PASylated Thymosinα1：一种在肿瘤和病毒学中应用的长效免疫刺激肽

摘要

1.简介

胸腺肽α1（Tα1）是一种最初从小牛胸腺中分离出来的免疫刺激肽[1]在人类中也很丰富。Tα1被合成为高酸性（pI=3.7）原胸腺素α（ProTα）的N末端部分，这是一种特殊的细胞质蛋白，由于在生理条件下不存在任何含硫和芳香侧链，特别是其随机卷曲结构[2,三]. 经溶酶体天冬酰胺内肽酶（豆豆蛋白；δ-分泌酶）裂解后，N-末端乙酰化28-残肽Tα1被释放[4]. Tα1在激活和调节免疫系统的各种细胞中起着重要作用[5]例如，通过刺激髓样和浆细胞样树突状细胞（DC）上的类toll受体（TLR）-2和TLR-9，导致免疫相关细胞因子的分泌[6,7]. 此外，Tα1增加激活的T辅助细胞（Th）的数量，并引起向Th1亚类的转移，从而促进细胞介导的免疫反应。此外，据报道Tα1可减少免疫细胞的凋亡[8]上调主要组织相容性复合体I（MHC I）分子的表达[9]以及肿瘤抗原[10]. 有趣的是，Tα1介导细胞内谷胱甘肽（GSH）水平的升高[11]，它不仅在体外抑制某些癌细胞的生长[7,12]，但也通过阻止包膜糖蛋白寡聚所需的二硫键形成来阻止病毒颗粒的组装[13]. 这些特征为Tα1提供了广泛的临床应用[14].

事实上，一种化学合成的Tα1肽药物已经在30多个国家以Zadaxin™商标销售了20多年。Zadaxin™被临床批准用于治疗慢性乙型肝炎（HBV）、慢性丙型肝炎（HCV），作为疫苗佐剂，以及作为化疗诱导免疫抑制的辅助治疗[7]. 值得注意的是，最近在现代癌症免疫治疗的背景下对Tα1的使用进行了重新评估，因为有迹象表明该肽可能支持免疫检查点抑制。临床前数据表明，Tα1可将对免疫检查点抑制剂反应不良的所谓冷肿瘤转化为高度淋巴细胞滤过的肿瘤，从而提高治疗效果[15]. 事实上，一项评估临床II期数据的回顾性研究报告称，与单独接受依普利单抗治疗相比，连续接受Tα1和免疫检查点抑制剂依普利莫单抗（一种CTLA-4-阻断抗体）治疗的黑色素瘤患者的总生存率增加[16]. 此外，在抗CTLA-4诱导的小鼠结肠炎模型中，Tα1可防止肠道毒性，从而有助于提高免疫检查点抑制剂的安全性[17]. 除此之外，囊性纤维化等新出现的适应症[18]、多发性硬化[19]和脓毒症[20]进一步强调了这种小的治疗肽的巨大潜力。最后，随着新冠肺炎大流行的爆发，Tα1最近在病毒学中获得了新的关注。新型冠状病毒肺炎的临床症状在某种程度上类似于病原诱导的脓毒症，因此有必要进行免疫调节性Tα1治疗[21]. 按照这些原则，中国高危新冠肺炎患者已经接受了每周Tα1注射联合人干扰素1（hIFN-α）滴鼻剂的预防措施[22]. 此外，最近一项针对接受治疗的中国患者的回顾性研究显示，Tα1通过恢复淋巴细胞减少和逆转耗尽的T细胞，显著降低了严重新冠肺炎的死亡率[23].

