上转换NIR-II荧光团用于线粒体靶向肿瘤成像和光热治疗

3a–3k和H4的光谱特性

然后，我们测试了二氯甲烷中3a–3f的光谱特性，如图所示3a、b发现其发射波长几乎与3g–3k，H4相同（图3c、d). 这些结果充分证明了甲氧基对硫代吡喃染料的光谱影响最小，而甲氧基不起供体的作用。THF、CH中3g–3k的紫外-可见-近红外光谱_三CN、丙酮、MeOH、EtOH和DMSO与二氯甲烷溶液中的光谱相似，表明这些溶剂对吸光度特性的影响几乎可以忽略不计（补充图^1安培)^49,50如附图所示¹，斯托克斯位移的大小与R上取代基的相对给电子能力一致_三供体电子密度的增加始终伴随着λ_前任和λ_{相对长度单位}到更长波长。如果我们考虑R处含有未取代苯的化合物3a或3g_三作为参考，在R处引入给电子取代基_三OAc（3b，3h）、OMe（3c，3i）和SMe（3d，3j）等位置导致荧光向NIR-I波长稳定红移15–130 nm，荧光量子产率高达31%。有趣的是，在二氯甲烷中对3e和3k进行的光致发光激发映射显示，最大吸收峰位于~741和~743nm，最大发射峰位于~917和918nm，尾部延伸到NIR-II区域。R处的二甲氨基取代物_三位置通过增强的给电子能力和共振两性离子结构诱导了最大吸收和荧光的额外强烈的深变色位移N、 N个-二甲基苯胺取代3e和3k。在二氯甲烷中测量3a–3k的量子产率（补充图²和补充表²).

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图3

3a–3k和H4的光谱特性。

一吸收波长和b条二氯甲烷中3a–3f的发射波长。c（c）吸收波长和d日二氯甲烷中3g–3k和H4的发射波长。

在CH中，3f和H4的紫外-可见-近红外吸收带在580–1100 nm处₂氯₂由于D和a单元之间形成了强大的电荷转移结构，而3f和H4的荧光发射光谱在约1100 nm处显示出峰值发射波长（图三). 此外，系统地研究了H4在不同溶剂和酸性条件下的NIR-II信号，如CH_三CN、DMSO、MeOH、EtOH/HCl、无机酸、有机酸和路易斯酸（图4). 在各种有机溶剂和酸性条件下，H4溶液的吸光度保持不变。吸光度和荧光随着H4浓度的增加而线性增加（图4克，小时)，表明在广泛的条件下没有通过积累而聚集。然而，H4在极性溶剂中表现出宽峰，发射显著猝灭，并且溶剂极性增加通常导致发射光谱向更长波长转移。与ICG相比，H4表现出较高的光稳定性，在持续激发40分钟的情况下，衰减可以忽略不计（图第4页)在DMSO中。H4在二氯甲烷中785 nm激发下的量子产率为2.01%，根据IR-26参考测量（0.5%量子产率，补充图^三).

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图4

H4的光谱特性。

一H4（10µM）在不同浓度HCl的EtOH中的荧光发射。b条吸光度和c（c）H4在不同酸中的荧光发射。d日吸光度和e（电子）H4在10µM不同溶剂中的荧光发射。（f）二甲基亚砜中H4在不同时间的荧光强度。克吸光度和小时不同浓度的EtOH中H4的荧光发射。我比较了连续808nm激光照射下H4和ICG在二甲基亚砜中的稳定性。

