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Brain Res牛市。作者手稿；PMC 2021年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Brain Res牛市。2020年12月；165: 272–280.
2020年10月16日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.brainresbull.2020.10.12
预防性维修识别码：PMC7718081号
尼姆斯：美国国家卫生研究院1638483
PMID：33075417

慢性酒精暴露对酒精依赖大鼠伏隔核GLT-1和神经可塑性相关蛋白表达的影响

哈桑·阿哈达德,1 法瓦兹·阿拉萨马里,1,三 Balsam Alhamadani香脂,1 Woonyen Wong女士,1 理查德·贝尔,2,*和尤塞夫·萨里1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

慢性乙醇暴露导致中枢神经系统兴奋性和抑制性活动受损。这些损伤与谷氨酸能功能障碍有关，包括神经可塑性改变。本研究检测了雄性酒精依赖性P大鼠6周摄入乙醇（15%和30%v/v）对与神经可塑性和谷氨酸转运体-1（GLT-1）功能相关的蛋白表达的影响。后者调节突触内和突触外谷氨酸水平。我们重点研究伏隔核（Acb）的壳层和核心亚区；即外壳（AcbSh）和核心（AcbCo）。慢性乙醇暴露增加了p大鼠AcbSh中BDNF、Arc和磷酸化（p）突触后密度蛋白-95（p-PSD-95）的表达。此外，AcbSh中磷酸-神经型一氧化氮合酶（p-nNOS）与总nNOS的比值也增加。在AcbCo中未观察到BDNF、Arc和p-nNOS/nNOS比值的这些变化。此外，慢性乙醇暴露降低了AcbSh中GLT-1的表达。另外，头孢曲松（CEF）是一种已知的GLT-1上调因子，其治疗可消除慢性乙醇暴露对AcbSh中BDNF表达的影响。总的来说，本研究结果证实，慢性乙醇摄入以亚区特异性（即AcbSh而非AcbCo）方式调节包括BDNF、Arc和nNOS在内的活性相关突触蛋白。因此，中皮质边缘区谷氨酸能稳态和神经可塑性的改变可能是酒精使用障碍治疗的功能靶点。

关键词：乙醇依赖、谷氨酸、GLT-1、BDNF、Arc、nNOS、伏隔核

引言

大量证据表明，长期接触乙醇会导致中枢神经递质功能的改变，包括谷氨酸、乙酰胆碱（Ach）和多巴胺（DA）的功能。初级奖赏回路包括中层皮质边缘奖赏系统的亚区[例如，腹被盖区，VTA；伏隔核，Acb；前额叶皮层，PFC）(Ehrlich等人，2012年;He等人，2005年;Jeanes等人，2011年;Spiga等人，2014年;Uys等人，2016年). Acb因其在酒精使用障碍（AUDs）和物质使用障碍（SUDs）中的关键作用而被广泛研究(Heinze等人，2009年;Müller等人，2016年;Neasta等人，2011年). 其子区域，即核心（AcbCo）和外壳（AcbSh），通过不同的神经回路控制奖励行为，例如抑制或促进积极的寻求奖励行为(Augur等人，2016年;Keistler等人，2015年;Stefanik等人，2016年). 例如，谷氨酸能投射分别从mPFC的边缘前/扣带回和边缘下亚区延伸到AcbCo和AcbSh，前者促进和后者抑制寻药行为(卡利瓦斯，2009年;Scofield等人，2016年). 然而，这些神经回路的功能作用也具有药物特异性。例如，背侧mPFC（dmPFC：边缘前/扣带回）促进寻求可卡因和海洛因的行为，而腹侧mPFC:边缘下）抑制可卡因，但促进寻求海洛因的行为（Peters等人，2013年）。

