活性乙酰胆碱受体可防止骨骼肌萎缩并有利于神经再支配

nAChR参与ACh的保护作用

然后我们评估ACh类似物的保护作用是否通过nAChR实现。用nAChR竞争性阻滞剂潘库溴铵（Pcu）处理的肌纤维⁴³，膜渗透性增加（图4a、b)，RMP下降（图4c类)和钙增加²⁺和Na⁺信号（图第4天)在培养24小时时已经很明显了。此外，Pcu阻断了NMJ的兴奋性微型终板电位（补充图⁵). 因此，通过抑制nAChR来加速肌纤维的改变，我们证明了ACh通过nAChR的一种迄今未知的保护作用（图第四版). 这些结果解释了一项开创性的研究，该研究表明轴突残端的长度与向肌肉传递冲动失败的时间进程有直接关系^26–28,44我们认为，观察到的时间取决于神经残端含有ACh的突触小泡的数量，这些小泡随着时间的推移被释放和消耗。

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图4

烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）的活性可防止骨骼肌纤维萎缩。

采用趾短屈肌（FDB）肌纤维原代培养。一在评估乙炔（Etd）的延时实验中测量了膜的渗透性⁺)培养24h后进行摄取。肌纤维在对照条件下培养（白色），或用15µM潘库溴铵（Pcu；绿色）处理。b条 N个 = 4; 每个独立实验中记录六个肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001，与学生对照组相比，Pcu的影响t吨测试。c（c）在培养24小时时评估静息膜电位（RMP）。在对照条件下或用15µM Pcu处理后培养肌纤维。N个 = 5; 每个独立实验中至少记录20条肌纤维*第页 < 0.05，与学生对照组相比，Pcu的效果t吨测试。d日上图，细胞内钙²⁺信号（340/380）和，下部图像，Na⁺分别用FURA-2和SBFI在培养24小时记录信号。面板右侧的彩色标尺描绘了染料与钙结合时，颜色从蓝色变为绿色²⁺或Na⁺平行培养物用15µM Pcu处理，24小时后用Ca²⁺和Na⁺对信号进行评估。比例尺：50µm。e（电子）拟议模型。

在成年期，nAChR的活性仅与神经元化学信号转化为NMJ处的肌膜去极化有关，从而在肌肉中产生机械反应。为了确定与ACh对培养中维持的失神经肌纤维的保护作用相关的nAChR活性的信号通路，我们评估了蛋白激酶的可能参与，这些蛋白激酶已被证明位于AChR下游，并且据报道在失神经后发生了改变：PKC和PKA⁴⁵，第38页地图⁴⁶、和Rho⁴⁷我们测试了以下激酶阻滞剂对培养肌纤维肌膜通透性的影响：钙蛋白C（Calphostin C；一种蛋白激酶C抑制剂）、双吲哚甲酰胺（Bisindolyl；一种蛋白质激酶C抑制剂，和Fasudil（一种Rho激酶抑制剂）。此外，我们评估了每种阻断剂与Cbc结合的效果，以确定哪种阻断剂位于另一种的上游。

只有在Calpho C和Bisindolyl存在的情况下，肌膜通透性才从48小时加速到24小时（补充图^6a、b). 这些分子与Cbc（Cbc+Calpho C和Cbc+Bisindolyl）共同孵育可防止Cbc在培养48小时时对肌膜通透性增加的抑制作用，这与与Cbcs共同孵育时的其他分子不同（补充图^6c、d). 因此，我们认为PKC的激活位于nAChR下游，可能参与ACh保护作用的信号转导。

AChR和PKC之间的联系已经在文献中得到了很好的记录。公认AChR至少有三种蛋白激酶的磷酸化位点，如PKC、PKA和PTK^48,49虽然nAChR的PTK磷酸化可以加快电流衰减时间，但受体的PKC和PKA磷酸化也会增加脱敏率⁵⁰同样，PKA和PKC活性之间的平衡对于维持突触后受体密度至关重要⁴⁵.