体外评价

骨肉瘤是第三常见的恶性肿瘤，占儿童和青少年恶性骨肿瘤的60%以上⁵¹手术切除所有原发性和转移性肿瘤仍是骨肉瘤治疗的基本策略。然而，目前的诊断工具只能检测到8-15%的骨或肺转移患者^52,53因此，迫切需要开发新的治疗策略，用于早期诊断、治疗和监测骨肉瘤治疗的反应^54,55寡肽PPSHTPT（PT）最初设计用于模拟体内天然蛋白骨钙素的特性，并对骨肉瘤细胞系（例如143B细胞）具有高亲和力和特异性⁵⁶H4-PEG-PT通过直接酰胺化和铜催化叠氮-烷基环加成反应进一步合成（图第5页). 叠氮-PEG₁₆-COOH首先与PT的胺基偶联，得到PEG-PT，然后H4通过Cu催化的点击反应与PEG-PT反应，得到H4-PEG-PT。归一化的紫外-可见光谱显示，H4-PEG-PT在~800 nm处具有最大吸收峰，在~1050 nm处具有最大发射峰（图5克和补充图^三). 同时，在~850 nm激发下，H4-PEG-PT也显示出强烈的反斯托克斯FUCL信号，最大发射峰为~580 nm（图5小时). H4-PEG-PT在水中容易形成超分子组装体，其平均长度为180.0±13 nm，平均宽度为48±15 nm，通过透射电子显微镜测定（TEM，图第5页). H4-PEG-PT在水中的NIR-II量子产率为0.1±0.03%。H4-PEG-PT在PBS和DMEM培养基中也表现出60分钟的高光稳定性（图第五版). 此外，羟基磷灰石（HA）沉淀物的荧光信号增强⁵⁷当HA（10 mg）与不同浓度的H4-PEG-PT（4、8、16、32和64µM）孵育4h.H4-PEG-PT在体外骨结合试验中显示出对HA的高亲和力，而在不含靶向配体PT的不同浓度H4的HA沉淀物中检测到低强度的荧光信号（图5b、c). 此外，通过143B细胞与H4-PEG-PT共同孵育，进一步证实了H4-PEG-PT与骨肉瘤的结合能力。在非阻断实验中观察到更高的荧光（左管，图5天)而在阻断实验中检测到可忽略的荧光（右管，图5天). 通过MTT试验在不同浓度（2、4、8、16和32µM）下对143B和L929细胞体外测定H4-PEG-PT的毒性（图第5页). 这些结果表明，水溶性、光稳定性和生物相容性NIR-II荧光探针H4-PEG-PT适用于骨肉瘤成像。

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图5

H4-PEG-PT的体外评估。

一通过酰胺化和点击反应合成H4-PEG-PT。b条不同浓度（4、8、16、32和64µM）的H4和H4-PEG-PT的羟基磷灰石（HA）结合荧光图像。c（c）用H4-PEG-PT孵育不同时间点的软骨切片的荧光图像。d日在808 nm激发（1000 LP和100 ms）下，143B细胞的NIR-II信号通过H4-PEG-PT（左）和H4-PEG-PT以及过量PT作为阻断剂（右）进行标记。e（电子）比较连续激光照射下H4-PEG-PT和ICG在不同介质中的稳定性。（f）不同浓度（2、4、6、8、16和32µM）的H4-PEG-PT对143B和L929细胞的细胞毒性（数据以平均值±SD表示，从n个 = 6个生物独立样本）。克H4-PEG-PT在水中785nm激发下的吸收和发射波长。小时H4-PEG-PT在850 nm激发下在水中的频率上转换发光（FUCL）。我H4-PEG-PT的TEM图像（比例尺：500 nm）。中的结果(我)是三个独立实验的代表。

3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT的FUCL细胞定位

进行了涉及线粒体追踪红（MTR）或线粒体追踪绿（MTG）的显色实验，以确认合成化合物的细胞内分布。具体而言，3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT在143B细胞中的亚细胞定位是通过MTG联合染色确定的，然后在共聚焦显微镜下成像，而3j-PEG的亚细胞分布是通过MTR（补充电影）联合染色观察的¹和补充电影²). 如图所示6a–e级发现不同浓度的3j-PEG、3k-PEG、H4-PEG或H4-PEG-PT的所有荧光图像与商业线粒体染料（MTR或MTG）的荧光图像重叠良好，表明这些合成染料具有线粒体靶向性。此外，我们发现，在相同的实验条件下，当浓度低于10 nM时，Mitotracker Green的荧光强度太弱而无法检测到，而1 nM的H4-PEG-PT仍然呈现清晰而强烈的荧光信号。NIR-II荧光共焦研究（图6和补充图⁶)证明3j-PEG、3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT被线粒体跨内膜摄取，并通过离域亲脂阳离子硫吡喃盐而非烷基三苯基鏻部分实现线粒体靶向。总之，3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT被证明是第一个D–A型FUCL硫吡喃菌线粒体靶向荧光团，具有非常理想的特性，包括线粒体靶向和低工作浓度。