在AcbSh中，乙醇通过重塑树突棘诱导神经可塑性变化，包括长而薄的棘的丢失[综述见参考文献(Chandler等人，2006年)]. 乙醇也会损害长期抑郁（LTD），并通过从LTD转换为长时程增强（LTP）诱导Acb化塑(Jeanes等人，2011年;Spiga等人，2014年). 乙醇诱导的神经递质系统改变通常与异常神经可塑性和神经病理学有关(Ji等人，2015年;Ji等人，2017年;Shillinglaw等人，2018年). 脑源性神经营养因子（BDNF）参与调节突触活动、神经可塑性和连通性(Grande等人，2010年). 研究表明，谷氨酸可能改变BDNF的功能，BDNF可以调节突触传递和神经可塑性(Martin和Finsterwald，2011年). BDNF上调囊泡谷氨酸转运体的mRNA和随后的蛋白表达，表明谷氨酸能神经传递可能受BDNF调节(Melo等人，2013年). BDNF和谷氨酸转运体的表达和/或功能均因乙醇暴露而发生不同的改变。例如，长期接触乙醇会下调GLT-1（其人类同源物是兴奋性氨基酸转运体2，EAAT2），这种效应与Acb细胞外谷氨酸增加有关(Alhaddad等人，2014b;Das等人，2015年). 然而，急性乙醇暴露增加了中央杏仁核（CeA）和内侧杏仁核（MeA）中BDNF mRNA的表达及其下游信号分子活性调节的细胞骨架相关蛋白（Arc），而乙醇戒断则导致BDNF-Arc信号通路的下调(Pandey等人，2008年). 暴露于吗啡等成瘾药物后，Arc蛋白表达也会发生不同的改变；具体来说，吗啡诱导的条件位置偏爱（CPP）上调了AcbSh中Arc的表达，而吗啡诱导CPP的恢复增加了AcbCo中的Arc表达(Lv等人，2011年).

BDNF和Arc的表达受多种信号通路调节，包括细胞内和细胞外一氧化氮（NO）通路(Riccio等人，2006年). 一氧化氮合酶（NOS），特别是神经元亚型（nNOS）与耐受性的发展密切相关(Khanna等人，1993年;Khanna等人，1995年)和致敏作用(伊扎克和马丁，2000年;Santos-Rocha等人，2018年)到乙醇。此外，慢性乙醇暴露刺激N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体，NMDA受体通过突触后密度蛋白-95（PSD-95）与nNOS连接(Sattler等人，1999年). 这将激活nNOS并随后产生NO(Chandler等人，1997年;Spanagel等人，2002年). 此外，与野生型小鼠相比，nNOS基因敲除小鼠的自愿乙醇摄入量要高得多，这表明nNOS在调节乙醇摄入的神经行为效应中发挥了作用(Spanagel等人，2002年). 总之，这些研究表明谷氨酸能系统、BDNF Arc信号传导以及NO途径在AUD的发展和维持中。目前的研究检查了摄入乙醇对神经可塑性相关蛋白（BDNF、Arc、nNOS和PSD-95）的影响，并确定了这些蛋白与AcbSh和AcbCo内GLT-1表达变化之间的关联。

材料和方法

动物模型

雄性P大鼠被安置在一个保持21°C、12/12小时光/暗循环的房间中。老鼠可以自由获得水和食物。所有实验程序均由印第安纳大学医学院（印第安纳波利斯，印第安纳州）动物护理与使用委员会（IACUC）根据美国国立卫生研究院IACUC的指南和《实验动物护理和使用指南》批准。

乙醇摄入范式

大鼠在90天大时被随机分为两组：水对照组和乙醇暴露组。对于乙醇初始组（n=8），大鼠在整个暴露过程中只接触水和食物，并被视为水对照组。对于乙醇组（n=8），大鼠连续接触自由选择的乙醇（15%和30%，v/v，同时可用）6周；这会导致药物相关的血液乙醇浓度（50–200 mg%）[有关审查，请参阅参考文献(Bell等人，2006年)]. 每天测量乙醇摄入量（g乙醇摄入额/kg体重/天）。第6周的平均乙醇摄入量为6.87±0.41 g/kg/天(图1). 根据乙醇依赖发展的标准，将平均乙醇摄入量≤4 g/kg/天的大鼠排除在研究之外(Bell等人，2012年;Li等人，1987年;Sari和Sreemantula，2012年).

