100）的过氧化物酶底物试剂盒3,3-二氨基联苯胺（DAB）进行开发。IHC载玻片用迈尔苏木精复染。使用的抗体包括：Ck19（DSHB Cat#TROMA-III）。

为了分析CDK9在正常组织和结肠癌组织中的表达，首先在二甲苯中脱去相应组织的石蜡，然后通过分级乙醇进行再水化。使用压力锅在微波炉（450 W加热15分钟，然后270 W加热10分钟）中，在pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液（BioGenex Cat#C7915-010）中加热切片。用过氧化物酶溶液（DAKO产品目录号S202386-2）封闭切片。CDK9抗体（细胞信号技术类别2316）稀释为1:150。使用Simple Stain N-Histofine®MAX PO兔子（Nichirei Corporation Cat#414141 F）进行抗原检测。可视化是通过使用来自（Vector Cat#SK-4100）的DAB实现的。为了进行复染，使用了迈尔的hemalaun（默克产品目录号109249）。

阿尔西安蓝/碘酸希夫

为了检测粘液结构，根据制造商的说明进行了阿尔西安蓝/周期性酸-希夫（AB/PAS）（Abcam Cat#ab150680）染色。

非小细胞肺癌患者CDK9蛋白表达分析

CDK9蛋白强度数据来自[56]. 采用化学蛋白质组学方法捕获Kinobeads激酶（γ版本），并用无标签质谱法在14例NSCLC患者的配对正常组织和肿瘤组织中量化其丰度。对每个样品获得的两个技术重复进行平均，并使用成对的t吨测试。

我们分别感谢T.Jacks和D.Tuveson提供的KP和KPC鼠标模型。我们还感谢J.Downward、S.W.Lowe、B.Vogelstein和A.Trauzold提供细胞系和试剂，感谢A.Daboh帮助进行基因分型，感谢S.Surinova帮助评估肺癌患者的CDK9蛋白强度数据。