然而，目前上市的Tα1有两个主要缺点，这两个缺点都与它的肽性有关。首先，Tα1的生物制药生产具有挑战性。除了通过N-末端乙酰化进行翻译后修饰外，Tα1的化学合成是复杂的，障碍包括所需的大量保护基团以及合成过程中中间体的聚集趋势[24]. 此外，固相合成的总收率较低，通常仅达到25%左右[25]. 另一方面，作为重组肽的生物技术生产在经济上迄今为止一直失败。一般来说，短肽在细菌细胞质中会迅速降解；因此，一步法高效生产成熟Tα1大肠杆菌这是不可行的。另一种选择是作为更大蛋白质的一部分进行表达，如天然ProTα[26]，作为人造concatamers[27]与内含子融合[28]或与高表达的细菌蛋白如硫氧还蛋白融合[29]. 在每种情况下，酶或化学裂解都是释放成熟肽所必需的，这使生物制药下游过程复杂化。第二，体内给药后，小肽Tα1通过肾脏过滤迅速被清除，人类的血浆半衰期不到3小时[30]. 这限制了其临床疗效，并且为了保持可行的药物水平，需要每天两次给药。

在本研究中，我们应用了PAS化^®技术，以克服当前可用Tα1药物的这两个障碍，并创造一种持久的N-末端乙酰化治疗肽，同时在大肠杆菌为此，我们将融合与包含小天然L-氨基酸Pro、Ala和Ser的600肽结合[31]通过过度表达宿主细胞N-乙酰转移酶RimJ进行原位N-乙酰化[32]. 基因编码的非带电“PAS”序列可溶性高，结构紊乱，流体动力体积增大，因此显示出与化学聚合物聚乙二醇（PEG）非常相似的生物物理行为，PEG已被用于延长一系列其他治疗性肽和蛋白质的血浆半衰期[33,34,35].

2.结果

2.1. PASylated Tα1的克隆和细菌生产

为了实现N-末端乙酰化Tα1的C-末端PAS酰化，构建了一个含有双顺反子操纵子的质粒，以允许同时表达人Tα1（UniProtKB ID:P06454；残基2-29），C-末端与包含601个氨基酸的PAS多肽融合[34]、和大肠杆菌基于载体pASK75的N-乙酰转移酶RimJ（UniProtKB ID:P0A948）(图1) [36]. 在一次平行的尝试中，再次使用质粒pASK75作为主干构建了一个编码N-末端PASylated Tα1的质粒（这次省略了RimJ顺反子，见下文）。在2 L摇瓶天平上使用大肠杆菌化学诱导tet启动子/操作员控制下的NEBexpress菌株[36].

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图1

N-末端乙酰化Tα1-PAS的细菌产生。(一)诱导型tet控制下双顺反子操纵子Tα1-PAS和N-乙酰转移酶RimJ的表达载体^订单pASK75上克隆的基因盒包括T7噬菌体核糖体结合位点（T7 RBS），随后是融合到601位PAS#1序列的人类Tα1编码序列、第二个RBS、RimJ编码序列和脂蛋白终止子（T_{液化石油气}). (b条)Tα1-PAS的4–12%SDS–PAGE后的Western blot分析大肠杆菌使用针对PAS#1序列的抗体裂解整个细胞。M、 蛋白质尺寸标准；车道1，诱导前全细胞提取；泳道2，诱导后15小时的全细胞提取物。(c（c）)纯化Tα1-PAS的10%SDS-PAGE。M、 蛋白质尺寸标准；通道1，Tα1-PAS，硫酸铵沉淀后，减去阴离子交换（AEX）、阳离子交换（CEX）和最终AEX色谱。

在诱导前和诱导后15 h用Western blotting分析整个细胞裂解物。使用识别PAS#1序列表位的单克隆抗体，检测到一条分子大小约大于250kDa的独特带(图1b） 证明细菌成功表达全长C末端PASylated Tα1（Tα1-PAS），没有降解迹象。值得注意的是，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中，Tα1-PAS（52.7kD）的异常缓慢迁移对于PASylated蛋白质来说是众所周知的[31,37]并且可以通过SDS（其提供电泳驱动力）与强亲水性PAS序列的不良结合来解释。