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P大鼠的乙醇消耗。

雄性P大鼠（n=8）在6周内的平均乙醇摄入量（g/kg/24小时），连续免费摄入0、15%和30%乙醇[经出版商许可(Alhaddad等人，2020年)]. 摄入<4 g/kg/天的P大鼠不符合乙醇依赖性发展的标准，因此被排除在研究之外。

脑组织提取

在第6周的最后一天，在中午左右将所有P大鼠从笼子中取出，并通过吸入CO2快速安乐死，然后用断头台快速斩首，因此没有乙醇戒断期。大脑被分离出来，立即冷冻在干冰上，并储存在−80°C下。使用低温恒温器（−20°C）解剖AcbCo和AcbSh。我们使用手术刀片根据Paxinos和同事的大鼠脑立体定向图谱提供的立体定向坐标，按照可视化的标志点，对大脑区域进行微穿孔和隔离(Paxinos等人，2007年). 将AcbCo和AcbSh保持在−80°C下，用于随后的蛋白质印迹分析。

Western blot程序

Western blot用于测定先前发表的AcbCo和AcbSh中GLT-1、BDNF、Arc、磷酸化nNOS（p-nNOS）、总nNOS、磷酸化PSD-95（p-PSD-95）、PSD-95和β-微管蛋白的蛋白表达(Alasmari等人，2017年;Hammad等人，2017年;Sari等人，2009年). 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液生成AcbCo和AcbSh匀浆。每个组织样品中的蛋白质量使用洗涤剂兼容蛋白质分析法进行量化（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。聚丙烯酰胺凝胶（10%）装载有来自每个裂解物的等量蛋白质；然后用电泳分离蛋白质。蛋白质从凝胶电泳转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下，在含吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水中的5%游离脂肪乳中培养膜1小时。然后在4°C下将膜与适当的一级抗体孵育过夜：抗GLT-1（1:5000，Abcam，ab41621）、抗BDNF抗体（1:500；Abcam，ab108319）、抗电弧抗体（1:1000；Abcam；ab183183）、抗nNOS（1:1000，Abcan，ab76067）、抗p-nNOS；Abcam ab76115）。使用抗β-微管蛋白作为负荷控制抗体（1:1000；BioLegend）。第二天，在室温下将膜与匹配的二级抗体（1:5000）孵育90分钟。用TBST清洗膜并干燥以进行进一步分析。将干燥的膜与化学发光试剂（Super Signal West Pico，Pierce Inc.）培养1-2分钟。使用GeneSys成像系统开发数字化印迹图像。ImageJ软件用于量化和分析GLT-1、BDNF、Arc、p-nNOS、nNOS，p-PSD-95、PSD-95和β-微管蛋白的表达。水对照组（乙醇对照组）的数据为100%（相对于水对照组），以评估这些相关蛋白表达的变化，如之前的研究所做的那样(Alasmari等人，2018年;Devoto等人，2013年;Koehler等人，2019年;Li等人，2003年;拉瓦尔等人，2003年;张和谭，2011年).

统计分析

进行双向方差分析，然后进行Bonferroni事后检验，以进行统计分析。使用Graph Pad Prism软件，使用处理（乙醇vs水）和位置（AcbCo vs AcbSh）的双因素方差分析来检测每个因素的主要影响以及因素之间的相互作用。在头孢曲松（CEF）试验中，采用双向重复测量方差分析（ANOVA）试验和Bonferroni事后多重比较试验来比较乙醇-盐水组和乙醇-CEF组的乙醇饮用行为。最后，我们采用单因素方差分析（ANOVA）和Newman-Keuls多重比较试验，比较了水对照组、乙醇盐水组和乙醇-CEF200组BDNF和Arc的蛋白表达。第页-0.05或更低的值表示具有统计学意义。

结果：

慢性乙醇摄入对AcbSh和AcbCo中BDNF表达的影响

我们进一步测量了连续6周的乙醇消耗对AcbSh和AcbCo中BDNF表达的影响(图2). 双向方差分析显示治疗的主要疗效显著[F（1,26）=5.97，p=0.021]。Bonferroni事后测试显示，与水对照组相比，乙醇组AcbSh中BDNF的表达显著增加（p<0.05），而AcbCo中BDNF的表达没有显著变化(图2B).