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图6

线粒体定位。

一用3j-PEG（10μM）孵育8小时的143B细胞的荧光图像（左）；Mito tracker红色（中间）并合并它们的图像（右侧）。λ_{相对长度单位}：590–650纳米，λ_前任：594 nm（Mito-tracker红色）；λ_{相对长度单位}：490-540纳米，λ_前任：488纳米（3j-PEG）。b条在线粒体定位的3D荧光图像中合并3j-PEG和线粒体跟踪器红的图像。c（c）–e（电子）用Mito-tracker绿色培养143B细胞的荧光图像（左）c（c）3k PEG（1μM）或d日H4-PEG（1μM），或e（电子）H4-PEG-PT（1μM）持续6小时（中间），并分别合并图像（右侧）。λ_{相对长度单位}：495–526纳米，λ_前任：488 nm（Mito-tracker绿色）；λ_{相对长度单位}：610–660纳米，λ_前任：514 nm（3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT）。（f）143B细胞与线粒体-GFP（左）、H4-PEG-PT（中）孵育后的荧光图像，以及它们的合并图像（右）。λ_{相对长度单位}：495–526纳米，λ_前任：488 nm（线粒体-GFP）；λ_{相对长度单位}：610–660纳米，λ_前任：514 nm（H4-PEG-PT）。比例尺：10μm。中的结果(一–（f）)是三个独立实验的代表。

体内成像

通过原位注射绿色荧光蛋白（GFP）转染的143B细胞建立143B小鼠肿瘤模型。通过GFP发光和X射线成像监测原位肿瘤生长，直到关节近端胫骨被143B细胞吞噬（图第7页). 然后向143B荷瘤小鼠静脉注射H4-PEG-PT（200µg，200µL）。从NIR-II成像中，在6到48小时内，可以从周围的背景组织中清楚地分辨出143B个肿瘤（图第7页，1000 LP，250 ms）。与正常组相比，阻断组在所有时间点均观察到较低的荧光信号。H4-PEG-PT的NIR-II强度比（T/N）如补充图所示⁷12 h时，其T/N比值达到4.57±0.15。阻断实验证实了H4-PEG-PT对骨肉瘤的靶向特异性。在联合注射游离PT肽（2 mg）和H4-PEG-PT进行NIR-II成像后，肿瘤荧光信号在所有时间点均显著降低。通过体外生物分布研究（补充图⁸). 肝脏积聚的优势表明，肝胆系统是H4-PEG-PT清除的主要部位。通过定量测定不同时间点血液中的荧光强度来评估H4-PEG-PT在血液循环中的半衰期，如补充图所示⁹血液中随时间变化的相对荧光强度用一级指数衰减拟合，以评估血液半衰期。药代动力学曲线方程为年 = 0.061*exp（−X（X）/0.397) + 0.00994 (R（右）² = 0.989）和血液半衰期(吨_1/2)发现约0.4 h。此外，肿瘤对H4-PEG-PT的摄取在12 h达到最大值。组织病理学研究也通过体外NIR-II荧光成像和苏木精-伊红（h&E）组织染色进行（补充图⁹).

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图7

骨肉瘤体内成像。

一裸鼠原位143B肿瘤的X线和生物发光成像合并（左），裸鼠原位43B肿瘤的X射线成像合并（中），关节胫骨近端放大图像合并（右）（俯卧位）(n个 = 3只生物独立小鼠）。b条808nm激发（1000LP，3.5W，250ms）（仰卧位）下143B荷瘤小鼠（上）和阻断组（下）H4-PEG-PT的NIR-II信号(n个 = 3只生物独立小鼠）。

