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Front Bioeng生物技术公司。2021; 9: 622617.
2021年2月15日在线发布。 数字对象标识：10.3389/fbioe.2021.622617年
预防性维修识别码：项目管理委员会7928390
PMID：33681159

天然血管支架治疗促进大鼠动静脉瘘形成过程中的体外重塑

燕廷秀,1,2,* 何玉霞,1 杰森·C·S·特伊,1 玛丽娜·克尼舍娃,1 布雷克安德森,三和Katalin Kauser公司三
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摘要

建立后，动静脉瘘（AVF）在用于血液透析之前必须成熟（即扩大管腔以允许高血流量）。AVF成熟失败率很高，目前还没有有效的治疗方法来治疗这个问题。成熟过程可能受到血管细胞外基质（ECM）完整性的影响。天然血管支架治疗（NVS）是一项新技术，通过局部传递的小分子（4-氨基-1,8-萘甲酰胺）的光活化将胶原蛋白和弹性蛋白连接起来。我们假设NVS疗法可以通过保持ECM的完整性来改善AVF重塑。在Wistar雄性大鼠中，通过连接同一肢体的股静脉（端）和股动脉（侧）来创建AVF。在通过动脉压力恢复血流以扩张股静脉后，立即在吻合口周围滴入10μl的NVS化合物（2 mg/ml）。孵育5分钟后，NVS处理区用450纳米光照射1分钟。对照组接受10μl滴磷酸盐缓冲液（PBS）和相同的光活化。皮肤被封闭，大鼠被安乐死4周(n个=每组6–9个）AVF生成后组织学、形态计量学、免疫组织化学（IHC）和多光子显微镜用于胶原纤维的二次谐波评估。两组的血管厚度相似。NVS治疗组大鼠的AVF静脉开放管腔面积和开放管腔%面积显著大于PBS治疗组（4.2倍第页=0.014和2倍第页分别为0.009）。与PBS组相比，NVS组AVF壁中的炎症标记物IL-6和MMP-9显著降低。在NVS治疗的AVF中，血管壁中的胶原纤维趋向于与管腔周长垂直排列，与PBS治疗的AVFs相比，其形状更明确，但面积更小。这些结果表明，NVS治疗引起胶原蛋白的变化，这可能会影响AVF的成熟。大鼠对NVS治疗耐受性良好，细胞培养实验证实了该治疗不会导致细胞死亡。这些结果表明，NVS治疗是安全的，并且可能通过促进管腔扩张来提高患者AVF成熟度而具有治疗潜力。

关键词：动静脉瘘、细胞外基质、新生内膜形成、管腔扩张、透析、局部给药、光活化

介绍

功能性血管通路是血液透析患者的生命线。临床实践指南选择动静脉瘘（AVF）作为首选血管通路，为终末期肾病（ESKD）患者提供充分有效的血液透析治疗(Lok等人，2020年). 新产生的AVF需要成熟（即，生长到有足够大的管腔来输送足够高的血流量）才能用于透析。在观察性研究中，AVF成熟失败率范围为20%至60%(Cheung等人，2017年). AVF成熟失败的高发生率最近促使对以前的指南进行重新评估(Lok等人，2020年). AVF成熟失败，加上ESKD人群的快速增长，导致医疗成本增加(Lee，2017年). 目前，还没有可用于提高AVF成熟度的治疗方法，而可靠的AVF成熟表示尚未满足医疗需求。

在AVF成熟过程中，为了响应动脉血流引起的壁切应力和壁张力的增加，静脉壁经历适应性管腔扩张和中层增厚，以适应变化的血流动力学力。AVF成功成熟的理想结果是通过向外重塑及时充分动脉化静脉(胡等，2016). 由于血管平滑肌细胞增殖，向外重塑需要血管壁增厚外部静脉血管壁的内部弹性板（IEL），而不是里面可能导致新生内膜增生形成和管腔直径减小的IEL（即向内重塑）(胡等，2016). 当内向重塑比外向重塑更占优势时，AVF成熟失败，因此静脉变得狭窄。另一方面，如果静脉过度扩张并成为动脉瘤，则向外重塑过程可能会有问题。所涉及的分子机制很复杂(Gorecka等人，2019年;Shiu等人，2019年;Lawson等人，2020年).

血管细胞外基质（ECM）成分及其调节因子在健康和疾病中的血管重塑中发挥着重要作用。然而，目前尚不清楚ECM靶向治疗是否可以促进AVF成熟。天然血管支架（NVS）是一种新型光化学技术，它利用一种小分子化合物（4-氨基-1,8萘甲酰亚胺），在450 nm光的激活下，促进反应，在血管壁ECM蛋白质的氨基酸之间形成共价结合。这种局部治疗大约需要5-6分钟。它会使血管壁的胶原蛋白和弹性蛋白纤维交联，从而为血管壁建立一个结构稳定但仍有弹性的支撑框架。这项技术以前已经在猪颈动脉中显示，可以在不增加血管硬度的情况下保持血管的自然完整性(Mogharrabi等人，2019年)减少球囊血管成形术引起的过度拉伸损伤(Munger等人，2016年). NVS疗法已经在临床试验中，以研究其作为外周动脉闭塞性疾病患者的天然支架的安全性和有效性[NCT04188262号（正在进行）和NCT03148808型（关闭）]。可以想象的是，在AVF产生过程中对静脉应用NVS疗法可以防止血流动力学变化引起的损伤，从而通过ECM介导的机制促进AVF成熟。在本研究中，在一个成熟的AVF大鼠模型中检测了NVS技术对AVF发育的影响(Langer等人，2010年). 我们研究了ECM蛋白光化学连接在AVF成熟过程中的潜在益处以及促成这种效应的可能机制。