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六周乙醇摄入对AcbCo和AcbSh中BDNF蛋白表达的影响。

（A）AcbCo（左图）和AcbSh（右图）中水对照组与乙醇组BDNF和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。（B）统计分析显示，与水对照组相比，乙醇组AcbCo中BDNF蛋白的表达没有显著变化。长期饮酒后，AcbSh中BDNF蛋白表达显著上调。数据显示为平均值±SEM；（*p<0.05）；（每组n=7-8）。

慢性乙醇摄入对AcbSh和AcbCo中Arc表达的影响

我们还确定了连续6周的乙醇消耗对AcbSh和AcbCo中Arc表达的影响(图3). 统计分析表明，治疗有显著性趋势[F（1,28）=3.78，p=0.06]，而部位[F（1.28）=0.01，p=0.89]对Arc表达无明显影响，Bonferroni事后分析显示，与水分控制值相比，乙醇在AcbSh中的Arc表达显著增加（p<0.05），但在AcbCo中没有显著增加(图3B).

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六周乙醇摄入对AcbCo和AcbSh中Arc蛋白表达的影响。

（A）AcbCo（左图）和AcbSh（右图）中水对照组和乙醇组的Arc和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。（B）统计分析显示，与水对照组相比，乙醇组AcbCo中的Arc蛋白表达没有显著变化。长期摄入乙醇后，AcbSh中的Arc蛋白表达显著上调。数据显示为平均值±SEM；（*p<0.05）；（每组n=8）。

慢性乙醇摄入对AcbSh和AcbCo中p-nNOS和t-nNOS表达的影响

我们研究了连续摄入乙醇（15%和30%，v/v，同时可用）6周的p大鼠AcbSh和AcbCo中磷酸化-nNOS（p-nNOS）和总-nNOS的表达(图4). 双向方差分析显示，位置对p-nNOS的表达有显著的主效应[F（1,28）=6.58，p=0.016]和t-nNOS[F（1.28）=4.30，p=0.047](图4A,​，B）。B类). 事后测试表明，与水对照组相比，乙醇显著降低了AcbSh中nNOS的表达（p<0.05），但AcbCo中没有(图4B)而两个Acb区域的p-NOS表达没有显著变化。因此，与水对照组相比，乙醇组的AcbSh（而非AcbCo）的p-nNOS/nNOS比率显著增加（p<0.05）。

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六周乙醇摄入对AcbCo和AcbSh中p-nNOS和t-nNOS蛋白表达的影响。

（A）水对照组和乙醇组AcbCo和AcbSh（上面板）中p-nNOS和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。统计分析显示，与水对照组（下面板）相比，乙醇组AcbCo或AcbSh中的p-nNOS蛋白表达没有显著变化。（B）水对照组和乙醇组AcbCo和AcbSh中t-nNOS和β-微管蛋白的代表性免疫印迹（上面板）。统计分析显示，乙醇组的AcbCo中的t-nNOS蛋白表达没有显著变化，而慢性乙醇显著下调了AcbSh中的t-nNOS蛋白表达（下图）。（C）统计分析表明，在AcbSh中饮用乙醇后，p-nNOS/t-nNOS比率显著增加，但AcbCo中没有。通过将来自同一western印迹膜的p-nNOS的表达除以t-nNOS来计算比率。数据显示为平均值±SEM；（*p<0.05）；（每组n=8）。

慢性乙醇摄入对AcbSh和AcbCo中p-PSD-95和总t-PSD-95表达的影响

双向方差分析显示位置[F（1,28）=9.15，p=0.005]对Acb中p-PSD-95的表达有显著影响，但仅对治疗有显著影响的趋势[F（1.28）=3.78，p=0.06](图5A). 事后测试表明，与水对照组相比，乙醇暴露组的AcbSh中p-PSD-95的表达显著增加（p<0.05），而AcbCo中没有差异(图5A). AcbSh或AcbCo中t-PSD-95总量未改变(图5B). 尽管如此，乙醇对Acb亚区的p-PSD-95/PSD-95比率没有显著影响(图5C).