2.2. PASylated Tα1的纯化及体外表征

不带电的PAS部分不会改变目标肽的等电点，有助于硫酸铵沉淀经典蛋白质，从而提供一个高效且廉价的纯化步骤。将通过机械细胞裂解制备的清除的全细胞提取物调节至30%硫酸铵饱和度后，大多数宿主细胞蛋白仍保留在溶液中，而PAS-Tα1和PAS-Tβ1都被选择性地回收为沉淀。去除残留物大肠杆菌蛋白，再溶解沉淀物在pH 8.5的耐盐阴离子交换（AEX）树脂上进行离子交换色谱。即使PASylated Tα1肽的计算pI为4.3[38]由于在这些条件下，这两个版本都应该带负电，因此预计会吸附到树脂上，因此在流动中定量地发现了重组融合蛋白。可能，体积庞大的PAS聚合物部分屏蔽了小肽与色谱基质的离子相互作用。然而，这一步骤导致了残留宿主细胞蛋白和细菌内毒素的有效消耗。

在pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液中透析蛋白质溶液，然后将其应用于强阳离子交换（CEX）柱，这导致PAS-Tα1的结合分数，而Tα1-PAS的流动分数和结合分数均被观察到(图2). 通流中Tα1-PAS的电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析显示分子质量为52734.56 Da(图2a） ，精确匹配N末端乙酰化基因产物（52734.56 Da）的计算质量。在这种情况下，Tα1-PAS的起始蛋氨酸（随后是Ser残基）被完全处理，可能是由细菌蛋氨酸氨肽酶处理的[39]然后通过RimJ进行N末端乙酰化。相反，使用盐浓度梯度洗脱的柱结合肽级分显示52692.38Da的分子量(图2b） ，对应于非乙酰化加工多肽（52692.54 Da）的计算质量，伴随着一些低于40 kDa的小峰，很可能是由于残留的宿主细胞杂质所致。因此，由于单个电荷差异，该CEX步骤能够将所需的N-乙酰化Tα1-PAS与其非乙酰化前体分离。相比之下，全柱结合非乙酰化PAS-Tα1的单分子质量为52789.8Da(图3)与完整肽相对应，同样缺乏起始蛋氨酸。

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图2

分析Tα1-PAS N-乙酰化、肽纯度和流体动力学体积。(一)减去AEX步骤后Tα1-PAS流通分数的反褶积ESI-MS光谱（见正文）显示出52734.56 Da的分子质量，对应于N-乙酰化Tα1-PA（计算质量：52734.56Da）。(b条)对同一色谱中结合和洗脱的肽部分进行ESI-MS分析，发现分子质量为52692.37 Da，与计算的非乙酰化Tα1-PAS质量（52692.54 Da）相匹配。(c（c）)流动馏分的反相色谱表明N-乙酰化Tα1-PAS的纯度>96%。(d日)最终纯化的Tα1-PAS在磷酸盐缓冲盐水（PBS）存在下的分析SEC产生一个洗脱体积为13.5 mL的单峰。与半对数校准曲线（插图）的比较表明，流体动力体积扩大，表观分子尺寸为557 kDa。

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图3

Tα1肽N-末端PASylated版本的制备及其完整性、纯度和流体力学体积分析。(一)细菌产生PAS-Tα1的表达载体。pASK75上克隆的基因盒包括T7 RBS、601-残基PAS#1序列的编码区、起始蛋氨酸和脯氨酸密码子、人类Tα1序列，以及_{液化石油气}. (b条)PAS-Tα1的反褶积ESI-MS光谱大肠杆菌通过AEX和CEX减法提取的细胞（见正文）显示分子质量为52789.69 Da，这与PAS-Tα1的计算质量和完全加工的起始蛋氨酸（52789.66 Da）相匹配。(c（c）)反相色谱表明PAS-Tα1的纯度>96%。(d日)PBS中纯化PAS-Tα1的分析SEC产生一个洗脱体积为13.2 mL的单峰。与半对数校准曲线（插图）进行比较表明，流体动力体积强烈膨胀，表观分子尺寸为665 kDa。

