美托洛尔通过上调H9C2细胞AKT1–SERCA2级联反应减轻精氨酸加压素诱导的心肌细胞肥大

摘要

背景

病理性心脏肥大与代谢紊乱、肌节紊乱、钙处理改变以及持续病理性肥大相关，导致心律失常、充血性心力衰竭和猝死[1,2]. 许多神经体液因子，如儿茶酚胺、血管紧张素II和内皮素-1，可导致病理性心肌肥大[三,4]. 精氨酸加压素（AVP）是下丘脑根据动脉压和血浆渗透压的变化而释放的，许多先前的研究表明，AVP可引起外周血管收缩和心脏肥大[5–7].

丝氨酸/苏氨酸AKT蛋白激酶，也称为PKB或Rac，由三个亚型组成：AKT1、AKT2和AKT3。AKT1广泛分布于许多组织，AKT2主要表达于肌肉和脂肪细胞，AKT3特异性表达于睾丸和大脑[8]. AKT调节与细胞生长和存活、分化、增殖、生长和代谢有关的几个生物过程[9]. 由于AKT在心脏生长、血管生成和心肌肥大中的作用，AKT也是心血管疾病的重要促因。激素和细胞因子是AKT信号的经典激活剂[10]在病理性肥大中，神经内分泌因子伴随持续超载的生物力学应激诱导PKC、MAPK和AKT等多种信号通路[2].

病理性心肌肥大与心肌收缩力直接相关[11]. 细胞内游离钙增加是心肌细胞收缩的主要原因[12]. 在肥厚心肌细胞中，细胞内收缩钙²⁺舒张钙降低²⁺增加，随后引发一系列病理生理反应。钙的储量²⁺肌浆网（SR）是影响心肌收缩的基本因素。研究表明，心力衰竭（HF）、心肌缺血和其他心脏病都伴随着钙的减少²⁺存储在SR中[13–15]. 肌浆/内质网钙²⁺-ATP酶（SERCA）是心脏SR-Ca的一种类型²⁺-ATP酶在心肌细胞钙稳态调节中起重要作用[13,16]. 在舒张过程中，心肌细胞内的钙主要通过肌浆网膜中的SERCA2被重新吸收到SR中，而磷蛋白（PLN）在调节SERCA2活性中起主要作用。当PLN去磷酸化时，PLN与SERCA2结合形成PLN–SERCA2复合物，这降低了SERCA2对Ca的亲和力²⁺当PLN被磷酸化时，PLN–SERCA2复合物解离，SERCA2重新获得其Ca²⁺-结合能力[17].

美托洛尔（Metoprolol，Met）是一种广泛用于抑制心肌肥厚和改善心脏功能的β受体阻滞剂[18,19]. 奈比洛尔是一种第三代β受体阻滞剂，在新生儿心肌细胞肥大模型中具有抗肥大作用[20]. AKT参与β肾上腺素能刺激的糖尿病和抗凋亡作用[21,22]. 然而，AKT是否在心肌肥厚期间介导Met的抑制作用尚不清楚。此外，Met减轻心肌细胞肥大的具体机制亟待研究。因此，我们进行了这项研究，以确定介导AVP诱导肥大的潜在参与者以及Met的保护作用。我们的结果揭示了在AVP诱导的病理性心肌肥厚中Met和AKT1–SERCA2信号通路之间的关系。

结果

AVP对H9C2细胞的增殖作用

我们最初通过将H9C2细胞暴露于AVP 48小时来建立心肌细胞肥大模型。罗丹明-球蛋白（F-actin）染色和定量结果表明，用AVP处理细胞时，细胞表面积增加（平均是对照处理细胞的1.265倍）（图1a、 b）。在AVP刺激的H9C2细胞中，心肌细胞肥大标志物心钠素（ANP）、B型钠尿肽（BNP）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）的mRNA表达水平显著增加（图1c） ●●●●。

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图1

AVP导致H9C2细胞肥大表型。一采用F-actin染色（比例尺=200μm）检测AVP处理的H9C2细胞的肥大生长。b条AVP刺激的H9C2细胞表面积的量化。c（c）测定AVP刺激H9C2细胞ANP、BNP和β-MHC mRNA水平。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M*与对照组相比P<0.05（续）