在我们的研究中，我们发现正常快速骨骼肌在肌纤维中表达Cx mRNAs，失神经7天不会引起Cx43和Cx45 mRNA水平的显著变化（补充图^6e、f). 同样，新分离的肌纤维已经表达Cx43和Cx45 mRNA，培养48小时仅诱导Cx45的mRNA增加，而Cbc处理显著降低了这两种mRNA连接蛋白的相对水平（补充图^{6克，小时}). 相比之下，正常神经支配肌肉中Cx43和Cx45的免疫反应性很低（western blot分析，补充图^6i–l级)最有可能反映了不同类型肌纤维作为血管细胞的细胞内贡献⁵¹，因为后来连接蛋白免疫荧光检测为阴性（补充图^600万)而去神经支配诱导显著增加（补充图^6i–米). 因此，调控Cxs mRNA翻译涉及转录后机制。此外，我们观察到，阻断溶酶体或泛素蛋白酶体依赖的蛋白降解途径（分别为氯喹和G5泛素异肽酶抑制剂）不会影响培养骨骼肌纤维中Cx43/Cx45免疫反应或肌膜通透性的增加。然而，用100µg/ml环己酰亚胺阻断蛋白质合成48小时可以防止这两种改变（补充图⁷)表明烟碱AChRs的激活会抑制Cxs的蛋白质合成。

值得一提的是，单侧固定骨骼肌时，我们观察到肌肉萎缩（补充图^8a、b)MyoD相对水平明显增加（补充图^第8页c)，一种制动诱导萎缩的指标⁵²，但固定肌肉中Cx43和Cx45的相对水平仍然较低，与对照肌肉（对侧）的相对水平相当（补充图^{第8天，第5天}). 因此，控制Cxs mRNA翻译的转录后机制与ACh及其信号转导有关。

ACh类似物抑制Cx HCs的表达

由于我们的数据显示，ACh的缺失引发了一系列以去神经为特征的细胞改变，我们评估了导致这些改变的分子机制。最近，体内失神经肌纤维肌膜中Cx43 HCs和Cx45 HCs的从头表达被证明可以解释肌膜通透性增加、细胞内Ca²⁺和Na⁺失神经后的信号和蛋白质分解代谢^15,16值得注意的是，在制动诱导的萎缩期间，肌肉中不存在这些膜渗透性变化，在这种情况下，乙酰胆碱的定量供应是正常的（补充图⁸). 因此，有必要确定ACh的保护作用是否是由于阻止Cxs表达。为此，我们评估了Etd⁺Cx43培养肌纤维的摄取率^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}小鼠（对照小鼠）和Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：MC小鼠（骨骼肌中缺乏Cx43和Cx45的小鼠）。

在对照条件下培养48小时或用NGF+BDNF或ATP处理48小时时，肌纤维表现出Etd增加⁺吸收速率；Cx HC阻断剂La的急性治疗³⁺、卡宾诺酮（Cbx）、氟苯那酸（FFA）或D4还原Etd⁺摄取（补充图⁹和¹⁰). Cbc治疗完全阻止了肌膜通透性的增加，Cx43中Cx43/45的条件性敲除也是如此^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：MC小鼠（图5a、b). 同样，培养48小时后，对Cx43和Cx45的免疫反应增加，用Cbc治疗可防止这种增加（图5厘米). 此外，我们使用缺乏Cx43、Cx45、Panx1或P2X的KO小鼠评估了其他通道形成蛋白的可能参与₇，并发现这些蛋白质单独的缺失并不能显著防止去神经诱导的肌肉萎缩（补充图¹¹). 因此，肌膜通透性增加是由于Cx43和Cx45同时表达，而ACh阻止了这一表达。