如反相色谱所示，两种PASylated肽制剂的纯度均大于96%(图2c和图3c） ●●●●。对于Tα1-PAS，我们执行了最后的AEX抛光步骤，这也允许肽的浓度。在pH 10下，乙酰化Tα1-PAS与强AEX树脂结合，并在盐浓度梯度中以同质峰形式洗脱。该级分的内毒素含量非常低，<0.1 EU/mg，最终产量为每1L细菌培养物15 mg乙酰化Tα1-PAS。相比之下，经CEX色谱后，全柱结合（非乙酰化）PAS-Tα1的最终产率达到50 mg/L细菌培养物，内毒素含量也低于0.1 EU/mg。分析尺寸排除色谱法（SEC）两种PASylated肽版本均显示出单一对称峰，没有任何聚集或截断迹象(图2d和图3d） ●●●●。N-末端乙酰化Tα1-PAS以13.5 mL洗脱（床体积：24 mL），而PAS-Tα1以13.2 mL洗脱，因此表明表观分子尺寸分别为557 kDa和665 kDa。这比两种PASylated肽（52.7 kDa）的真实分子质量大10倍（Tα1-PAS）甚至12倍（PAS-Tα1[35].

2.3. PAS化强烈延长大鼠Tα1药代动力学

为了模拟临床批准的Zadaxin™给药途径，将N-乙酰化Tα1-PAS皮下注射到大鼠背部区域(N个= 5). 注射剂量为3.4 mg/kg Tα1-PAS的患者耐受性良好，无任何药物相关不良事件或体重显著变化。使用定量夹心ELISA分析不同采样时间的Tα1-PAS血浆水平，该ELISA仅检测Tα1-PSA，而不检测内源性大鼠Tα1，其与人类肽具有100%的序列一致性。Tα1-PAS的药代动力学（PK）谱(图4)根据贝特曼函数显示了一条典型曲线[40]，带C_最大值在t时为25.6±4.4 mg/L_最大值=22.7±1.1 h。使用WinNonlin软件进行曲线拟合显示，终端半衰期大幅延长，为15.9±0.9 h，比天然肽（τ_1/2=1.9 h）针对大鼠发布[41]. PAS化对PK曲线的强烈影响也反映在其他参数上，如曲线下大面积（AUC）和慢速清除（CL）(表1).

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图4

大鼠N-乙酰化Tα1-PAS的PK研究。将Tα1-PAS以3.4 mg/kg b.w.的剂量皮下注射到雌性Wistar大鼠体内(N个= 5). 用夹心ELISA法定量血浆中融合蛋白的浓度。根据注射后取样时间（p.i.）绘制数据，并使用单室模型进行拟合。PK曲线显示出不同的吸收和消除阶段（有关PK参数，请参阅表1).

表1

Tα1-PAS在大鼠体内的药代动力学特性。

参数	Tα1-PAS
C类最大值（毫克/升）	25.6 ± 4.4
t吨最大值（h）	22.7 ± 1.1
AUC公司0-∞（hµg/mL）	1586.7 ± 295.1
τ1/2α（h）	15.7 ± 0.8
τ1/2β（h）	15.9 ± 0.9
CL（毫升/小时/千克）	2.2 ± 0.4

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3.讨论

目前的数据表明，PAS化技术可以解决肽药物的两个主要问题：（i）在表达宿主中不稳定；（ii）由于肾脏清除速度快，生物活性低。通常，小肽，如果在大肠杆菌，被宿主细胞蛋白酶快速降解[42]因此，需要生产更大的融合蛋白，并通过体外定点切割进行后续释放。这里，与约600个氨基酸的随机形成线圈的PAS序列融合可以防止蛋白水解降解，并允许在大肠杆菌无需额外的处理步骤。