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六周乙醇消耗对AcbCo和AcbSh中p-PSD-95和t-PDS-95蛋白表达的影响。

（A）水对照组和乙醇组AcbCo和AcbSh（上面板）中p-PSD-95和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。统计分析显示，AcbCo中的p-PSD-95蛋白表达没有显著变化，而AcbSh中的p-PSD-95蛋白质表达显著上调（下表）。（B）水对照组和乙醇组AcbCo和AcbSh（上面板）中PSD-95和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。统计分析显示，饮酒后AcbCo或AcbSh中PSD-95蛋白表达没有显著变化（下表）。（C）统计分析显示，与水对照组相比，乙醇组的AcbCo或AcbSh的p-PSD-95/PSD-95比率没有显著变化。该比率是通过将相同的western印迹膜上的p-PSD-95的表达除以PSD-95来计算的。数据显示为平均值±SEM；（*p<0.05）；（每组n=8）。

慢性乙醇摄入对AcbSh和AcbCo中GLT-1表达的影响

我们测量了GLT-1在P大鼠的AcbCo和AcbSh中的表达，这些大鼠给予了6周的自由选择，分别获得15%和30%的乙醇以及水（同时可用）和仅水(图6). 双向方差分析显示治疗[F（1,26）=4.86，p=0.036]和部位[F（1.26）=6.09，p=0.020]对GLT-1表达有显著的主要影响。Bonferroni试验显示，与水对照组相比，乙醇组的AcbSh中GLT-1的表达显著降低（p<0.05），而AcbCo中没有显著差异(图6B).

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六周乙醇摄入对AcbCo和AcbSh中GLT-1蛋白表达的影响。

（A）AcbCo（左图）和AcbSh（右图）中水对照组和乙醇组GLT-1和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。（B）统计分析显示，与水对照组相比，乙醇组AcbCo中GLT-1蛋白的表达没有显著变化，而与水控制组相比，酒精组AcbSh中GLT-1蛋白的表达显著下调。数据显示为平均值±SEM；（*p<0.05）；（每组n=6-8）。

头孢曲松治疗对AcbSh乙醇和水分消耗及BDNF和Arc蛋白表达的影响

有人提出，100或200 mg/kg剂量的CEF通过上调P大鼠GLT-1，至少在一定程度上减弱了P大鼠的乙醇饮用行为(Das等人，2015年;Qrunfleh等人，2013年;Sari等人，2011年). 因此，我们旨在研究CEF治疗（200 mg/kg）对乙醇诱导的神经可塑性蛋白变化的影响。两组P大鼠（n=5–6/组）可在24小时内自由接触0、15%和30%的乙醇，为期5周。在第6周的第1天，一组每天注射CEF（200 mg/kg，i.p.）5天。另一组接受等量的生理盐水静脉注射，持续5天。另一组P大鼠（n=6/组）仅接触水，作为水对照组。所有大鼠在第6天被安乐死。乙醇和水的消耗量如前所述计算(Alhaddad等人，2014b;Sari等人，2011年). 使用双向RM方差分析和bonferroni多重比较试验进行的统计分析表明，与乙醇-盐组相比，CEF（200 mg/kg，i.p.）治疗在第3天到第6天显著减少了乙醇饮用量[F（6,54）=7.99，p<0.01]，如图7A在第3天到第6天，与乙醇-盐组相比，乙醇-CEF组的摄水量显著增加[F（6,54）=7.99，p<0.001](图7B). 重要的是，乙醇CEF组的BDNF蛋白表达与乙醇盐水或水对照组相比没有显著差异(图7C)尽管与水对照组相比，乙醇-盐组BDNF的表达显著高于水对照组[F（2,17）=4.05，p<0.05]，图7D然而，与乙醇-盐组相比，CEF治疗并未影响Arc蛋白的表达[F（2,17）=4.13，p<0.05]。这些数据表明，CEF可能有助于神经可塑性相关蛋白的正常化，这些蛋白可能会受到AcbSh长期乙醇暴露的影响。

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头孢曲松治疗对AcbSh乙醇和饮水行为以及BDNF和Arc表达的影响。

