富G序列因子1作为脓毒症患者的预后生物标志物

CLP诱导的脓毒症小鼠

雌性C57BL/6J小鼠取自南通大学实验动物中心，年龄6-8周，体重约22g。建立小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型。将小鼠随机分为假手术组和脓毒症组（n=6）。在手术前，通过腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）对小鼠进行麻醉。做一个中线剖腹手术切口（1-2厘米）以暴露盲肠。然后，结扎50%的盲肠，用18号针头打出一个孔。接下来，在腹腔内更换盲肠，并闭合切口。假手术组进行了类似的手术，没有结扎或穿孔。每8小时对小鼠进行一次存活分析。所有动物实验均按照国家卫生研究所《实验动物护理和使用指南》进行。动物实验由南通大学附属医院伦理委员会批准。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离纯化

小鼠购自南通大学实验动物中心，并根据标准方案进行饲养。为了从小鼠腹膜中分离和纯化巨噬细胞，在采集前将1 mL 6%淀粉肉汤注入腹膜。2-3天后，对小鼠实施安乐死，并用75%酒精对其腹部进行消毒。用剪刀切开小鼠腹膜外层，腹腔内注射10mL冷磷酸盐缓冲液（PBS）以清洗腹腔巨噬细胞。注射PBS后，轻轻按摩腹膜，使附着在液体中的细胞脱落。用无菌吸管将PBS从腹膜收集到15 mL试管中，并在1000×g下离心5 min。离心后，去除上清液，将细胞培养在RPMI-1640中，并与100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和10%胎牛血清[（FBS）；目录号E600001；Sangon Biotech，中国上海]，37°C和5%CO₂将细胞接种到6孔板（1×10⁶细胞/孔）并培养过夜。用温热的PBS轻轻清洗非粘附细胞3次。完成上述实验步骤后，约90%的纯巨噬细胞用于实验。

LPS刺激

将小鼠腹腔巨噬细胞接种到6孔板（1×10⁶细胞/孔），并用100 ng/mL大肠杆菌LPS（InvivoGen，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）刺激2、4、8、16和24小时。未经LPS刺激的细胞作为对照组。约5×10⁵将每个孔的细胞接种在6孔板中，然后用100 ng/mL LPS刺激2、4、8、16和24小时。未经LPS处理的细胞作为对照组。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

使用TRIzol™试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从巨噬细胞或组织中提取总RNA。HiScript（HiScript）^®II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，中国南京）购买用于RT-PCR，并根据制造商进行。使用StepOnePlus qPCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）将得到的互补DNA（cDNA）用于qPCR检测。使用ΔΔCT方法对靶基因表达进行定量评估。GRSF1的表达被归一化为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的表达。引物序列见表1。

蛋白质印迹

用放射免疫沉淀法（RIPA）结合蛋白酶抑制剂（ab65621，Abcam，Burlingame，USA）和100μM苯甲基磺酰氟（PMSF）（#P7626，Sigma）制备组织（50 mg）。均质后，将混合物在冰上培养30分钟。收集上清液，然后在4°C下14000 g离心10分钟。使用DC Bradford分析试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量蛋白质浓度。蛋白质（200 ng）在8-12%三甘氨酸凝胶（Sangon Biotech）中进行电泳，并电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Thermo Fisher Scientific）上。为了消除非特异性蛋白质结合的影响，在室温下用5%的脱脂奶封闭膜，将其溶解在0.05%的三缓冲盐水和吐温20（TBST）中，至少保持1小时。在4°C下，用抗GRSF1（1:1000；Abcam）和β-肌动蛋白（1:4000；Abcan）的一级抗体孵育膜过夜。在与二级抗体（Thermo Fisher Scientific）孵育后，通过电化学发光（ECL）或ECL引物通过Bio-Rad Gel Doc XR+（Bio-Read）观察蛋白质印迹信号。使用ImageJ v1.47软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）对条纹密度进行标准化。

GRSF1表达与脓毒症患者临床特征的相关性

考虑到脓毒症患者的所有临床特征，令人惊讶的是，GRSF1的表达与APACHE II评分和SOFA评分呈负相关(表4, 图2 A,B类). 相反，身高、体重、年龄、WBC和CRP与GRSF1的表达无关。GRSF1低表达组的APACHE II评分显著高于GRSF1高表达组(图2C). GRSF1低表达组的SOFA评分显著高于GRSF1高表达组(图2D). 因此，GRSF1的表达可能与脓毒症的严重程度负相关。