值得注意的是，与经典方法不同，经典方法涉及使用不溶性融合伙伴，例如胰岛素中的α-半乳糖苷酶片段[43]为了刺激包涵体的形成并保护基因产物免受细胞内蛋白水解，将PASylated Tα1肽恢复为可溶性融合蛋白，从而允许直接从细胞提取物中纯化而无需进行溶解步骤。此外，经ESI-MS证实，C-末端连接的PAS部分与RimJ的N-末端乙酰化反应兼容。我们在研究规模下的表达研究的产量达到15 mg纯化乙酰化Tα1-PAS，甚至每1 L细菌培养物中的50 mg PAS-Tα1（光密度（OD）为3），它超过了细菌产生的Tα1-Fc融合蛋白（可能是非乙酰化和非糖基化的）的报道产量（16 mg/L）[44].

尽管如此，通过优化表达质粒和生产过程，包括在受控喂养条件下的高细胞密度发酵，两种PASylated肽都有很大的改进机会。除此之外，尽管Tα1-PAS的N末端乙酰化率约为50%，但SDS-PAGE中共表达酶RimJ没有明显的条带，这也表明有改进的余地。优化RimJ顺反子之前的核糖体结合位点或改变双顺反子操纵子内的顺序应能促进酶的生物合成，并提高N-末端乙酰化Tα1-PAS的产量。最后，使用高效分泌型细菌表达系统，如ESETEC[45]或CORYNEX[46,47]应导致其他PASylated融合蛋白（如PASyleted human growth hormone（hGH））的产品滴度更高[48]. ESETEC系统中功能性PAS-hGH的产量是传统实验室菌株的100倍以上大肠杆菌达到每升培养物几克。

如SEC所示，Tα1肽两端的PAS序列增加了流体动力体积一个数量级以上。这种分子大小的强烈扩张导致大鼠皮下注射Tα1-PAS后血浆半衰期约为16小时，这比未经修饰的肽药物（1.9小时）增加了8倍多[41]. 基于人血清白蛋白融合蛋白体外细胞培养检测[49]Tα1的C末端和N末端都应允许修饰，同时保持生物活性。在C末端与免疫球蛋白Fc片段融合的动物肿瘤模型中也显示了这一点[41]，一种内吞精氨酰甘氨酰天冬氨酸肽iRGD[50]和胸腺五肽[51]. 然而，在Tα1的情况下，对体外细胞培养分析的重要性应谨慎一些，因为其作用方式复杂，涉及不同受体，对不同类型的细胞产生多种生物效应[52]. 第二，如本文所示，通过应用PAS化技术，体内循环延长会影响结合动力学和生物活性，这在体外是无法反映的。同时附着大分子，如PAS多肽或白蛋白，也附着PEG[53]，可导致生物活性肽或蛋白质的受体结合率降低，这通常被体内半衰期大幅延长所过度补偿，这导致生物活性显著增强，如多种PASylated生物药物所示[37,54]. 在Tα1的情况下，由于循环延长，最近证明Tα1-Fc融合蛋白在临床前癌症模型中具有优越的效果[41,44]. 这些研究将是研究PASylated Tα1增强体内生物活性的明显下一步，并且很有兴趣观察其N-末端或C-末端PASyleted版本的性能是否更好。

与其他已发表的延长Tα1循环的方法相比，经静脉注射到Sprague–Dawley大鼠尾静脉后，测得的Tα1-PAS的末端半衰期甚至比相应聚乙二醇化肽的8.2小时左右的值还要长[55]. 这种改性Tα1是通过工程化N末端Cys残基化学偶联5kDa甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺制备的。值得注意的是，根据异速生长定标法的规则，Tα1-PAS在人类体内的半衰期预计会更长，在几天的范围内[56,57]这将允许每周给药，同时实现持久的药理作用。根据Zadaxin™治疗慢性乙型肝炎的处方信息，单药治疗或干扰素联合治疗的推荐剂量为每6个月两次皮下注射1.6 mg（52剂）。因此，每周或每两周注射一次将大大减轻患者负担并提高依从性。