材料和方法

显微外科手术和NVS治疗

所有研究和实验均由犹他大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照美国国立卫生研究院指南进行。所有手术均在吸入异氟醚麻醉的大鼠上进行（5%诱导和1-5%维持）。10–12个月大的雄性Wistar大鼠（来自Charles River Laboratories）接受了文献中详细描述的左股动脉和静脉AVF手术(Langer等人，2010年). 简单地说，同一肢体的端（静脉）侧（动脉）瘘通过手术连接。取出夹钳后不久，动脉血流和压力填满吻合口的静脉侧，导致静脉扩张。此时，将溶于2 mg/ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的10μl NVS化合物（4-氨基-1,8-萘甲酰胺）滴在吻合口的血管周围，孵育5分钟，使化合物扩散到血管组织中(图1A). 孵育后，小分子处理区用450纳米光源照射1分钟(图1B). 对照组接受10μl滴PBS和相同的光激活。光激活后立即封闭皮肤，然后立即给予丁丙诺啡（0.05–0.1 mg/kg SQ）以缓解疼痛。为了确认我们的NVS和激光治疗方案，在NVS孵育5分钟和激光治疗1分钟后立即处死两只动物，并在450 nm荧光显微镜上观察它们的血管，以激发NVS(图1C).

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AVF的NVS治疗。（A）AVF手术区用NVS溶液孵育5分钟。（B）NVS被450 nm激光激活1分钟。（C）NVS和激光治疗后立即采集的天然血管荧光图像。绿色荧光表明NVS穿透整个吻合区。

组织学组织采集与固定

大鼠在1周时被安乐死(n个=每组3-4人）或4周(n个=每组6-9人）。将AVF血管整块采集，置于缓冲的福尔马林锌溶液中48小时。固定组织包埋在石蜡中，并连续切片于5μm切片中，按照我们之前描述的标准组织学程序进行(Kwon等人，2015年;Shiu等人，2016年;Cho等人，2020年). 切片用苏木精-伊红（H&E）和Verhoeff-Van-Gieson（VVG）染色进行后续形态分析。

免疫组织化学

将五微米厚的未染色福尔马林固定石蜡包埋切片放入一系列二甲苯和乙醇溶液中，以去除石蜡并使样品重新水化。接下来，将它们在柠檬酸缓冲液（pH 6.0，1X稀释，Abcam ab93678 Abcam）中培养10分钟，用于表位检索，并首先在过氧化氢中培养10 min，然后在封闭溶液中培养1 h，以最小化非特异性结合。将处理过的载玻片与抗基质金属蛋白酶（MMP）-2（小鼠单克隆IgG，Abcam ab86607）、MMP-9（小鼠单抗IgG、Abcam ab58803）、白细胞介素（IL）-6（兔多克隆IgG，Abcam-ab6672）或Ki67（小鼠单克隆IgC，Dako M7240）的一级抗体在4℃孵育过夜。抗体的稀释度在1:100和1:1500之间。然后在室温下用适当的生物素化二级抗体（分别为1:200，生物素化山羊抗鼠或抗兔IgG，Vector Laboratories BA-9200或BA-1000）培养切片30分钟。根据制造商指南，使用超灵敏的亲和素-生物素复合物（ABC）过氧化物酶染色试剂盒（ThermoFisher 32050），然后使用金属增强的3,3'二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）底物（1X浓度，ThermoFisher 34065），然后用苏木精复染，使背景呈现蓝色。

图像采集

使用蔡司Axio扫描获取H&E、VVG或IHC染色切片的全玻片明场图像。Z1，在相同的设置下，在犹他大学细胞成像设施。在5倍的低倍率范围和20倍的高倍率范围下采集图像，并在整个幻灯片图像中添加比例尺。

形态计量分析与IHC染色定量

在VVG图像中，使用斐济的徒手选择工具（基于NIH ImageJ的图像处理软件包）描绘了每艘船的IEL1测量IEL封闭区域。使用相同的方法测量开放管腔面积[即管腔内无新生内膜损伤（NL）的面积]。NL面积计算为IEL封闭面积减去开放管腔面积。开放管腔的%面积计算为开放管腔面积除以IEL封闭面积，然后乘以100。