体外光热效应

近红外光学窗口中的光热疗法因其方便高效地使用近红外光，以及组织穿透深度更深和最大允许激光照射量更高的显著优势而受到越来越多的关注^58–61H4-PEG-PT暴露于808nm激光下，通过不同浓度的线粒体途径研究光热性能。1.6 W cm辐照后发生快速光热加热⁻²即使剂量为32µM（图第8页a). 当H4-PEG-PT浓度增加到64µM时，通过改变功率密度（1.4、1.6、1.8和2.0 W cm），在激光照射下温度显著升高⁻²)如附图所示^10安暴露在2.0 W cm的808 nm激光下⁻²12min后，H4-PEG-PT的温度升高到57°C，而在相同的激光照射下，纯水的温度仅略有升高。为了进一步研究H4-PEG-PT的光稳定性，将其重复加热-冷却循环80分钟（图8b个)表明在808 nm激光照射（2.0 W cm）下具有良好的稳定性⁻²). 然后，用808 nm激光照射143B细胞4分钟（1.8和2 W cm）⁻²)与不同浓度的H4-PEG-PT孵育后。当H4-PEG-PT浓度达到32µM或更高时，细胞明显受到破坏（图第8页c). 然而，未经808nm辐照的H4-PEG-PT对照组显示几乎100%的细胞存活率。H4-PEG-PT的光热转换效率为18%(η ≈ 18%）（补充图¹⁰)表明H4-PEG-PT可以高效、快速地将808nm的光能转化为热能。

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图8

体外光热效应和光诱导细胞毒性。

一不同浓度（200μL）的H4-PEG-PT在1.6 W cm激光功率下的光热加热曲线⁻².b条H4-PEG-PT（75μM，200μL）在几个开/关循环中，涉及808 nm激光（2.0 W cm）照射⁻²)持续80分钟，然后进行被动冷却。c（c）143B细胞与不同浓度的H4-PEG-PT孵育并暴露于不同激光功率密度后的细胞活力(n个 = 3个生物独立的样品）。d日H4-PEG-PT w/o 808nm激光照射143B细胞产生ATP，CCCP为阳性对照(n个 = 4或5个生物独立样本）。对照组ATP水平为100%。e（电子）JC-1荧光法测定H4-PEG-PT w/o 808nm激光照射143B细胞后线粒体膜电位，CCCP为阳性对照(n个 = 5或6个生物独立样本）。（f）用钙钴比色法研究808nm激光照射后H4-PEG-PT的线粒体通透性转变（MPT）。H（H）₂O（运行）₂治疗是阳性对照(n个 = 4个生物独立样本）。克–我Caspase多重活性测定试剂盒测定不同组Caspase-3/8/9活性(n个 = 3个生物独立样本）。j个不同组AIF、EndoG和Smac/Diablo的代表性western blot分析。k个分别对H4-PEG和H4-PEG-PT在808nm激发下进行光热治疗后的Caspase-9、Caspase-3、裂解Caspase-2（或活性Caspase-4）和裂解Caspase9（或活性Caspase-9）进行代表性western blot分析。我作为808nm光辐射时间的函数的DPBF在410nm处的相对吸收强度（单独的DPBF，分别与不同浓度的H4-PEG-PT孵育）。米–第页不同时间808nm辐照下DPBF溶液（单独DPBF或与不同浓度的H4-PEG-PT孵育）的吸收光谱。q个3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT联合808nm激光照射后12小时143B细胞的共焦图像。线粒体用MitoTracker Green染色，而Cytoc（红色荧光）用免疫荧光技术检测。比例尺：10μm。第页根据治疗变量，使用H4-PEG-PT和MitoSOX培养143B细胞的共焦荧光显微图像。比例尺：10μm。秒,吨143B细胞的凋亡或坏死由(秒)Annexin V-FITC/PI染色或(吨)Hochest/PI染色（比例尺：50μm）。使用双尾Student’s吨测试(c（c）–我). 数据以平均值±SD表示(c（c）–我). 中的结果(j个), (k个), (q个–吨)是三个独立实验的代表。