AKT1可能参与AVP诱导的H9C2细胞肥大

为了探讨AVP诱导H9C2细胞心肌肥大的潜在机制，我们使用western blot分析相关蛋白的表达水平。与对照组相比，暴露于AVP 48小时导致总AKT（0.65倍）、P-AKT1-Thr308（0.70倍）和AKT1（0.74倍）水平显著降低，而AKT2和P-AKT2（Ser474）水平没有改变（图2a、 b，附加文件1：图。S1）。

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图2

在AVP诱导的肥大H9C2细胞中，AKT1下调。一通过western blot分析测定AVP处理的H9C2细胞中总AKT、AKT1、磷酸化AKT1（P-AKT1）、AKT2和P-AKT2的表达。GAPDH作为负荷控制。b条AVP诱导的H9C2心肌细胞中总AKT、AKT1、P-AKT1、AKT2和P-AKT2的蛋白表达的定量。所有数据均以三个独立实验（标记为1、2和3）的平均值±S.E.M.表示。*表示P<0.05，NS公司与对照组相比不显著

AKT1过度表达减轻AVP诱导的心肌细胞肥大

为了进一步研究AKT1对AVP诱导的心肌肥厚的影响，我们构建了一株AKT1过表达的稳定H9C2菌株（Lentivirus-AKT1）。Western blot分析表明，无论是否有AVP刺激，P-AKT1-Thr308和AKT1在AKT1过度表达的稳定菌株中均显著表达，而AKT2没有改变（图三a、 b）。AVP处理过表达AKT1的H9C2心肌细胞的表面积下调了1.92倍（图三c、 d）。当AKT1过度表达时，ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平也显著降低（图三e） ●●●●。

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图3

AKT1过表达抑制了AVP诱导的H9C2肥大。一,b条以AKT1过度表达H9C2稳定菌株GAPDH的P-AKT1（Thr308）、AKT1和AKT2的蛋白表达和定量作为内部对照。c（c）,d日采用α-肌动蛋白染色（比例尺=20μm）测定AVP处理的对照组和AKT1过度表达的H9C2细胞的肥厚水平。电子在AKT1过度表达H9C2稳定株中测量ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M*^,#,ΔP<0.05；NS公司不重要*与Con相比；^#与Con+AVP相比；^Δ与LV-AKT1相比

AKT1通过SERCA2/PLN介导AVP诱导的心肌细胞肥大

研究旨在进一步了解AKT1过度表达时心肌细胞肥大的机制。与未经AVP处理的心肌细胞相比，经AVP慢性治疗的心肌细胞中SERCA2蛋白表达显著降低，PLN表达增加。此外，当AKT1过度表达时，SERCA2表达上调，PLN表达下调。在AKT1过度表达的H9C2细胞中，AVP对SERCA2和PLN表达的影响显著减弱（图4a、 b，附加文件1：图S2）。此外，我们检查了细胞内钙储存，发现细胞内钙²⁺AVP处理后浓度显著增加，而这对细胞内钙的影响²⁺在AVP处理的过度表达AKT1的H9C2细胞中，浓度几乎被消除（图4c、 d）。

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图4

AKT1过表达上调SERCA2蛋白表达，下调PLN蛋白表达。一,b条AKT1过表达稳定菌株中SERCA2和PLN的蛋白表达和定量。GAPDH被用作负荷控制。c（c）,d日用Fluo-3/AM测定细胞内钙浓度。荧光（比例尺=100μm）和细胞中钙浓度的定量。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M*^{, #,Δ}两者均表示P<0.05*与对照组比较；^#与Control+AVP相比；^Δ与LV-AKT1相比

美托洛尔通过上调AKT1–SERCA2级联反应减轻AVP诱导的心肌细胞肥大

为了检测Met对暴露于AVP的H9C2心肌细胞的保护作用，并研究Met这种保护作用的机制，我们进行了一系列的化学治疗分析。我们发现Met抑制了AVP诱导的H9C2细胞表面积的增加（图5a） 以及ANP、BNP和β-MHC mRNA水平（图5b） 改善了AVP诱导的P-AKT1（Thr308）、AKT1和SERCA2蛋白水平的降低，并抑制了AVP导致的PLN蛋白水平的增加（图5c、 d）。与AVP治疗组相比，Met治疗组的细胞内钙浓度降低（图5e、 f）。

