利用血脂揭示额颞叶痴呆的病理生理变化

患者血清

bvFTD患者（N=40）和健康对照（N=22）在悉尼的澳大利亚神经科学研究院从额颞痴呆临床研究小组FRONTIER和健康研究志愿者小组招募¹¹没有神经（即没有认知障碍的证据）或精神障碍。该研究由新南威尔士大学人类伦理委员会批准（批准号：HC12573）。所有方法均按照相关指南和法规进行。在获得参与者和/或主要护理人员的书面知情同意后，获取血样。所有患者均接受了神经系统检查、综合认知评估和结构脑MRI检查，符合目前公认的bvFTD诊断标准¹⁸，如前所述¹¹评估时的平均年龄为65岁 ± bvFTD为8年，71年 ± 对照组为5年。血样（9 mL）收集在试管中（BD Vacutainer SST II Advance Tube#367958），并在3500下离心制备血清 10转/分 4时最小值 °C，然后校准并储存在−80 °C直到使用。

人脑组织

经适当的道德批准（新南威尔士大学人类研究道德批准号：HC15789），从悉尼脑库和新南威尔士州脑组织资源中心获取冷冻死后脑组织样本。来自10名FTD患者、10名AD患者和11名未经神经、精神或神经病学诊断的对照组的上额叶皮层冰冻样本^19，20本研究中使用了。三组的平均年龄为72.9岁 ± 13.0, 73.7 ± 7.5和79.5 ± 分别为12.1年。

脂质提取

血清脂质提取基于布莱和戴尔法²¹简单地说，血清样本在冰上解冻，80 将微升等分试样转移到玻璃管中。甲醇（600 µl），氯仿（1000 µl）和超纯水（500 µl）依次添加，并在每次添加之间旋转。然后在3000℃下离心样品 10转/分 室温下的最小值。收集较低溶剂相，并使用玻璃巴斯德吸管将其转移到新的玻璃管中。三氯甲烷（600 µl）添加到上相，涡流并在3000下离心 10转/分 min.收集下相并转移到同一玻璃管中，并在氮气下干燥。干燥的脂质样品在100中重新配制 µl异丙醇/甲醇（1:1），储存于−80 °C玻璃LC-MS小瓶。

脂质组学质谱

脂质提取物（10 μl）使用耦合到U3000 UPLC系统的Q-Exactive Plus质谱仪进行分析（ThermoFisher Scientific）。色谱分析在60 Waters CSH C18 UHPLC柱上的温度为2.1×100 毫米，1.8 μM，带VanGuard防护柱。溶剂A为6:4乙腈：水，溶剂B为1:9乙腈：异丙醇，均为10 mM甲酸铵和0.1%甲酸。根据Castro-Perez方法对脂质进行色谱分析等.²²简单地说，a 30 从30%到100%的溶剂B进行最小梯度洗脱，按照疏水性顺序洗脱脂质。柱洗脱液被导入质谱仪的电喷雾电离源，其中使用了HESI探针。在分析之前，根据一系列脂质标准对源参数进行了广泛优化。质谱仪以数据相关采集模式运行。质量范围200–1200的测量扫描，分辨率70 K之后，在15岁时对调查中最强烈的离子进行了10次基于数据的MS/MS扫描 K分辨率。动态排除用于提高靶离子的数量。循环时间约为1 秒。样品在正极性和负极性下运行。样本按随机顺序运行（使用Microsoft Excel生成）。这对于避免批量效应/改变仪器性能影响非常重要。数据在LipidSearch软件4.1.16中进行分析。数据根据标准脂质搜索数据库进行搜索，包括所有常见哺乳动物脂质类别。然后根据样本类型对搜索结果进行分组，并进行差异分析。将对齐数据（包括脂质特性、保留时间、峰面积等）导出至Excel软件。从归一化为内部标准的峰面积中获得脂质的相对丰度。