为了探讨近红外激光照射143B细胞H4-PEG-PT的潜在机制，研究了其对线粒体功能和凋亡的影响（图8d–f). 首先通过测定143B细胞中的ATP水平来评估线粒体功能（图8天). H4-PEG-PT或808nm辐射预处理后，ATP水平与对照组相似。近红外辐射处理下的H4-PEG-PT显著降低143B细胞ATP生成至~5.6%（图8天). JC-1分析进一步用于分析线粒体膜电位（ΔΨ_米). H4-PEG-PT（60μM）或近红外辐射处理3分钟后，J-聚集体与单体的比率没有显著降低。近红外辐射或羰基氰化物下用H4-PEG-PT（60μM）处理米-氯苯腙（CCCP）将143B肿瘤细胞的J聚集体与单体的比率分别降低到25%和63%（图第8页). 线粒体膜通透性的变化是细胞凋亡过程中的一个重要事件，由线粒体通透性转换（MPT）控制。在我们的实验中，钙黄绿素-AM钴分析用于鉴定MPT。实验结果表明，在808nm辐射下用H4-PEG-PT处理143B细胞3分钟后，143B细胞的钙黄绿素荧光强度远低于H₂O（运行）₂-诱导组（图第8页). 这些结果表明，H4-PEG-PT在近红外照射下会对癌细胞143B造成严重的线粒体生理功能障碍，而H4-PEG-PT或近红外单独照射不能损伤细胞。

在细胞凋亡过程中，细胞色素c（Cytoc）从线粒体释放到胞浆中，进一步激活了caspase依赖的凋亡途径，使细胞进入死亡过程⁶²为了进一步了解3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT的细胞毒性机制和线粒体靶向特性，用免疫荧光技术检测细胞c的亚细胞分布，用western blotting分析检测caspase-3和caspase-9及其活化片段的表达水平。3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT即使在1nM的细胞固定和通透性条件下也能很好地保留在线粒体内，结合808nm激光照射，在所有细胞中都能清楚地观察到细胞c的红色荧光。值得注意的是，在用H4-PEG-PT和808nm激光照射处理的组中观察到Cytoc的最高荧光（图第8季度，补充图¹¹). 这些结果进一步证明了合成的NIR-II探针的线粒体靶向光热效应。众所周知，caspase-9和caspase-3是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的重要成员，调节细胞凋亡，它们的顺序激活在线粒体介导的细胞凋亡途径中起着关键作用⁶³Western blot分析表明，H4-PEG-PT在808nm辐射（1W cm）下显著降低143B细胞的caspase-3和caspase-9蛋白水平⁻²，图8千). 随后，具有催化活性的胱天蛋白酶-3和裂解的胱天蛋白酶-9的表达显著增加。此外，通过caspase复合活性检测试剂盒，在近红外照射下，H4-PEG-PT组也观察到caspase-3/8/9活性增加（图8克–i). 我们的发现进一步支持H4-PEG-PT的细胞凋亡是由固有线粒体途径触发的。在死亡刺激下，凋亡早期释放不同的凋亡因子，如凋亡诱导因子（AIF）、核酸内切酶G（EndoG）和第二个线粒体衍生的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶/低pI直接IAP结合蛋白激活物（Smac/Diablo）。western blot检测线粒体凋亡的三种特征蛋白。从图第8页H4-PEG-PT组NIR照射后AIF和EndoG表达水平显著高于未经NIR光照射的同一组、对照组或NIR激光组。Western blotting结果表明，H4-PEG-PT照射后，AIF、EndoG和Smac/DIABLO从线粒体突然释放到细胞质中，提示线粒体和细胞代谢被破坏。然后通过1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）、二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和MitoSOX分析（图8升–磅, 第页和补充图¹²)^64,65在808nm辐射下，在H4-PEG-PT的任何组中均未观察到明显的体外活性氧。这是关于H4-PEG-PT光热应用的一个积极发现，因为PTT期间伴随产生的ROS已被证明会对细胞产生有害的副作用^66,67FITC-膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）检测通常用于鉴别早期和晚期凋亡与坏死。808nm激光照射3min后，H4-PEG-PT组细胞膜上不仅出现明显的FITC信号，还出现PI信号。然后进行Hochest/PT染色检测凋亡VS坏死或混合路径的参与。辐照下用H4-PEG-PT处理的143B细胞明显显示出凋亡染色（亮蓝色颗粒）。由于annexin V可以染色早期凋亡细胞，而PI可以染色死亡细胞或晚期凋亡细胞，Hochest可以用明亮的蓝色荧光染色凋亡细胞的细胞核，这两个结果表明，在辐照下用H4-PEG-PT处理的细胞同时发生凋亡和坏死（图8秒，吨).