此外，如AUC急剧增加所示，由于清除速度较慢，血浆水平持续高于最低有效剂量，应能提高体内疗效，并开辟新的治疗前景。尤其是在临床前动物模型中，与人类相比，该模型的药物清除速度要快得多[37]由于它们的体型较小，长效Tα1应该会产生更令人信服的药效（PD）效应，并为生物药剂学的发展铺平道路，以适应新的适应症，如囊性纤维化[18]、HIV-1感染[58]、败血症[20]或癌症[59]. 例如，癌症研究表明，要达到抗肿瘤活性，需要高剂量的传统肽[60].

本研究中证明的PAS化技术的有益应用可以转移到其他肽。有7000多种天然肽，涵盖广泛的生理功能[61]包括许多已证明具有治疗潜力的肽，这些肽可以从所述方法中获益。例如治疗活性肽，如胸腺肽β4[62,63]C型利钠肽（CNP）[64]，人甲状旁腺激素（PTH）[65]，松弛素[66]，或胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其类似物[67]. 如今，人们普遍认为，为了将肽转化为有效药物，需要解决这类药物的固有弱点，例如稳定性差和血浆半衰期短[61]. 这里描述的方法，N-或C-末端PASylation，任选地与乙酰化结合，解决了这两个问题。一方面，N-末端乙酰化保护肽免受外蛋白酶的蛋白水解降解，例如二肽基肽酶-4（DPP-IV），如N-末端乙酰基化GLP-1所示[68]. 另一方面，PAS化使肽的水动力体积增加到肾小球基底膜孔径以上，从而延缓肾脏滤过并延长其融合伙伴的药效[31].

此外，PAS化可以作为连接两个肽的连接剂[69]. 如果两个实体协同行动，例如GLP-1和GIP，这将特别有意义[70]或Tα1和GM-CSF[71]. 或者，可通过PAS序列将生物活性蛋白/肽连接到靶向结构域，例如精氨酰甘氨酰天冬氨酸肽RGD肽，该肽与整合素αVβ3和αVβ5结合，以增强肿瘤的渗透和积聚。事实上，使用Gly将短效Tα1与肿瘤靶向iRGD肽融合₄linker最近已证明增强了抗肿瘤活性[50]. 与通常用于生物结合的合成PEG连接物相比，重组PAS序列具有精确定义的大小并且可生物降解[72]. PAS多肽本身在血浆中稳定，但会被细胞内酶快速降解，从而避免器官积聚[31]众所周知的聚乙二醇化效果[73]. 此外，PAS序列在动物中没有免疫原性[31,74]并在包括细菌、酵母菌或哺乳动物细胞在内的各种商业规模的表达系统中提供一步生产PASylated肽[35,48]，这甚至允许制备携带翻译后修饰的肽。

4.材料和方法

致谢

缩写

作者贡献

概念化，U.B.和A.S。；实验工作，U.B。；手稿准备、U.B.和A.S.所有作者均已阅读并同意手稿的出版版本。

基金

这项研究没有得到外部资助。

机构审查委员会声明

本研究是根据适用的动物福利法规（动物保护和使用机构委员会批准号：2020_ATRC/5999_F）进行的。PK研究（PK、新陈代谢和生物等效性）的许可代码为PE/EA/1374-5/2017，许可机构为匈牙利食品链安全和动物健康局害虫县政府办公室。

知情同意书

不适用。

数据可用性声明

本研究中提供的数据可向相应作者索取。

利益冲突

U.B.和A.S.是XL-protein GmbH的联合创始人和股东。

脚注

工具书类