薄层色谱法

首先，如前所述，使用硫磷香草醛（SPV）法测定血脂浓度²³简单地说，10 将µl脂质提取物装入微孔板中，并在90℃下蒸发去除溶剂 摄氏度。浓硫酸（100 µl）添加并培养20 90时最小值 摄氏度。将平板快速冷却至室温，并在540℃下测量背景吸光度 纳米。50 添加µl香兰素-磷酸试剂（20%（w/v）香兰素在17%（v/v）磷酸中），显色10 最小值和540下测得的吸光度 纳米。根据使用鱼油（Blackmores）生成的标准曲线计算总脂质。然后使用前面描述的薄层色谱（TLC）分离血脂²⁴简单地说，提取的脂质体积相当于20 在TLC板上发现µg（Silca gel 60，Merck）。平板首先在氯仿/甲醇/水（40:10:1）中显影至2 cm，然后在氯仿/甲醇/水（40:10:1）中至5 cm，然后是氯仿/甲醇/乙酸（47:2:0.5）到8.5 cm，最后将正己烷/乙醚/乙酸（65:35:1）加到板的顶部。用5%（w/v）CuSO雾化平板，观察脂质₄15%（w/v）H_三人事军官₄加热10次 最小值为180 摄氏度。使用BioRad图像实验室测定带强度。

ATP测定

按照制造商的方案（Abcam，cat.#ab83355）进行荧光ATP分析。简单地说，50 将µl样品和标准品添加到含有ATP反应混合物的96个平板中，并在室温黑暗中培养30 min.在Ex/Em使用CLARIOstar微孔板阅读器（BMG Labtech）读取板=535/587 纳米。

炎症标记物分析

按照制造商的说明，使用磁性人细胞因子ELISA测定法（Bio-Rad）测量IL-6。使用Magpix平板阅读器（Luminex）分析含有血清样本和标准品的平板，并使用Xponent软件包（Luminix）测定IL-6的浓度。C3通过western blotting测定（见下文）。按照制造商的方案（Abcam，ab102505）进行钙含量测定。简单地说，50 将µl样品和标准加入到96 well板中。然后，90 向每个孔中添加µl显色试剂，然后添加60 µl钙测定缓冲液。这些培养皿在室温下培养10个 最小值 在黑暗中，用缩微板阅读器读取575 纳米。

蛋白质提取

从100个 如上所述的脑组织mg²⁵简单地说，组织样品在10体积的TBS均质缓冲液（20 mM三通，150 mM氯化钠，pH 7.4,5 mM EDTA，0.02%叠氮化钠），含蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏），使用Qiagen TissueLyser（3 × 30 秒，30 Hz循环），然后在100000下离心 × g代表1 4时为小时 摄氏度。收集上清液并转移到新的试管中。按照制造商的说明，使用双辛酸分析（Pierce BCA蛋白质分析试剂盒）测量蛋白质浓度。

蛋白质印迹

血清（等体积）或蛋白质裂解物（10 µg）用样品缓冲液（3.2%十二烷基硫酸钠、32%甘油、0.16%溴酚蓝、100 mM Tris-HCl，pH 6.8，8%2-巯基乙醇）。然后将它们在标准无染4–20%SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad）上电泳，并在100伏下转移到硝化纤维素膜上30 min，用含有5%脱脂奶粉的TBS封闭膜，并用抗C3抗体（Santa Cruz，sc-28294，1:1000）或抗丙烯醛抗体（NOVUS，NB200-556，1:1000 摄氏度。然后在含有0.1%吐温20的TBS中清洗三次，并与辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育2次 室温下h。使用增强化学发光和凝胶Doc系统（Bio-Rad）检测信号。剥离印迹并探测管家蛋白转铁蛋白（血清）或β-肌动蛋白（组织裂解物）。使用Image Lab（Bio-Rad）和NIH ImageJ软件（v1.45）量化信号强度 s） ●●●●。

丙二醛测定

根据制造商的协议，使用脂质过氧化MDA测定试剂盒（Abcam，cat.#ab118970）测定丙二醛（MDA）。简单地说，样品是通过添加500 42微升 毫米高₂SO公司₄和125 µL磷钨酸溶液至50 µL血清样本。培养和离心后，将沉淀溶解在200 μL ddH₂O通过超声波。然后将TBA溶液添加到每个装有样品或标准品的小瓶中，并在95℃下培养 1°C h.激发荧光532 nm/发射553 使用CLARIOstar平板阅读器（BMG Labtech）读取nm。

4-羟基炔醛测定

根据制造商的协议，使用OxiSelectTM HNE加合物竞争ELISA试剂盒（Cell Biolabs，Inc.，San Diego，CA）测量4-羟基炔醛（HNE）。简单地说，50 将µL血清添加到HNE共轭预涂层孔中，然后添加50 μL抗HNE抗体。在室温下培养1小时并清洗后，100 向每个孔中添加µL二级抗体-HRP结合物并培养1 室温下h。盘子洗了三次。100 向每个孔中添加µL基质溶液，然后添加停止溶液。450时的吸光度 nm在POLARstar Omega平板阅读器（BMG Labtech）上读取。