H4和H4-PEG-PT的量子产率测量

为了测量氯苯中H4的相对量子产率，选择1,2-二氯乙烷（DCE）中IR-26（0.5%）作为参考。量子产率的计算公式如下：

选择OD0.1或OD0.1以下的五种不同浓度，并绘制IR-26和H4的积分荧光与吸光度的关系图。通过对斜率的比较，确定了H4的量子产率。

细胞系和动物模型

L929和HepG2细胞购自中国类型培养收集中心（CCTCC）。143B细胞取自武汉大学中南医院（中国湖北），购自美国型培养物收藏中心（ATCC）。将143B、L929和HepG2细胞与添加了10%胎牛血清（FBS）（Gibco，Grand Island，NY，USA）和1%（v/v）青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（美国纽约州格兰德岛Gibco）在37°C的含5%CO的湿化培养箱中培养₂通过胫骨内注射143B细胞（~5×10⁶在异氟醚麻醉下，将80μL PBS注入6周龄雌性Balb/c裸鼠（北京维他河实验动物技术有限公司）的左腿。当肿瘤体积达到400–800 mm时，对荷瘤小鼠进行成像^三（接种后约4-6周）。

MTT法测定H4-PEG-PT的细胞毒性

采用MTT细胞毒性试验对H4-PEG-PT对143B细胞和L929细胞进行体外细胞毒性研究。细胞以每孔5000到10000个细胞的密度接种在96个板子中。将细胞与含有H4-PEG-PT的100μL新鲜细胞培养基孵育48 h。实验中，培养基中H4-PEG-PT的最终浓度固定在0、2、4、8、16和32μM。然后将MTT（0.5 mg/mL）添加到每个孔（10μL）中，以转化为formazan（紫色）。将微孔板在37°C下培养4小时。然后，使用二甲基亚砜重新溶解甲素。Perkin Elmer VICTOR X4在490 nm处测量吸光度。采用以下公式计算细胞生长活力：细胞活力（%）=（治疗组吸光度值的平均值/对照组吸光度的平均值）×100。

细胞外和细胞内活性氧检测

用DPBF探针测量细胞外活性氧的生成。简单地说，将不同浓度的H4-PEG-PT（20、50、100μg，含有100μl EtOH溶液）添加到含有DPBF（10 mM）的3 mL乙醇溶液中，然后通过磁力搅拌将溶液保持在黑暗中，并用808 nm NIR激光照射不同时间段（0、2、4、6、8、10、12和14 min）。在410 nm吸收下收集光谱。

共焦激光扫描显微镜（CLSM）

将143B（50000个细胞）接种在圆形圆盘中，并在含有10%FBS的1mL DMEM培养基（pH=7.4）中培养24小时。用1mL新鲜培养基替换培养基后，分别添加3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT，并允许细胞培养6小时h.取出培养基，然后用PBS缓冲液（pH=7.4）冲洗三次，加入丝裂原追踪剂绿染色30分钟。在FV1200 CLSM（奥林巴斯）和徕卡SPE下观察细胞。

线粒体活性氧形成的检测

将143B细胞接种在15mm共聚焦培养皿上，使其稳定24h。然后用含有H4-PEG-PT（64μM）的培养基培养细胞6h，并用PBS洗涤三次。在有或无培养基的情况下培养30minN个-乙酰半胱氨酸（5 mM）置于1mL培养基中，用808 nm激光（1.0 W cm）照射细胞⁻²)持续5分钟。根据制造商的说明（Invitrogen），使用MitoSOX（1µM）染色试剂盒测定产生的ROS量。使用共焦荧光显微镜监测143B细胞的结果。使用488 nm的激发波长收集荧光，并在550–650 nm（红色）处记录发射。