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图5

乙酰胆碱类似物抑制连接蛋白半通道的表达，导致失神经骨骼肌萎缩。

Cx43趾短屈肌肌纤维的原代培养^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}和Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：Myo-Core（Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：MC）小鼠。一用乙炔（Etd）评估膜的渗透性⁺)培养0h（左）或48h（右）的摄取实验。前10分钟为基线，之后用200μM La处理肌纤维³⁺Cx43肌纤维的肌膜通透性^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}在对照条件下（蓝色圆圈），或在50 ng/mL NGF+50 ng/mL BDNF（NGF/BDNF；红色圆圈）、500µM ATP（灰色圆圈）或200 nM Cbc（黄色圆圈）的培养液中测量。Cx43肌纤维^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：MC小鼠在对照条件下培养（黑圈）。b条伊特德⁺肌纤维摄取率。N个 = 4; 每个独立实验中记录五个肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001，以及**第页 < 通过ANOVA和Bonferroni事后测试，将0.005与培养0小时时的肌纤维进行比较。从Cx43获得的数据^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}小鼠用白色条表示，来自Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：黑条MC小鼠。c（c）培养0、24和48小时后，使用共焦显微镜通过免疫荧光评估Cx43和Cx45的相对水平。培养48小时的肌纤维也在时间0时用200 nM Cbc处理。校准棒：100µm。d日，等⁺培养48小时吸收。肌纤维用Cx43+Cx45吗啉酸（Cx43+Cx45 Mor）或Cx43+/Cx45 morpolinos和Lipofectamine®2000处理[（Cx43+Cx45-Mor（Lipo）]。前10分钟为基线，然后用200μM La处理肌纤维³⁺.e（电子）伊特德⁺肌纤维摄取率。N个 = 4; 每个独立实验中记录五个肌纤维，每个值为平均值±SEM***第页 < 0.001，对于La的影响³⁺与Cx43+Cx45 Mor相比。无显著差异，对于La³⁺在Cx43+Cx45 Mor（Lipo）上，通过ANOVA和Bonferroni事后检验，比较Cx43+Cx45 Mor（Libo）。（f）用免疫荧光法评估经Cx43+Cx45 Mor（Lipo）处理48小时后肌纤维中Cx43和Cx45（红色）的相对水平。DAPI（蓝色）。校准棒：50µm。

我们还评估了体外培养肌纤维中的RMP（补充图²,¹²和¹³). 来自Cx43的失神经FDB肌肉^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}小鼠RMP从失神经后5天开始下降；用La治疗90分钟后，这种减少被逆转³⁺、Cbx或D4，一种计算设计的选择性Cx HCs阻断剂，在Cx43的肌纤维中未观察到^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：MC小鼠（补充图²). 有趣的是，使用Cx HC阻滞剂在90分钟时观察到的RMP恢复被Ouabain（OB）（Na）降低⁺/K（K）⁺ATP酶泵阻断剂，表明一旦Cx HCs被阻断，膜电位的恢复由Na进行⁺/K（K）⁺ATP酶泵（补充图^{12和 13}). 因此，RMP的降低是由于Cx43和Cx45的表达，而ACh阻止了它们的表达。为了验证转基因小鼠的使用并避免肌肉发育过程中的任何代偿反应，我们使用吗啉类抗Cx43和Cx45（Cx43+Cx45 Mor）药物沉默了对照小鼠培养肌纤维中的相同蛋白。用Cx43+Cx45 Mor治疗48小时后，阻止了Cx43和Cx45的肌膜通透性和免疫反应性的增加（图第5天–第5天).

动物

所有程序均由智利天主教大学生物伦理委员会（CBB-006/2013号议定书）批准，并符合国家卫生研究院指南。外螺纹C57/Bl6（C57），外螺纹Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}（Cx43^{佛罗里达州}Cx45型^{佛罗里达州})，和外螺纹Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行}：MyoD-Cre（Cx43^{佛罗里达州}Cx45型^{佛罗里达州}：MC）小鼠。第二页₇智利圣地亚哥大学的Claudio Acuña博士慷慨捐赠了这些老鼠。57只相同年龄的小鼠也被用来与（Cx43）进行比较^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行})由于在本研究中所研究的所有参数中均未发现显著差异，因此我们使用（Cx43^{飞行/飞行}Cx45型^{飞行/飞行})小鼠作为对照动物，以减少被安乐死动物的总数。骨骼肌纤维取自2个月大的雄性小鼠。DRG外植体取自第14.5天的小鼠胚胎。所有小鼠在光照下：黑暗12:12周期，随意进食和饮水。