在IHC图像中，斐济的徒手选择工具再次用于描绘整个AVF、AVF动脉肢体和AVF静脉肢体的壁。使用斐济的颜色反褶积插件，以一致的设置分离每个IHC图像中的不同颜色；使用了带有DAB信号的频道。DAB信号随后用阈值功能高亮显示；测量信号的强度（表示为平均灰度值）和染色为阳性的血管壁的%面积。阳性染色面积百分比计算为血管壁中DAB信号的面积除以血管壁的面积，然后乘以100。阴性对照中省略了一级抗体的部分用于减去背景。

胶原纤维的多光子成像

利用Leica SP8 Dive对5μm厚福尔马林固定石蜡包埋切片进行二次谐波成像（SHG），并进行光谱可调检测。分析内侧层胶原纤维的取向与管腔的关系。将每个样本分为4个象限，在每个象限检查中间层；每个象限的检查面积为25μm2使用MIPAR图像软件分析，将相同的图像用于其他胶原形态。2

细胞培养

在体内实验中，观察动物的毒性。我们表演了在体外以细胞死亡作为毒性标记，研究NVS对内皮细胞和血管平滑肌细胞的任何毒性作用。从ATCC（PCS-100-013）中获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），并在添加10%FBS（Hyclone Laboratories Inc.，SH30071.03）和LSGS（GIBCO S-003-10）的培养基200（GIBCO-M-200-500）中培养。人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）购自ATCC（PCS-100-012），并在添加10%FBS（Hyclone Laboratories Inc.，SH30071.03）和SMGS（S-007-25）的培养基231（M231-500）中培养。HUVEC和HASMC在5%CO中保持在37°C2/95%O2大气，用于通道4-8之间。

细胞死亡分析

细胞死亡检测使用罗氏公司（11544675001）和研发系统（4822-96-K）的细胞死亡检测ELISA试剂盒；这两种试剂盒都通过细胞凋亡检测细胞死亡。细胞密度为1×105Roche试剂盒和1×10每个浴缸的细胞数5研发系统套件的96 well板中的每口井。在培养箱中的无血清培养基中，用不同浓度（0、0.25、2.5和25μg/ml）的NVS处理HUVEC和HASMC 5分钟。去除NVS后，用无血清培养基清洗细胞一次，并在每个孔中重新填充200μl无血清培养液。在室温下使用450nm光处理细胞1分钟，然后去除无血清培养基，并用200μl补充有10%血清的培养基重新填充每个孔。在治疗后0、1、2和3天（D0、D1、D2和D3），根据制造商的方案进行细胞死亡测定。阳性对照是用高渗缓冲液培养的细胞（10 mM Tris PH 7.4，400 mM NaCl，10 mM MgCl2)在37°C下保持2小时。

统计分析

GraphPad Prism用于进行非配对参数t检验，以确定PBS治疗组和NVS治疗组之间每个参数的统计显著性，α水平设置为0.05。

结果

AVF的形态计量学：整个AVF、静脉肢体和动脉肢体

PBS组和NVS组静脉的术前IEL封闭区相似(补充图1C32865与31499微米2,第页= 0.954). PBS组和NVS组动脉的术前IEL包绕区也相似(补充图1D9060微米与7613微米2,第页= 0.703). AVF形成后1周，静脉和动脉面积与术前相比显著增加(补充图1)这表明PBS和NVS组的AVF生成手术都很成功。

图2显示整个AVF的典型组织学图像，以及AVF生成后1周和4周静脉肢体的形态计量分析。补充图2显示AVF生成后1周和4周时整个AVF（顶部面板）和动脉肢体（底部面板）的形态计量分析。对四个参数进行形态计量分析：IEL封闭面积、新生内膜病变面积、开放管腔面积和开放管腔%面积。IEL封闭区代表无任何新内膜损伤的最大可能开放管腔面积，因为正常血管的内膜层很薄，只有一层内皮细胞(Alpers等人，2017年). 然后，我们比较了PBS组和NVS组在同一时间点这四个参数的差异。

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AVF吻合。H&E的代表性图片（A、C、E、G）和VVG（B、D、F、H）1周时AVF吻合口的染色（A、B、E、F）和4周（C、D、G、H）来自PBS治疗的动物（A–D）和NVS（东-西）.（I–L）AVF吻合静脉肢体的形态计量学分析。结果表示为平均值±标准误差。N个=第1周每组3-4人。N个=第4周每组6-9人*第页< 0.05. **第页< 0.01. 比例尺=100μm。A、 AVF动脉肢体；五、 AVF静脉肢体；五十、 流明；NL，新生内膜病变。红色和蓝色箭头分别表示动脉和静脉的内部弹性层。

我们首先检查了整个AVF。我们发现，在生成后1周，NVS处理的AVF和PBS处理的AVFs在整个AVF中的这四个参数相似(第页> 0.05). 然而，在4周时，经NVS治疗的AVF显示出更大的IEL封闭区域(补充图2A，1.6倍，第页=0.200），开放管腔面积(补充图2C，2.3倍，第页=0.062）和%开放流明(补充图2D，1.5倍，第页=0.052），尽管趋势在统计学上不显著(第页> 0.05).