（A）与生理盐水治疗组（n=5-6/组）相比，CEF（200 mg/kg，i.p.）治疗显著降低了第3天到第6天的乙醇消耗量。（B）与生理盐水治疗组相比，CEF组在第3天到第6天的耗水量显著增加（n=5-6/组）。（C）AcbSh（上面板）中水对照组、乙醇-盐（盐水）组和乙醇-CEF 200（CEF 200）组BDNF和β-微管蛋白的代表性免疫印迹。统计分析显示，与水对照组相比，乙醇盐水组的BDNF表达显著增加。与乙醇-盐和水对照组（下面板）相比，CEF 200组的BDNF表达没有显著变化。（D）AcbSh中水对照组、生理盐水组和CEF 200组的Arc和β-微管蛋白的代表性免疫印迹（上面板）。统计分析显示，与水对照组相比，乙醇-盐和乙醇-CEF 200组的Arc表达显著增加。CEF 200和生理盐水组（下面板）之间的表达没有显著变化。数据显示为平均值±SEM；（*p<0.05，**p<0.01和***p<0.0001）；（每组n=6）。

讨论

本研究表明，长期饮酒对P大鼠的AcbSh和AcbCo有不同的影响。具体而言，结果显示，6周的自愿乙醇摄入诱导BDNF、Arc和p-PSD-95蛋白表达上调，以及p-nNOS/nNOS比率增加，同时下调AcbSh中GLT-1的表达。然而，我们没有发现AcbCo中这些蛋白的表达有任何变化。这些结果进一步支持了Acb分区域在调节乙醇消耗方面的离散作用。AcbSh中GLT-1的下调与之前的研究一致，研究表明慢性乙醇暴露降低了Acb中GLT-1的表达(Alhaddad等人，2014b;Das等人，2015年)，以及Acb细胞外谷氨酸浓度增加(Das等人，2015年;Melendez等人，2005年). 我们最近还报道了慢性乙醇摄入导致幼年（21–30天龄）P大鼠AcbSh而非AcbCo中GLT-1的下调(Althobaiti等人，2019年)和高酒精依赖（HAD）大鼠(阿拉斯玛丽等人，2020年). 目前的结果和先前的研究表明，慢性乙醇会导致中脑皮质边缘区谷氨酸稳态的失调。

此外，数据显示，长期饮用乙醇后，AcbSh中BDNF蛋白表达增加，但AcbCo中没有增加。在谷氨酸能突触，BDNF通过NMDAR激活对突触调制和神经可塑性诱导过程进行合成依赖性调节(小岛等，2002年). 值得注意的是，与不偏爱酒精的NP大鼠相比，P大鼠在Acb中BDNF的蛋白表达较低(Yan等人，2005年). 此外，其他研究表明，BDNF的表达会根据评估的大脑区域和乙醇暴露的时间长短而发生不同的变化。例如，单剂量的乙醇诱导小鼠背侧纹状体BDNF mRNA表达增加，而6周的乙醇饮用与大脑皮层BDNF蛋白表达降低有关，但与背侧和腹侧纹状体BDNF蛋白质表达均无关(Logrip等人，2009年). 此外，慢性乙醇自给增加了远交大鼠背外侧纹状体BDNF的表达，而非背内侧纹状体(Jeanblanc等人，2009年). 此外，暴露于乙醇后，雄性C57BL/6小鼠背侧纹状体BDNF的mRNA表达增加(McGough等人，2004年). 有趣的是，已有研究表明，通过红藻氨酸或NMDA激活谷氨酸受体，可以增加BDNF的表达和合成，这两种方法都适用在体外和体内化验(Zafra等人，1991年). 我们认为，由于AcbSh中GLT-1表达的减少，谷氨酸活性的增加可能是BDNF表达增加的部分原因。我们的发现证实了这一点(图7C)这揭示了已知上调GLT-1的CEF可能与AcbSh慢性乙醇暴露后BDNF表达的正常化有关。