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图2

GRSF1相对表达与SOFA评分和APACHE II评分的相关性。（A） GRSF1的相对表达与APACHE II评分呈负相关（r=-0.472，P=0.011）。（B） GRSF1的相对表达与SOFA评分呈负相关（r=-0.465，P=0.013）。（C） GRSF1低表达组和GRSF1高表达组的APACHE II评分比较。（D） GRSF1低表达组和GRSF1高表达组的SOFA评分比较***P<0.001 GRSF1，富G序列因子1；SOFA，序贯器官衰竭评估；APACHE II评分：急性生理学和慢性健康评估II。

GRSF1在脓毒症患者中表达的预后价值

分析GRSF1低表达组和GRSF1高表达组患者28天生存率，以了解脓毒症患者外周血GRSF1表达与脓毒症预后的关系。GRSF1低表达组患者的28天生存率显著低于GRSF1高表达组患者(图3A). 结果表明，GRSF1低表达组的存活率为62.9%，而GRSF1高表达组的生存率为84.1%。结合GRSF1的表达和28天生存率进行ROC曲线分析。结果表明，GRSF1对脓毒症患者28天生存率有一定的预测能力（AUC=0.688，P=0.040）。同时，根据ROC曲线分析SOFA评分、APACHE II评分和28天生存率(图3B). 根据28天生存率的分析，提示脓毒症患者外周血GRSF1的表达对早期诊断具有重要价值。

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图3

GRSF1在脓毒症患者中的预后价值。（A） GRSF1低表达组与GRSF1高表达组生存率的比较。（B） ROC曲线分析：GRSF1、SOFA评分、APACHE II评分的表达与28天生存率。GRSF1:AUC=0.81，P=0.038，灵敏度=74.1%，特异性=78.6%；SOFA评分：AUC=0.26，P=0.045，敏感性=3.7%，特异性=85.7%；APACHE II评分：AUC=0.16，P=0.034，敏感性=3.6%，特异性=78.6%。GRSF1，富G序列因子1；SOFA，顺序器官衰竭评估；APACHE II评分，急性生理学和慢性健康评估II。

LPS刺激后GRSF1在RAW 264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中的表达

我们旨在探讨GRSF1在LPS刺激的巨噬细胞炎症反应中的作用。首先，在RAW 264.7细胞中用100 ng/mL LPS刺激指定时间，然后我们检测GRSF1的表达。在mRNA水平上，GRSF1在8小时时显著增加，然后在24小时内逐渐降低至正常水平(图4A). 在蛋白质分析中，GRSF1在8和16小时时增加(图4B、C). 此外，我们还分析了相同条件下小鼠腹腔巨噬细胞中GRSF1的表达。GRSF1 mRNA水平在4和8小时时升高，然后在24小时内略有下降(图4D). GRSF1蛋白水平在4和8小时时增加(图4E，F)。

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图4

LPS刺激的RAW 264.7细胞中GRSF1的表达。用100 ng/mL LPS刺激RAW 264.7细胞：（A，D）mRNA水平，用qRT-PCR测定GRSF1；蛋白质分析中，GRSF1通过western blotting测定，β-actin作为内部对照。结果显示为平均值±SD（n=3）。用Student’st吨-测试*P<0.05，**P<0.01。GRSF1，富G序列因子1；脂多糖；qRT-PCR，实时定量聚合酶链反应；mRNA、信使RNA；SD，标准偏差。

GRSF1在CLP模型脓毒症不同器官中的表达

为了评估GRSF1在脓毒症中的作用，我们对小鼠进行了CLP手术以诱导脓毒症。手术是按照协议进行的(20). 我们通过使用从小鼠心脏、肝脏、肺和肾脏提取的RNA对GRSF1进行qPCR来评估这一点(图5A、B、C、D)，但差异无统计学意义。

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图5

GRSF1在CLP小鼠器官中的表达。用qRT-PCR定量分析CLP小鼠（A，B，C，D）GRSF1 mRNA表达水平。结果显示为平均值±SD。P值用Student t检验进行检验。GRSF1，富G序列因子1；盲肠结扎穿孔；实时定量聚合酶链式反应；mRNA、信使RNA；SD，标准偏差。ns，无显著性。

作者感谢南通大学附属医院的专家技术援助和统计分析支持。这份手稿已被所有作者批准出版。

基金：本研究获得了中国青年基金会国家自然科学基金（81801893）和南通临床医学研究中心（HS2019005和HS2020001）以及南通科学项目（MS12020006和MS12020017）的资助。