接下来，我们在第4周检查了PBS组和NVS组在静脉肢体和动脉肢体上的差异。在第4周的动脉肢体上，四个参数的差异均无统计学意义(补充图2E–H). 然而，NVS组的静脉肢体有4.2倍(第页= 0.014) (图2K)更大的平均开放管腔面积和2.0倍(第页= 0.009) (图2L)尽管两组新生内膜病变面积相似，但平均开放管腔面积百分比大于PBS组(图2J). 这些差异表明，NVS化合物可能通过改善静脉的外向重塑来改善AVF的通畅性。

AVF的免疫组织化学：整个AVF、静脉肢体和动脉肢体

根据形态分析的结果，选择4周时AVF血管中与AVF成熟失败相关的几个分子靶点（即MMP-2、MMP-9、Ki-67和IL-6）的表达水平进行进一步研究。

图3显示典型的IHC图像以及MMP-2和MMP-9分析的定量结果。在整个AVF和动脉肢体中，NVS组MMP-2的表达水平趋向于低于PBS组；然而，就面积染色阳性率而言，NVS组静脉肢体的MMP-2显著低于PBS组(图3F，1.8倍，第页= 0.015). 在整个AVF中，NVS组MMP-9的表达水平趋向于低于PBS组；然而，静脉肢体中的MMP-9(图3H，1.8倍，第页=0.019）和动脉肢体(图3H，2.4倍，第页=0.036）在面积染色阳性百分比方面，NVS组显著低于PBS组。

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MMP分析。MMP-2的典型免疫组织化学图像（A、B）和MMP-9（C、D）PBS治疗动物4周时AVF吻合口的染色（A、C）和NVS（B，D）.（E、G）染色强度的量化（即平均灰度值）。（F、H）染色阳性面积百分比的量化。对整个AVF、静脉肢体和动脉肢体进行分析。结果表示为平均值±标准误差。白色箭头表示阳性染色的示例区域。N个=每组3人*第页< 0.05. 比例尺=100μm。A、 AVF动脉肢体；五、 AVF静脉肢体；五十、 流明；NL，新生内膜病变。

图4显示典型的IHC图像和IL-6分析的定量结果。在静脉肢体，NVS组的IL-6表达水平趋向于低于PBS组。然而，IL-6在整个AVF中(图4C，1.4倍，第页=0.027）和动脉肢体(图4C，1.6倍，第页=0.015）在平均灰度值方面，NVS组显著低于PBS组。

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IL-6分析。IL-6的典型免疫组织化学图像（A、B）PBS治疗动物4周时AVF吻合口的染色（A）和NVS（B）.（C）染色强度的量化（即平均灰度值）。（D）染色阳性面积百分比的量化。对整个AVF、静脉肢体和动脉肢体进行分析。结果表示为平均值±标准误差。N个=每组3人*第页< 0.05. 比例尺=100μm。A、 AVF动脉肢体；五、 AVF静脉肢体；五十、 流明；NL，新生内膜病变。白色箭头表示阳性染色的示例区域。

图5显示具有代表性的IHC图像和Ki-67分析的定量结果。Ki-67在NVS组和PBS组的整个AVF中的表达水平相似。

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Ki67分析。Ki67的典型免疫组织化学图像（A、B）PBS治疗动物4周时AVF吻合口的染色（A）和NVS（B）.（C）染色强度的量化（即平均灰度值）。（D）染色阳性面积百分比的量化。对整个AVF进行分析。结果表示为平均值±标准误差。N=3/组。比例尺=100μm。A=AVF的动脉肢体。V=AVF的静脉肢体。L=流明。NL=新生内膜病变。白色箭头表示阳性染色的示例区域。

胶原纤维取向的多光子分析

根据Martinez等人（2018年），如果胶原方向垂直于腔，则认为有利于AVF成熟。我们在第4周采集了AVF的SHG图像(补充图3). 我们观察到，NVS处理样品中58%的分析区域显示出有利于AVF成熟的胶原蛋白取向，而PBS处理样品中只有25%的分析区域表现出良好的胶原蛋白定向，尽管这种差异在统计学上并不显著。胶原形态数据显示，与PBS处理的样品相比，NVS处理的样品总体胶原面积较小，但形状特征更明确（即圆度、粗糙度和偏心率），尽管没有统计差异。

细胞死亡分析

如上所述，动物对NVS耐受性良好，我们没有观察到任何毒性。为了进一步证实所用NVS浓度不存在毒性，我们进行了在体外测量NVS对内皮细胞和血管平滑肌细胞死亡的影响的实验。使用研发系统套件，NVS治疗通过细胞凋亡导致最小的细胞死亡(图6)和罗氏试剂盒（数据未显示）。

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细胞死亡。（A）HUVEC凋亡（左）和（B）暴露于NVS后培养细胞的HASMC凋亡（右）。结果显示为平均值±标准偏差。

讨论

我们的研究表明，大鼠对NVS治疗耐受性良好，NVS处理显著增加了AVF开放管腔面积，而不显著影响新生内膜增生区域，这表明NVS疗法是安全的，并且可能通过促进外向重塑来提高患者AVF成熟度，从而具有治疗潜力。

动静脉瘘是一种通过外科手术创建的导管，动脉直接连接到静脉。作为对动脉血流引起的壁切应力和壁张力增加的反应，静脉壁发生重塑以适应变化的血流动力学力。AVF成功成熟的理想结果是通过外向重塑及时且适当地动脉化静脉(胡等，2016)，但在观察性研究中，AVF成熟失败率在20%至60%之间(Cheung等人，2017年). 提高AVF成熟度仍是ESKD患者治疗的重要临床目标(DeVita等人，2020年).