利用血脂检测FTD线粒体功能障碍

线粒体功能障碍是阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）的常见病理特征²⁶在FTD中也越来越明显^27，28在线粒体中起重要作用的两种脂质是心磷脂（CL）和酰基肉碱（AC）。CL几乎完全位于线粒体内膜，在参与线粒体能量代谢的许多酶功能中发挥作用¹⁴AC是长链脂肪酸进入线粒体的转运体，在线粒体中脂肪酸被氧化产生能量，即ATP¹⁵CL是一种独特的磷脂，由甘油-3-磷酸合成（图2安培)，而AC是一种简单的脂质，由与脂肪酸结合的赖氨酸衍生物组成（图2B型). 这两种脂质结构不同，是在独立的途径下合成的。CL和AC水平的变化表明线粒体功能/活性的变化。

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图2

FTD血清中线粒体脂质和ATP减少。线粒体脂质心磷脂（CL）的生物合成途径(一个)和酰肉碱（AC）(B类). (C类)与对照组相比，FTD组的总CL水平降低。(D类)十二种AC中有八种在FTD中减少。(E类)FTD患者的总AC水平下降。(F类)两个下降最显著的AC物种10:0和12:1之间的相关性很强（皮尔逊相关=0.897；P（P）=6.4 × 10⁻²³). (G公司)AC和CL水平之间存在极强的相关性（Pearson相关性=0.910；P（P）=1.1 × 10⁻²⁴). (H（H）)FTD时ATP水平降低。FTD（牛顿=40），控制（N=22），数据将平均值和SE表示为误差条*P（P）<0.05时**P（P）< 0.005, ***P（P）< 0.0005.

我们比较了FTD和对照血清中CL和AC的水平。我们确定了一个单一的CL物种，与对照组相比，其FTD显著降低（图2厘米). 我们确定了12种AC物种，其中8种FTD显著降低（图二维); FTD中的总AC水平也降低了（图第二版). AC物种的减少彼此密切相关，例如，两个最显著减少的AC物种10:0和12:1的Pearson相关性为0.897(P（P）=6.4 × 10⁻²³)（图2楼). 重要的是，CL水平与AC水平密切相关（皮尔逊相关=0.910；P（P）=1.1 × 10⁻²⁴)（图2G（2G）)尽管这两种脂质是独立产生的。这些结果强烈提示FTD患者线粒体功能障碍。为了验证这些发现，我们随后测量了相同血清中的ATP水平。ATP水平是线粒体功能的主要指标，已经表明，FTD小鼠大脑和FTD小鼠模型大脑中的ATP合成减少^27，29我们发现，与对照组相比，FTD组的ATP水平显著降低（图2小时)，支持我们的血脂数据。综合起来，这些数据支持使用脂质测量来检测FTD血清中的线粒体功能障碍。

利用血脂检测FTD炎症

炎症是神经退行性疾病（包括FTD）的一个显著病理生理特征^30，31我们对是否可以通过血脂分析检测FTD中的炎症很感兴趣。已知参与炎症反应的两类血脂是溶血磷脂酰胆碱（LPC）和血小板活化因子（PAF）^16，17LPC和PAF是促炎脂质，也称为第二信使或即时反应分子。LPC作用于许多免疫靶细胞，例如，它上调巨噬细胞和T淋巴细胞的细胞因子生成和趋化性^32–35在脑神经炎症过程中，它还激活小胶质细胞中的caspase-1³⁶PAF也是一种强大的炎症细胞激活剂，参与天然免疫系统，包括中性粒细胞、巨噬细胞和血小板。它也是一种有效的神经调节剂³⁷LPC和PAF均为甘油磷脂，来源于母体磷脂酰胆碱（PC）（图3A级). PC和PC的另一种衍生物，甲基磷脂酰胆碱（MPC）（图3A级)，是非燃烧性脂类。