逆转录聚合酶链反应（PCR）

按照制造商的指示，使用TRIzol从培养的肌纤维中分离出总RNA（Ambion）。使用MMLV逆转录酶（Fermentas）将两微克等分总RNA转录成cDNA，并通过PCR扩增（GoTaq Flexi DNA聚合酶；Promega）评估mRNA水平。PCR反应在25µL中进行，其中包含5µL 5×PCR缓冲液，1.5µL Mg²⁺25 mM、0.4µL的10 mM dNTP、0.4μL的寡核苷酸。使用的寡聚物如下：Cx43（34个周期）：S 5′-ATCCTTACCGCCACCA-3′，AS 5′-CATTTTGGCTGTCGTCAGG-3′；Cx45（34个循环）：S 5′-AAAGAGCAGAGACACCA-3′，AS-CAAACCCTAAGTGAAGC-3′；GAPDH（26个循环）：S 5′-ACCACAGTCACATGCACATGCATCATCAC-3′，AS 5′-TCCACACCTTTGCTGTA-3′；Panx7（38个循环）：S 5′-CACACATCCGTCACAAGATAG-3′，AS 5′-TTCTCGTCGTCCTTT-3′。预期产品为：Cx43 297pb；Cx45 311 bp；GAPDH 452；Pax7 352个基点。

骨骼肌纤维的分离

采用机械和酶法分离来自FDB的小鼠骨骼肌纤维。简单地说，仔细解剖肌肉并将其浸入含有2%I型胶原酶、苏拉明200µM和BTS 50µM的培养基（补充10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM/F12）中，然后在37°C下培养1.5小时。使用巴斯德吸管轻轻研磨肌肉，以分散单个肌纤维。分离的肌纤维在含有BTS的培养基中重新悬浮。

骨骼肌纤维的培养与药物治疗

分离后，骨骼肌纤维在37°C、5%CO的培养基中孵育₂持续24、48或72小时。每24小时施用一次不同的化合物。使用的化合物为：卡巴胆碱（Cbc；200 nM）、甲基卡巴酰胆碱（Cmc；200 n M）、腺苷-5′-三磷酸（ATP，500µM）、腺苷-5′-0-（3-硫代三磷酸）（ATP-γ-S；500µM）、NGF（50 ng/mL）、BDNF（50 ng/mL）、卡宾诺酮（Cbx；100µM），针对Cx43和Cx45的吗啉类化合物（Morph 43+45；500 nM），以1:5的比例转染脂质体或潘库溴铵（Pcu；150 nM）。在培养0、24或48小时时进行记录。

染料吸收

通过Etd评估从FDB分离的肌纤维中连接蛋白半通道的功能状态⁺吸收，吸收^62,63将分离的骨骼肌纤维置于Krebs HEPES缓冲液中（mM:145 NaCl，5 KCl，3 CaCl₂，1氯化镁₂，5.6葡萄糖，10 HEPES-Na，10 Tris pH 7.4），室温下暴露于5μM Etd⁺然后拍摄延时荧光和快照图像。Etd⁺使用Nikon Eclipse Ti显微镜（日本）在与肌纤维细胞核相对应的感兴趣区域中记录荧光。

细胞内游离钙²⁺和Na⁺信号

细胞质钙²⁺和Na⁺分别使用比例染料FURA-2和SBFI评估FDB肌纤维中的信号。将肌纤维置于无血清DMEM/F12中，37°C下放置45分钟，然后在Krebs-HEPES缓冲液中洗涤三次。不同成像的实验协议涉及340 nm和380 nm激发波长的数据采集。将340-nm除以像素基上380-nm的荧光图像（∆=F类340纳米/F类380纳米）。

RMP和MEPP

在25°C的全细胞电流钳条件下，在体内和体外记录RMP测量值，并在体内记录FDB肌纤维中的MEPP测量值。移液管为硼硅酸盐电极，填充有3 M KCl溶液，浴液为Krebs-HEPES缓冲液，pH 7.4。移液管电阻为～50 MΩ。所有实验均使用Olympus IX 51倒置显微镜、Axopatch1-D放大器、Digidata1322数字化仪和Clampex 9.1采集软件进行。数据采用Clampfit 2.1软件进行分析。