动静脉瘘成熟失败是由于新生内膜过度增生和/或外部重塑受损导致的管腔狭窄所致。在许多不同的生物学过程中，最近的一篇论文强调了内侧纤维化是一个以前被忽视但对发育不良起关键作用的因素(Martinez等人，2018年). 在AVF成熟过程中，ECM组分、调节蛋白（如MMP和TIMP）以及结构蛋白（如胶原蛋白和弹性蛋白）的表达显著增加，介导ECM重塑的受控模式而不发生结构破坏(Hall等人，2015年). 局部炎症导致的壁过度纤维化以及术后胶原纤维角度与AVF未成熟呈正相关(Martinez等人，2018年). 此外，新合成胶原蛋白的圆周排列与AVF的未成熟相关，可能是由于静脉在经历静脉动脉化过程时的膨胀性降低。适当的ECM沉积可以为下游生物过程提供结构和时间方向，这些生物过程有助于血管重塑，如细胞增殖和炎症(Del Monte-Nieto等人，2020年).

针对ECM的治疗方法以前在AVF环境中进行过评估。局部施用重组人弹性蛋白酶验证了以下假设：血管壁中弹性蛋白的降解可能导致更大的早期扩张，而弹性蛋白片段可能具有重新引导肌成纤维细胞迁移的趋化特性，从而增强向外增殖。在II期和III期临床试验中对这一治疗原则的测试没有显示出益处(Terry和Dember，2013年;Bleyer等人，2019年). 弹性蛋白是ECM结构蛋白的非再生成分。促进弹性蛋白降解可能会导致动脉适应过程中更加不稳定，这可能导致缺乏益处，而不是促进成熟过程。

天然血管支架治疗是一种新技术，在血管成形术扩张血管的过程中，通过小分子和450nm光的光化学活化，帮助保存天然ECM支架(Munger等人，2016年;Ansari等人，2020年). 在光激活过程中，ECM纤维在血管过程中被拉伸到的位置重新连接。胶原蛋白和弹性蛋白纤维的氨基酸之间形成持久的共价键，这有助于保持扩大的管腔尺寸，但与支架植入物不同，对脉动压力保持灵活性(Munger等人，2016;Ansari等人，2020年). 这种支架效应也有助于减少血管成形术过程中血流变化对血液动力学的突然影响，并间接有助于调节随后的细胞反应。我们之前已经证明，该技术可以保持猪颈动脉的天然完整性，而不会增加其硬度(Mogharrabi等人，2019年)并且可以减少球囊血管成形术后猪颈动脉过度拉伸引起的损伤(Munger等人，2016年). 这种治疗专门针对ECM成分，使细胞血管成分在收缩和松弛时功能完整(Ansari等人，2020年).

在本研究中，我们评估了NVS治疗在一个研究良好的AVF大鼠模型中的效果(Langer等人，2010年)为了验证以下假设，即在AVF形成时重新连接ECM蛋白可能会导致AVF发育的改善。我们的研究结果表明，与PBS对照组相比，NVS治疗没有影响新生内膜病变区域（即对向内重塑没有影响），但重要的是，在AVF创建手术后4周，导致静脉直径增大（即更好的向外重塑）。对照组和NVS组的Ki-67表达水平相似，这与NVS治疗不会影响AVF形成过程中血管壁细胞的增殖这一概念一致。另一方面，管腔增大伴随着炎症标记物IL-6和MMP-9的降低。文献中提出炎症在AVF成熟中的病理作用。特别是，对AVF生成手术时采集的人类静脉进行的第一次RNA-seq分析显示，手术前静脉中的几个促炎基因上调，最终未能成熟(Martinez等人，2019年). 此外，IL-6受体的激活被认为在血液透析患者AVF衰竭的发病机制中起作用(Marrone等人，2007年). MMP-9是炎症标记物；虽然MMP-2通常不被认为是炎症标志物，但MMP-2和MMP-9的减数几乎相同，在血管重塑中很重要。术前MMP-2/9在AVF发展中的作用存在争议。据报道，术前血清和静脉样本中MMP-2/9的基线水平与患者AVF成熟度呈阳性、阴性或无相关性(Lee等人，2010年;Lin等人，2010年;Lee E.S.等人，2011年;Tirinescu等人，2017年). 我们团队的研究表明MMP-2/9和AVF成熟度之间存在负相关。