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图5

美托洛尔改善了AVP诱导的AKT1和SERCA2蛋白表达水平的下降。一左面板，F-actin染色（比例尺=200μm）测量AVP、Met和Met+AVP处理的H9C2细胞的肥大生长。右侧面板，AVP、Met和Met+AVP诱导的H9C2细胞表面积的量化。b条测定经AVP、Met和Met+AVP处理的H9C2细胞ANP、BNP和β-MHC mRNA水平。c（c）,d日AVP-、Met-和Met+AVP处理的H9C2细胞中P-AKT1（Thr308）、AKT1、SERCA2和PLN水平的蛋白质表达和定量，GAPDH被选为负载对照。电子,（f）用Fluo-3/AM测定细胞内钙浓度。AVP-、Met-和Met+AVP-诱导的H9C2细胞中钙浓度的荧光（比例尺=100μm）和定量。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±S.E.M。^*,#,§两者均表示P<0.05*与对照组相比；^#与AVP比较；^§与Met相比

讨论

高血压应激、心肌损伤或神经体液多动引起的心脏增大与心脏功能障碍有关，这种情况称为病理性肥大[2]. 众所周知，AVP可诱导细胞病理性肥大，这是由细胞表面积增加和ANP、BNP和β-MHC表达升高决定的，我们的结果与以前的研究一致[7,23]. 病理性心脏肥大的已知机制包括钙调神经磷酸酶核因子活化T细胞（NFAT）信号传导、β-肾上腺素能受体信号传导、Ca²⁺/钙调素依赖性激酶II信号、cGMP/蛋白激酶G信号、蛋白激酶C和有丝分裂原激活的蛋白激酶信号以及胰岛素受体（IR）/AKT信号[2]. AKT是一种重要的蛋白激酶，在许多生物过程中发挥重要作用。TAC后8周肥厚心脏中P-AKT（Ser473）、P-S6K1和4E-BP1的蛋白水平降低，表明病理性肥厚下调AKT/mTOR通路[24]. AKT1和AKT2是AKT激酶在心脏中表达的主要亚型[25]. 我们的结果表明，在AVP诱导的病理性肥大细胞中，AKT1的总水平和磷酸化水平均下调，但AKT2的水平没有改变。此外，AKT1过表达抑制了AVP诱导的H9C2细胞表面积增加以及ANP、BNP和β-MHC mRNA表达，从而减轻了AVP诱发的心肌细胞肥大。这些结果表明，在介导病理性肥大中起重要作用的特定亚型是AKT1，而不是AKT2。

许多研究表明，由于肥大细胞中SERCA2蛋白水平的降低，钙泵的功能受损，钙的摄取²⁺从细胞质到SR减少，导致细胞质钙超载，进而导致舒张钙短暂延长和心肌收缩力降低[26–28]. 由于钙的减少²⁺SERCA2转运到SR的水平，SR中储存的钙不足，导致收缩期钙释放减少和心肌收缩功能障碍[29–31]. 然而，AVP影响钙的机制²⁺没有得到很好的研究。我们发现SERCA2在肥厚心肌细胞中的表达降低，这一结果与肥厚表型一致。PLN是Ca-ATP酶的抑制剂，可以抑制Ca²⁺通过与Ca-ATP酶（如SERCA2）相互作用进行转运[32]. 在这项研究中，在AVP诱导的肥大中，PLN表达显著上调，PLN的增加导致SERCA2抑制增强，然后细胞内钙的转运²⁺被阻止。这些结果表明，AVP通过调节SERCA2和PLN的表达水平来抑制心功能。此外，我们发现AKT1的表达水平与SERCA2的表达水平和细胞内Ca的浓度呈正相关²⁺AKT1的上调显著减弱了AVP处理H9C2细胞引起的SERCA2和PLN表达的变化。所有这些发现表明AKT1–SERCA2-Ca²⁺信号传导是AVP介导的心脏功能抑制的潜在途径。AKT激酶已被用作多种疾病的潜在基因治疗靶点，如高胰岛素血症、糖尿病和肝细胞癌[33–35]. 我们的结果还表明，AKT1可以作为治疗病理性心肌肥厚和改善心脏功能的一个可能的基因治疗靶点。虽然我们的研究表明AKT1–SERCA2级联在AVP诱导的病理性心肌肥大中发挥重要作用，但可能与体内存在一些差异。H9C2细胞最初来源于胚胎心脏组织，但体内心肌细胞具有明确的结构，在心力衰竭时会受到机械过载的影响。为了更好地理解心脏肥大的相关机制，未来需要进行更多的研究来评估这些发现并确定体内更具体的机制。