细胞色素c的亚细胞分布

143B细胞以2×10的密度接种到8孔室覆盖玻璃系统中⁴每孔细胞数并培养24小时。添加3k-PEG、H4-PEG和H4-PEG-PT（32μM）。为了评估Cytoc的亚细胞分布，将经过和未经808nm激光照射的143B细胞进一步孵育48小时，然后添加200 nm MitoTracker Green染色线粒体。然后，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用1%BSA、22.52、mg/mL甘氨酸加入PBST（PBS+0.1%吐温20）中1 h。随后，使用一级抗细胞c单克隆抗体（Abcam，1:1000）和二级Alexa-647结合山羊抗兔抗体（Life Technologies，1:300）通过免疫荧光技术检查细胞。用hoechst 33342（Thermofisher Scientific，1:10000）染色后，用共焦显微镜（FLOVIEW FV1000，Olympus）观察不同处理下143B细胞中Cytoc的亚细胞分布。

蛋白质印迹分析和抗体

使用改良的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，1%NP-40替代物，0.25%脱氧胆酸钠，1mM氟化钠，1mM Na_三VO（旁白）₄，1 mM EDTA），补充蛋白酶抑制剂混合物（细胞信号）和1 mM苯甲烷磺酰氟或完整的迷你蛋白酶抑制剂片（罗氏）。根据制造商的说明，使用双辛酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（Pierce/Termo Scientific）测定等量的蛋白质，在SDS-PAGE凝胶上进行溶解，并转移到硝化纤维素或聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶粉或3%BSA在TBST（50 mM Tris-HCl，pH 7.4和150 mM NaCl，以及0.1%吐温20）中封闭斑点，然后用适当的一级抗体培养。用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体和增强化学发光（ECL）检测系统（Pierce）检测信号。对于生化分析，使用以下抗体：重组抗Smac/Diablo抗体（Abcam，1:1000，ab32023）；抗EndoG抗体（Abcam，1:1000，ab9647）；重组抗AIF抗体-线粒体标记（Abcam；1:1000，ab32516）；重组抗细胞色素C抗体（Abcam，1:1000，ab133504），次级Alexa-647结合山羊抗兔抗体（Life Technologies，1:300，{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“A27040”，“term_id”：“86388”，“term_text”：“pir||A27040“}}A27040型); HRP结合山羊抗狂犬病IgG H&L（HRP）（Abcam，1:2000，ab6721）；抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（细胞信号技术，1:1000，#9662S）、抗裂解半胱天冬酶-3（细胞信息技术，1:100，#9664S）、抗裂半胱天冬氨酸酶-9（细胞信号传递技术，1:11000，#9509S）、反半胱氨酸蛋白酶-9（单元格信号技术，1-1000，#9504S）和抗β-肌动蛋白抗体（Abcam，1:2000，ab179467）。

生物发光成像检测肿瘤

植入绿色荧光蛋白（GFP）转染的143B细胞的荷瘤小鼠接受10%水合氯醛麻醉，然后使用体内X射线成像系统（XTEREME BI，Bruker）进行全身实时生物发光成像。BLI信号的采集采用以下设置：480 nm激发和535 nm发射；曝光时间：1s；Bin：1×1像素；视野：7.2厘米；fStop:1.1；焦平面：0 mm。

体外骨靶向分析

为了评估H4-PEG-PT和H4的结合能力，将不同数量的探针（2、4、8、16、32和64μM，500μL）分别与HA（10 mg）在室温下温和搅拌培养4h。然后，将混合物以1200 rpm离心10 min，并用8倍过量的PBS洗涤三次。NIR-II图像由Series II 900/1700体内成像系统（中国苏州NIR-Optics Co.，Ltd.）采集。

肿瘤体内NIR-II荧光成像

将200微升H4-PEG-PT（200μg）静脉注射到荷瘤裸鼠体内。使用二维InGaAs阵列（苏州光学公司）采集NIR-II荧光信号，从而采集荧光图像。激发光由808nm二极管激光器提供。动物发出的光通过1000-nm长通滤波器过滤，用于NIR-II成像，并与InGaAs相机耦合。所有图像的曝光时间为250毫秒。