我们的研究表明，在AVF发育过程中，NVS不会导致细胞死亡，也不会影响细胞增殖。尽管NVS对减少内向重塑没有作用，但它仍然可以通过增强外向重塑来促进AVF的成熟。吻合口附近静脉段狭窄很常见，AVF领域的研究工作几乎完全集中在新生内膜增生形成作为狭窄和随后AVF成熟失败原因的作用上(Dixon，2006年;Kokubo等人，2009年;Lee T.等人，2011年;Rothuizen等人，2013年). 然而，新出现的临床证据表明，狭窄本身并不能解释许多AVF成熟失败的病例。例如，在一项对145名患者的研究中，三分之二的主动脉瓣狭窄患者在没有进行狭窄治疗的情况下仍然成熟(Allon等人，2013年). 另一项针对115名患者的研究发现，术后新生内膜增生只与成熟失败有关，因为患者有更多的纤维化，因此静脉更硬(Martinez等人，2018年). 这些观察结果强烈表明，需要进行更多研究，以加强AVF发展过程中的管腔扩张，而不仅仅是抑制因过度细胞增殖和新生内膜增生形成而引起的狭窄。

目前，我们尚不清楚ECM重新连接如何/为什么会导致炎症标记物减少，这超出了本研究的范围。将该疗法应用于患病的人类动脉也有类似的观察体外(Ansari等人，2020年). 在这些研究中，与对照组相比，NVS治疗后器官培养中人动脉环的IL-6生成受到抑制。这些先前的研究表明NVS可以直接抑制炎症，但需要进一步研究以了解NVS治疗的抗炎作用的确切机制。

由于NVS治疗主要影响ECM的排列，因此我们研究了NVS处理血管中胶原纤维与同样接受光活化处理的PBS对照血管中的胶原纤维之间的差异。多光子SHG成像是研究胶原纤维组织的有用技术；它利用了胶原蛋白的光学特性，不需要组织学染色（如Picrosius红或Masson三色）或使用抗体进行免疫染色。在NVS治疗的AVF中，血管壁中的胶原纤维倾向于与管腔周长垂直排列。这与以下人员的调查结果一致Martinez等人（2018年）ECM纤维在血管壁中的分布和位置可能有助于下游生物学。支架为调节增殖和炎症的细胞成分提供微环境。

这项研究有几个局限性。首先，动物数量可能会更多。未来的研究应该考虑使用更大的动物群。其次，从固定组织中获得血管壁管腔面积和开放管腔面积的%。众所周知，福尔马林固定后组织会收缩。此外，与动脉不同的是，由于血管壁较薄，在采集的静脉中常见内腔塌陷。未来的研究将包括使用无创超声测量活体动物的内腔面积，以补充组织学发现。第三，我们使用IHC评估血管壁中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平。这两种基质金属蛋白酶都是作为非活性前蛋白分泌的，当被细胞外蛋白酶裂解时，前蛋白被激活；金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）进一步调节其活性水平。因此，酶谱分析将是测定血管壁中MMP活性水平的关键方法，在未来的研究中，除了组织学测定其表达外，还应考虑酶谱分析。第四，机理研究的范围有限，使用了IHC，而不是更多的定量方法，如Western Blot或ELISA。本研究的主要目的是阐明NVS是否对AVF重塑有影响，因此，管腔面积的形态计量学分析是最关键的参数。作为研究潜在分子机制的第一步，我们进行了IHC分析，发现在NVS治疗的血管中，AVF壁中的炎症标记物IL-6和MMP-9显著降低。未来可能在大型动物模型（例如猪或羊）中进行的研究将考虑使用更多定量方法（例如，Western Blot或ELISA）和IL-6和MMP-9上游途径（例如，反应性氧化物种和氧化应激）。

结论

我们的数据表明，NVS治疗在产生AVF时可以促进静脉壁的外向重塑，同时减少炎症。NVS治疗的这些有益的下游生物效应与胶原蛋白的更明显和可测量的外观相关。我们的结果支持了之前基于临床观察得出的结论，这些临床观察强调了适当血管ECM组织在AVF成熟过程中的作用和相关性。这也表明了NVS疗法在临床环境中促进瘘管成熟的潜力。

数据可用性声明

本文中提供的数据集不可用，因为支持本文结论的原始数据将由作者在请求者的研究所之间建立数据使用协议后提供给请求者以及犹他大学和申请人研究所与Alucent Biomedical，Inc.之间的数据使用协议。访问数据集的请求应发送至KK，resualk的laceidemoibtnecula.

道德声明

犹他大学IACUC审查并批准了这项动物研究。

作者贡献

YTS和KK：研究设计和数据解释。YH、JT、MK、BA：数据采集。所有作者：数据分析，起草手稿，批准手稿的最终版本。

利益冲突

BA和KK受雇于Alucent Biomedical Inc.公司。资助者Alucent生物医学公司参与了研究设计、收集、分析、数据解释、撰写本文或决定将其提交出版。其余作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

部分研究结果发表在《实验生物学2020会议摘要》（摘要发表在《美国实验生物学学会期刊》第34卷第S1期）。

基金。这项工作得到了Alucent Biomedical，Inc.的资助。资助者参与了研究设计、数据收集、分析、解释，以及撰写本文或决定将其提交出版。

补充材料

本文的补充材料可以在以下网站上找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2021.622617/full#补充-材料