美托洛尔是一种选择性β1-肾上腺素受体抑制剂，广泛用于改善心脏功能[36,37]. 许多研究表明，长期服用Met可以下调I型胶原和III型胶原mRNA水平，调节干细胞特性以防止进行性病理重塑，此外，Met还可以改善Ca²⁺野百合碱（MCT）治疗大鼠右心室（RV）心肌细胞的处理和收缩性[18,38–40]. 在胚胎发育过程中，β受体的刺激导致AKT磷酸化降低[41]. 在缺血再灌注期间，PI3K–Akt信号的激活有助于钙的心脏保护作用²⁺拮抗剂和β受体阻滞剂[42]. 然而，AKT1和Met在AVP诱导的肥大中的关系尚不清楚。在当前的研究中，我们发现Met显著减轻了AVP诱导的肥大，进一步的实验表明，在AVP诱导H9C2细胞肥大的心肌细胞中，AKT1和磷酸化AKT1的水平均升高。上述结果表明AKT1介导了Met的心脏保护功能。此外，在Met治疗AVP诱导的肥大H9C2细胞后，SERCA2的表达上调，而作为SERCA2抑制剂的PLN在Met处理后显著降低。

作为对AVP诱导的反应，AKT1被下调，其对PLN的抑制和SERCA2的上调均被减弱。PLN和SERCA2的这些变化进一步导致细胞内钙超载²⁺许多研究表明细胞内钙²⁺动力学与生理心脏状态和细胞内钙密切相关²⁺超载可能导致心脏肥大[43–45]. 在Met治疗下，SERCA2的上调和PLN的下调使有效的细胞内Ca²⁺运输，促进细胞内钙²⁺动态平衡，最终减轻AVP诱导的肥大（图6). 总之，我们的结果表明，Met通过AKT1–SERCA2信号通路减轻了AVP诱导的肥大。

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图6

Met通过AKT1–SERCA2级联缓解AVP诱导的心肌细胞肥大机制的工作模型。SERCA2泵Ca²⁺进入肌浆网并维持细胞内钙的动态平衡²⁺（左）作为对AVP诱导的反应，AKT1被下调，其对PLN的抑制和SERCA2的上调均被减弱。此外，PLN的上调进一步抑制了Ca²⁺通过SERCA2运输。细胞内钙²⁺浓度持续升高，最终导致心肌细胞肥大。（右）在AVP诱导肥大的H9C2细胞中，美托洛尔减弱了AVP对AKT1的抑制作用。AKT1抑制PLN并上调SERCA2，过量Ca²⁺在胞浆中被泵入肌浆网。最终，心肌细胞肥大得到缓解

结论

在本研究中，我们证明AKT1–SERCA2级联在AVP诱导的心肌细胞肥大中起着重要的调节途径作用。首先，我们发现AKT1而非AKT2介导AVP诱导的心肌细胞肥大的发病机制。第二，AVP通过调节SERCA2的表达和细胞内钙的转运而诱导H9C2细胞肥大²⁺第三，Met通过调节AKT-SERCA2级联反应减轻了AVP诱导的肥大。

材料和方法

补充信息

致谢

缩写

作者的贡献

JQZ、XL和ZCG构思了这项研究。JQZ、YHL和XL设计了实验。JQZ、YPY和HBG进行了实验，获取并分析了数据。JQZ和ZCG撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

基金

本研究由国家自然科学基金资助（批准号：91439126和31440060）

数据和材料的可用性

当前研究期间使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

道德批准和参与同意

不适用。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

脚注

参与者信息

盖中超，电子邮件：nc.ude.tsus@iagoahcgnohz.

薛力，电子邮件：moc.621@smlhxl.

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