离体生物分布分析

器官和组织的离体荧光成像采用苏州光学NIR-II荧光成像系统，InGaAs相机的功率密度为~80 mW/cm²在808nm激光二极管照射下。注射H4-PEG-PT进行NIR-II成像48小时后，处死143B异种小鼠，采集主要器官的NIR-II图像。

组织学分析

取荷瘤小鼠的主要器官和肿瘤，用EDTA/福尔马林溶液固定。在包埋和切片后，用苏木精和伊红对组织样品进行进一步染色，然后使用NIKON Eclipse ci显微镜进行X 40和X 200倍放大成像。

光热转换效率的计算

共晶的光热转换效率是根据以前的方法确定的。

为了获得小时*S公司，无量纲驱动力温度，θ介绍如下：

因此，

当激光器关闭时，问_秒 = 因此为0<trans data-src="d">d日</trans><trans data-src="θ">θ</trans><trans data-src="d">d日</trans><trans data-src="t">吨</trans><trans data-src="=">=</trans><trans data-src="−">−</trans><trans data-src="θ">θ</trans><trans data-src="τ">τ</trans>,

在哪里？我是激光功率（2.0 W cm⁻²)A808是样品在808 nm（0.13）波长下的吸光度。T型_最大值 = 67.5°C，T型_表面 = 23.8摄氏度。

问_秒是与溶剂吸收光有关的热量。变量τ是采样系统时间常数米和C类是用作溶剂的去离子水的质量和热容。根据公式(²)和(^三)，的ηH4-PEG-PT的值被确定为~18%。

H4-PEG-PT对143B细胞的体外光热治疗

为了评估光热治疗效果，采用MTT法测量激光照射后细胞的存活率。将143B细胞接种在96 well板中，密度为5000或6000个细胞/孔，在标准细胞培养环境中培养12小时。在细胞中添加浓度为8、16、32和64μM的H4-PEG-PT。培养6 h后，用808 nm NIR激光（1.8和2.0 W cm）照射孔中的部分细胞⁻²)0和4分钟后，使用标准MTT法测量143B的细胞活力。

体内光热疗法

为了进行光热治疗，携带皮下143B肿瘤的裸鼠被随机分为三组(n个 = 每组4只）：（a）808 nm激光PBS注射组，（b）H4-PEG-PT注射组（200μL，400μg/只小鼠），（c）808纳米激光H4-PEG-PT注射组。对于（a）组和（b）组，注射后12 h，用功率密度为1.5 W cm的808 nm激光照射右侧肿瘤⁻²（注意：这种功率密度可能会导致皮肤损伤！）持续8分钟。在治疗期间，用数字卡尺每2天测量一次肿瘤的长度和宽度，持续2周。肿瘤体积（mm^三)通过以下公式计算：肿瘤体积=长度×（宽度）²/2.

道德声明

所有动物研究均按照中国动物福利委员会的《实验动物护理和使用指南》进行，并经中国武汉大学动物实验中心动物护理和利用机构委员会（IACUC）批准。

数据分析

所有统计数据均表示为平均值±标准偏差。采用Student t检验进行统计学差异分析，比较两组之间的差异。使用Gaussian 09程序（修订版D.09）软件进行量子化学计算，使用图像J（1.51j8）分析NIR-II图像。原点9用于分析光谱图像。所有统计分析均采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 20.0进行。

本工作得到了国家重点研发计划（2020YFA0908800）、国家自然科学基金（81773674、81573383）、深圳市科学技术研究基金（JCYJ20190808152019182）、湖北省科技创新重点项目、湖北省国家自然科学基金（2017CFA024、2017CFB711）、，武汉市科学技术局应用基础研究项目（2019020701011429）、西藏自治区科技计划项目重点项目（XZ201901-GB-11）、西藏科技厅地方发展基金（XZ202001YD0028C）、，成都中医药大学（CZYJC1903）、湖北省卫生委员会科研项目（WJ2019M177、WJ2019 M178）、中国奖学金委员会、中央高校基本科研业务费一级学科建设项目。