补充图1

非手术血管分析。PBS治疗动物的对侧、非手术股动脉和静脉的代表性VVG图像（A）和NVS（B）C和D显示IEL–非手术静脉的封闭区域（C）无手术动脉（D），并分别与AVF静脉肢体和动脉肢体的IEL封闭区进行比较。结果表示为平均值±标准误差。在每个非手术动脉和静脉组中，N=8-9。*p<0.001。**p<0.005。A=动脉。V=静脉。L=流明。

补充图2

整个AVF和动脉肢体。整个AVF的形态分析（A–D）和动脉肢体（东-西）AVF吻合。结果显示为平均值±标准偏差。N=第1周每组3-4人。第4周，每组N=6-9。

补充图3

AVF胶原纤维分析。PBS治疗动物4周AVF的代表性多光子自体荧光（绿色）和SHG（红色）图像（A、B）和NVS（C、D）B和D示出了用于分析纤维结构的感兴趣的放大区域。

工具书类

  • Allon M.、Robbin M.L.、Young C.J.、Deierhoi M.H.、Goodman J.、Hanaway M.等人（2013年）。术前静脉内膜增生、术后动静脉瘘狭窄和临床瘘结局。 临床。《美国肾脏学会杂志》。 81750–1755. 10.2215/cjn.02740313[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Alpers C.E.、Imrey P.B.、Hudkins K.L.、Wietecha T.A.、Radeva M.、Allon M.等人（2017年）。血液透析动静脉瘘创设手术中获得的静脉组织病理学。 《美国肾脏学会杂志》。 283076–3088. 10.1681/asn.2016050598[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ansari E.、Anderson B.、Kauser K.（2020年）。通过天然血管支架治疗细胞外基质的光活化连接后动脉粥样硬化人类动脉的保留功能。 心血管杂志。Transl.公司。物件。10.1007/s12265-020-10063年[Epub提前打印]。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Bleyer A.J.、Scavo V.A.、Wilson S.E.、Browne B.J.、Ferris B.L.、Ozaki C.K.等人（2019年）。vonapanitase（PATENCY-1）促进放射性脑瘘通畅并用于血液透析的随机试验。 J.瓦斯。外科学。 69507–515. 2016年10月10日/j.jvs.2018.04.068[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cheung A.K.、Imrey P.B.、Alpers C.E.、Robbin M.L.、Radeva M.、Larive B.等人（2017年）。血液透析瘘成熟研究中的内膜增生、狭窄和动静脉瘘成熟失败。 《美国肾脏学会杂志》。 283005–3013. 10.1681/asn.2016121355[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cho J.M.、Shiu Y.T.、Symons J.D.和Lee T.（2020年）。小鼠颈外静脉和颈动脉的血管活动。 J.瓦斯。物件。 57291–301. 10.1159/000508129[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Del Monte-Nieto G.、Fischer J.W.、Gorski D.J.、Harvey R.P.、Kovacic J.C.（2020年）。心血管系统细胞外基质的基础生物学，第1/4部分：JACC专题研讨会。 美国大学J.Am.Coll。心脏病。 752169–2188. 2016年10月10日/j.jacc.2020.03.024[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • DeVita M.V.、Khine S.K.、Shivarov H.（2020）。动静脉通路创建、成熟、适用性和透析耐久性的新方法。 肾脏国际代表。 5769–778. 2016年10月10日/j.ekir.2020.02.1024[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dixon B.S.（2006）。为什么瘘管不成熟？ 肾脏Int。 701413–1422. 10.1038/sj.ki.5001747[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Gorecka J.、Fereydooni A.、Gonzalez L.、Lee S.、Liu S.、Ono S.等人（2019年）。促进动静脉瘘成熟和通畅的分子靶点。 瓦斯克。Investig Ther.公司。 233–41.10.4103/vit_9_19[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hall M.R.、Yamamoto K.、Protack C.D.、Tsuneki M.、Kuwahara G.、Assi R.等人（2015年）。动静脉瘘成熟过程中静脉细胞外基质成分的时间调节。 J.瓦斯。访问。 1693–106.10.5301/jva.5000290[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hu H.、Patel S.、Hanisch J.J.、Santana J.M.、Hashimoto T.、Bai H.等（2016）。未来的研究方向是提高瘘管成熟度和减少进入失败。 塞明。瓦斯克。外科学。 29153–171. 2005年10月10日/j.semvascsurg.2016.08.005[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kokubo T.、Ishikawa N.、Uchida H.、Chasnoff S.E.、Xie X.、Mathew S.等人（2009年）。CKD加速动静脉瘘新生内膜增生的发展。 《美国肾脏学会杂志》。 201236–1245. 10.1681/asn.2007121312[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kwon S.H.、Li L.、He Y.、Tey C.S、Li H.和Zhuplatov I.等人（2015）。多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂预防静脉新生内膜增生。 J.瓦斯。物件。 52244–256. 10.1159/000442977[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Langer S.、Kokozidou M.、Heiss C.、Kranz J.、Kessler T.、Paulus N.等人（2010年）。慢性肾脏疾病加重大鼠动静脉瘘损伤。 肾脏Int。 781312–1321. 10.1038/ki.2010.353[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lawson J.