值得注意的是，BDNF被发现通过Erk1/2-CREB-Elk-1途径调节Arc表达(Ramanan等人，2005年;Waltereit等人，2001年;Ying等人，2002年). Arc是一种与体细胞和树突内的神经可塑性有关的即刻早期基因(Guzowski等人，2006年). 研究表明，应激条件会增加Arc的表达，从而巩固神经可塑性和长期记忆(Guzowski等人，2000年;Ons等人，2004年;Plath等人，2006年). BDNF还通过酪氨酸激酶受体（TRKB）介导的磷酸化和Erk1/2活化诱导Arc表达增加（Davis等人，2000；Waltereit等人，2001年;Yin等人，2002年). (Pandey等人，2008年)提示BDNF和Arc信号传导的增加与乙醇的抗焦虑作用有关，可能通过神经肽Y（NPY）活性，而BDNF和Arc信号传导的减少与乙醇戒断的抗焦虑作用有关(Pandey等人，2008年). 在其他研究中，AcbSh内Arc蛋白水平的增加表明该区域的突触激活(Steward等人，1998年). 此外，NMDA受体的激活似乎是合成Arc mRNA并将其靶向树突内刺激的突触区域所必需的，这表明原位（即树突/突触）翻译(Steward等人，1998年;Steward和Worley，2001年). 同样，来自NMDA和AMPA谷氨酸受体的集成信号对电弧的产生至关重要(Rao等人，2006年). 因此，目前和以前的研究结果表明，谷氨酸神经递质的增加与乙酰胆碱酯酶中BDNF-Arc信号活性的增加有关，这可能调节由酒精摄入和随后的戒断引起的焦虑样行为(Pandey等人，2008年).

在本研究中，由于p-NOS/nNOS比值增加，摄入乙醇6周后AcbSh中nNOS的活性增加，这表明NO生成增加(Hinchee-Rodriguez等人，2013年;Kar等人，2015年). 已知nNOS衍生NO通过cGMP、蛋白激酶G和ERK途径诱导参与突触变化的蛋白质来调节突触可塑性(Gallo和Iadecola，2011年a). 研究揭示了nNOS在乙醇依赖和戒断方面的矛盾作用。例如，尽管nNOS KO小鼠的乙醇消耗量高于野生型小鼠(Spanagel等人，2002年)，脑室内nNOS反义寡核苷酸导致大鼠酒精摄入减少(Naassila等人，2000年)和小鼠体内的乙醇相关CPP(Itzhak等人，2009年). 有趣的是，nNOS衍生的NO产生对体外GLT-1的下调至关重要(Yamada等人，2006年). 此外，线索诱导的苯丙胺和古柯碱寻求行为与谷氨酸释放增加有关，谷氨酸释放对通过激活Acb中的nNOS生成NO也至关重要(Siemsen等人，2020年;Smith等人，2017年). 这些研究支持了我们的发现，GLT-1表达减少与长期饮用p大鼠AcbSh中nNOS活性增加相关（即nNOS磷酸化导致p-nNOS/nNOS比率升高）。此外，我们实验室的一项最新研究发现，6周的酒精摄入降低了AcbSh中糖皮质激素受体（GR）-αmRNA的表达，而AcbCo中GR-βmRNA表达降低(Alhaddad等人，2020年). 另外，慢性乙醇暴露与AcbSh的炎症反应相关，而与HAD大鼠的AcbCo无关，使用β-内酰胺类抗生素（氨苄西林/舒巴坦）可能通过调节GLT-1的表达来恢复乙醇诱导的炎症反应(阿拉斯玛丽等人，2020年). 我们研究中nNOS表达改变的这些发现表明，慢性乙醇摄入可能与AcbSh的神经炎症有关。