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图3

FTD血清中炎性脂质和细胞因子的变化。(一个)促炎症脂质溶血磷脂酰胆碱（LPC）和血小板活化因子（PAF）以及非炎症脂质磷脂酰胆碱和甲基磷脂酰胆碱的生物合成途径。(B类)LPC物种的丰度，其中9种在FTD中显著高于对照。(C类)FTD时总LPC水平升高。(D类)FTD中PAF 14:0p水平增加。(E类)FTD中PAF 16:1p水平增加。(F类)FTD时总PC水平下降。(G公司)FTD时MPC总水平下降。(H（H）)通过ELISA测定，促炎细胞因子IL-6水平在FTD中升高。(我)western blotting检测FTD中促炎标志物C3水平升高；由管家转铁蛋白（Tr）标准化(J型)FTD患者的钙水平升高。(K（K）)FTD患者的抗炎脂质o-酰基-ω-羟基脂肪酸（OAHFA）水平降低。(L（左）)LPC与OAHFA呈负相关（Pearson相关=−0.274；P（P）< 0.05). FTD（牛顿=40），控制（N=22），数据将平均值和SE表示为误差条*P（P）<0.05时**P（P）< 0.005, ***P（P）< 0.0005.

我们比较了FTD和对照血清中LPC和PAF以及PC的水平。我们确定了33种LPC，其中9种与对照组相比FTD显著增加（图3B公司). 总LPC在FTD中也显著增加（图3C公司). 我们确定了两种PAF物种（14:0p和16:1p），这两种物种的FTD均显著增加（图3D、E). 有趣的是，16:1p物种有两个分布簇，即“低”和“高”（图第三方). 大多数对照样本（即91%）分布在低集群，而50%的FTD样本分布在低集群，50%分布在高集群（图第三方). 在FTD队列中，高聚类的平均值高出28.6倍(P（P）=1.1 × 10⁻¹⁰)与低年龄组相比，年龄无差异（平均年龄=65岁 两组均为y）或性别（男性为N=10，母N=两组均为10）。在相关性方面，LPC水平与PAF水平呈正相关（皮尔逊相关=0.278；P（P）< 0.05). 脂质水平的增加仅与促炎症脂质有关，因为与对照组相比，FTD中的非炎症脂质PC和MPC都略有下降（图3F、G).

为了验证这些脂质结果，我们使用了两种非脂质检测来测量同一血清中两种独立的促炎标记物的水平。首先，我们使用ELISA检测白细胞介素6（IL-6），它是调节炎症反应的主要细胞因子。IL-6基因多态性与FTD患者的认知和行为表现相关³⁸其次，我们使用免疫印迹法测定补体成分3（C3），补体成分在先天免疫中起着重要作用，通常用作诊断炎症状况的血液测试。FTD患者的C3水平与认知能力下降相关³⁹我们发现，与对照组相比，FTD组IL-6和C3水平显著升高（图3H、I)，支持我们的血脂数据。此外，我们分析了钙水平作为LPC水平的测量指标；LPC水平的增加通过G蛋白偶联受体诱导钙水平的增加⁴⁰钙调节障碍也与FTD有关^41，42我们发现，与对照组相比，FTD血清中的钙水平显著升高（图3J型)，再次支持我们的脂质数据。这些发现与早期研究一致，早期研究表明FTD脑内促炎细胞因子水平增加⁴³.

最后，我们分析了o-酰基-ω-羟基脂肪酸（OAHFA），这是一种由长碳链脂肪酸酯化为ω-羟脂肪酸组成的简单脂质。它们在结构上类似于一组被称为羟基脂肪酸脂肪酸酯（FAHFA）的脂质。有趣的是，这些脂质具有抗炎作用^44，45因此，我们对FTD中OAHFA水平是否发生改变感兴趣。我们发现，与对照组相比，FTD组OAHFA水平显著降低（图3公里)表明抗炎活性降低。此外，LPC和OAHFA水平之间存在显著的负相关（Pearson相关=−0.274；P（P）<0.05）（图3升). 综合起来，这些数据支持脂质测定作为测量FTD血清炎症的手段。

这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）项目拨款（#1037746，#1132524）对ForeFront的资助，ForeFrond是一个致力于额颞叶痴呆和运动神经元病研究的合作研究小组以及澳大利亚研究委员会认知及其障碍记忆计划卓越中心（#CE110001021）。G.M.H.是NHMRC高级首席研究员（#1079679），O.P.是NHMRI高级研究员（#1103258）。我们感谢E.Jary、F.Atashrazm和S.Keshiya提供的技术援助。