、Niklason L.、Roy-Chaudhury P.（2020年）。血液透析中血管通路的挑战和新疗法。 国家肾脏病学杂志。 16586–602. 10.1038/s41581-020-0333-2[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lee E.S.、Shen Q.、Pitts R.L.、Guo M.、Wu M.H.、Sun S.C.等（2011）。患者的血清金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和金属蛋白酶组织抑制剂与动静脉瘘成熟相关。 J.瓦斯。外科学。 54454–459. 讨论59-60，10.1016/j.jvs.2011.02.056[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lee E.S.、Shen Q.、Pitts R.L.、Guo M.、Wu M.H.、Yuan S.Y.（2010）。基质金属蛋白酶的静脉组织表达作为血液透析动静脉瘘成熟的生物标志物。 瓦斯克。血管内。外科学。 44674–679. 10.1177/1538574410377021[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lee T.（2017）。瘘管第一倡议：对血管通路实践模式的历史影响以及对未来血管通路护理的影响。 心血管疾病。工程技术。 8244–254. 2007年10月17日/13239-017-0319-9[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lee T.、Chauhan V.、Krishnamoorthy M.、Wang Y.、Arend L.、Mistry M.J.等人（2011年）。透析通路手术前严重静脉新生内膜增生。 Nephrol公司。拨号。移植 262264–2270. 10.1093/ndt/gfq733[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lin C.C.、Yang W.C.、Chung M.Y.、Lee P.C.（2010）。基质金属蛋白酶-1、-3、-9的功能多态性与血液透析患者动静脉瘘的通畅相关。 临床。《美国肾脏学会杂志》。 51805–1814. 10.2215/cjn.01500210[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lok C.E.、Huber T.S.、Lee T.、Shenoy S.、Yevzlin A.S.、Abreo K.等人（2020年）。KDOQI血管通路临床实践指南：2019年更新。 美国肾脏病杂志。 75S1–S164[公共医学][谷歌学者]
  • Marrone D.、Pertosa G.、Simone S.、Loverre A.、Capobianco C.、Cifarelli M.等人（2007年）。白细胞介素6信号的局部激活与血液透析患者动静脉瘘狭窄相关。 美国肾脏病杂志。 49664–673. 10.1053/j.ajkd.2007.02.266[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Martinez L.、Duque J.C.、Tabbara M.、Paez A.、Selman G.、Hernandez D.R.等人（2018年）。动静脉瘘的纤维静脉重塑和不饱和。 美国肾脏病学会。 291030–1040. 10.1681/asn.2017050559[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Martinez L.、Tabbara M.、Duque J.C.、Selman G.、Falcon N.S.、Paez A.等人（2019年）。人类动静脉瘘衰竭的转录组学：与非饱和相关的基因。 美国肾脏病杂志。 7473–81.10.1053/j.ajkd.2018.12.035[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mogharrabi F.、Kuhlenhoelter J.、Anderson B.、Kauser K.、Monson K.（2019年）。““光活化交联化合物对猪颈动脉血管成形术后力学性能的影响，“inASME 2019国际机械工程大会和展览会。犹他州盐湖城。[谷歌学者]
  • Munger K.A.、Downey T.M.、Haberer B.、Pohlson K.、Marshall L.、Utecht R.E.（2016）。一种新型光化学交联技术，用于改善猪动脉腔内增益、血管顺应性和血管成形术后屈曲。 J.生物识别。马特。Res.B申请。比奥马特。 104375–384. 10.1002/jbm.b.33373[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rothuizen T.C.、Wong C.、Quax P.H.、van Zonneveld A.J.、Rabelink T.J.、Rotmans J.I.（2013）。动静脉通路失败：不仅仅是内膜增生？ Nephrol公司。拨号。移植 281085–1092. 10.1093/ndt/gft068[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shiu Y.T.、Litovsky S.H.、Cheung A.K.、Pike D.B.、Tey J.C.、Zhang Y.等（2016）。术前血管内侧纤维化和动静脉瘘的发展。 临床。《美国肾脏学会杂志》。 111615–1623. 10.2215/cjn.00500116[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shiu Y.T.、Rotmans J.、Geelhoed W.、Pike D.、Lee T.（2019年）。血液透析动静脉导管：如何更好地调节病理生理血管反应，以优化血管通路的耐久性。 美国生理学杂志。肾。生理学。 316F794–F806。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Terry C.M.、Dember L.M.（2013）。血液透析血管通路功能障碍的新疗法：神话还是现实？ 临床。《美国肾脏学会杂志》。 82202–2212. 10.2215/cjn.07360713[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Tirinescu D.C.、Tomuleasa C.、Pop L.、Bondor C.I.、Vladutiu D.S.、Patiu I.M.等人（2017年）。基质金属蛋白酶-2预测血液透析患者动静脉瘘失败。 疗法。Apher拨号。 21586–591. 10.1111/1744-9987.12584[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自生物工程和生物技术前沿由以下人员提供Frontiers Media SA公司