目前的结果表明，摄入乙醇6周后，AcbSh中BDNF、Arc和p-PSD-95蛋白表达增加。PSD-95参与活动依赖性突触可塑性的突触重塑、稳定和调节(Maletic-Savatic等人，1999年;Migaud等人，1998年). 研究表明，PSD-95介导了几种乙醇饮用行为；例如，PSD-95功能缺失后，乙醇饮用量减少，对乙醇的某些急性中毒作用过敏(Camp等人，2011年). 其他研究表明，刺激NMDA受体（乙醇相关效应）会激活nNOS并产生NO(Bredt和Snyder，1990年;Brenman等人，1996年). 这种激活可能通过PSD-95活性介导，因为nNOS-PSD-95途径介导突触后nNOS活性(周和朱，2009). 此外，nNOS衍生NO增加了体外皮层神经元培养物中BDNF和Arc的表达（Gallo和Iadecola，2011b），这证实了NO信号在神经可塑性中的作用(Lu等人，1999年;O'Dell，1991年;舒曼和麦迪逊，1991年). 有人认为BDNF和NO对突触可塑性至关重要(Biojone等人，2015年). BDNF通过对TRKB的作用上调nNOS的表达并增加NO的产生(Biojone等人，2015年)以及CREB依赖性基因表达增加，导致突触增强(Hardingham等人，2013年;诺特等人，2008年). 这些研究表明，BDNF的翻译后修饰通过NO-依赖途径减少了BDNF对突触强度的影响。类似地，NO通过BDNF和/或TRKB的NO衍生硝化作用，作为一种负反馈机制，降低BDNF在其受体（TRKB）的功效。此外，NO和BDNF共同作用诱导TRKB的硝化或磷酸化，从而激活或停用TRKB的特定下游细胞途径(Biojone等人，2015年). 因此，AcbSh中BDNF和Arc表达以及nNOS活性的增加可能调节与慢性乙醇摄入相关的神经可塑性(图8). 然而，先前的一项研究表明，头孢曲松在患有肺炎球菌脑膜炎的动物的海马和额叶皮层中没有诱导任何BDNF水平的变化(Barichello等人，2014年). 需要更多的研究来研究头孢曲松对AcbSh和AcbCo中BDNF的影响。

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示意图总结了慢性乙醇摄入对AcbSh中GLT-1、NO通路、BDNF和Arc表达的影响。慢性乙醇摄入增加突触谷氨酸浓度主要是由于GLT-1（GLT-1a和GLT-1b亚型）和胱氨酸/谷氨酸交换转运蛋白（xCT）表达的下调(Alhaddad等人，2014a;Das等人，2015年). 长期饮用乙醇也会增加NO系统活性、BDNF-Arc表达和PSD-95。NO可能通过CREB-BDNF-Arc通路和PSD-95的泛素化调节AMPA受体突触后GluA1亚单位的结合。此外，慢性乙醇暴露通过上调炎症介质如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）和TNF-α，与炎症反应增加相关(阿拉斯玛丽等人，2020年).

结论和未来方向

总之，P大鼠长期饮酒导致AcbSh中GLT-1表达降低，细胞外谷氨酸水平可能升高，这可能导致NMDA受体过度刺激，PSD-95-nNOS活性增加。如本研究所观察到的，这种活性可导致BDNF和Arc的表达增加。这种BDNF Arc信号通路反过来调节突触可塑性和神经元连接。然而，这种神经可塑性可能导致AcbSh内的连接模式不一致，从而导致谷氨酸稳态的破坏，正如先前的工作和本研究所示。然而，CEF治疗与BDNF表达正常化趋势相关。根据我们之前的发现，在AcbCo中未观察到这些变化。因此，酒精饮用的维持可能是通过AcbSh中失调的神经通路来维持的，AcbSh是中层皮质边缘奖赏神经回路的关键脑区(Augur等人，2016年;Keistler等人，2015年). 未来的研究需要调查长期CEF治疗对酒精暴露动物AcbSh中BDNF、Arc、p-nNOS、nNOS和p-PSD-95表达的影响。

​

集锦

  • 慢性乙醇暴露增加了P大鼠的BDNF和Arc，并降低了Acb-shell中的GLT-1。
  • 慢性乙醇暴露增加了Acb-shell中的磷酸神经元NO合酶。
  • 头孢曲松标准化BDNF表达对抗Acb-shell中乙醇摄入的影响

基金

本研究得到了来自的拨款AA019458（Y.Sari）、AA013522和AA015512（R.L.Bell）的支持。作者感谢国家酒精滥用和酗酒研究所[AA019458（Y.Sari）、AA013522和AA015512（R.L.Bell）]和沙特国王大学国际科学伙伴计划ISPP[ISPP-146]资助这项研究工作。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。在以最终形式出版之前，手稿将经过文案编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于期刊的所有法律免责声明都适用。

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作者声明没有利益冲突。

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