单侧后肢失神经

在100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪混合麻醉下，完成左后肢坐骨神经的完整横断。未手术的右后肢作为对照。在术后第1天、第3天、第5天、第7天和第14天，仔细解剖麻醉动物的TA肌肉，并进行不同的分析。然后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死。

肌腱切开术

在100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪混合麻醉下，完成左后肢跟腱的完整横断。未手术的右后肢作为对照。7天后，从麻醉动物身上仔细解剖胫骨前肌（TA），并进行横截面积（CSA）测量和Western blot。然后，通过颈椎脱位对动物实施安乐死。

蛋白质印迹

使用腓肠肌代替FDB或TO肌肉，因为它们产生足够的蛋白质用于蛋白质印迹。此外，在小鼠中，腓肠肌的快速肌纤维百分比与FDB肌相似。用含有蛋白酶抑制剂（200μg大豆胰蛋白酶抑制剂、2 mM PMSF、1 mg/mL苯甲脒、500μg/mL亮氨酸肽和1 mg/mL e-氨基己酸）和磷酸酶抑制剂（mM:100 NaF、20 Na）的冰镇裂解缓冲液（mM:1 EDTA、100 NaCl、20 HEPES和1%Triton X-100，pH 7.4）清洗肌肉₄P（P）₂O（运行）₇，和200原钒酸盐），然后在液氮中冷冻。用剃须刀将肌肉切成小块，然后均质（组织匀浆器；Brinkmann）和超声（加热系统Microson）。组织匀浆在13000×克，并丢弃颗粒。然后，对样品进行蛋白质的Western blot分析。将斑点与稀释在5%无脂牛奶–PBS溶液中的适当稀释的初级抗体孵育过夜。然后，用1%吐温20在PBS（TPBS）中冲洗印迹，并在室温下用HRP结合的山羊抗兔或抗鼠IgG（1:5000稀释）孵育40分钟（圣克鲁斯生物技术）。用TPBS冲洗五次后，根据制造商的说明用ECL试剂检测免疫反应蛋白¹⁵.

免疫荧光分析

将分离自FDB肌肉的肌纤维在室温下用4%甲醛固定10分钟。接下来，在室温下将肌肉在封闭溶液（50 mM NH）中培养3小时₄Cl，0.025%Triton，1%BSA在PBS中），然后与适当稀释的一级抗体孵育过夜，用PBS溶液洗涤五次，然后与二级抗体孵育1小时，并用DAPI固定在Fluoromount G中。免疫反应结合位点在尼康Eclipse Ti显微镜下定位。

肌纤维CSA测量

使用ImageJ 1.46r软件（美国国立卫生研究院）在用4%多聚甲醛固定并用苏木精：伊红染色的TA肌肉横截面上测定肌纤维的CSA。

分子对接

使用AutoDock 4.0软件进行对接。利用MOPAC2016，采用PM6半经验方法绘制并优化了化合物的三维结构，分配了部分电荷，鉴定了可旋转键。受体坐标从冷冻电子显微镜结构中提取鱼雷AChR（PDB ID:2BG9）⁶⁴。所有对接计算文件都是使用AutoDock Tools（ADT）准备的。AutoDock使用基于网格的快速方法进行能量评估。构建一个足以覆盖受体整个表面的网格体积（240×240×320º^三)，网格间距为0.5°。使用AutoGrid 4.0生成网格参数，并使用拉马克遗传算法（LGA）搜索配体的构象空间。每个化合物产生了10个构象。通过检查化合物的结合能得分，分析了所有化合物的对接姿势。最有利的构象被选为最佳姿势。

分区DRG外植体培养

DRG外植体取自第14.5天的小鼠胚胎。简单地说，DRG被解剖并放置在涂有鼠尾胶原的皮氏培养皿上的Campenot室中央隔室（C）中⁶⁵DRG保存在补充有2%B-27，2 mM的神经基底培养基中我-37°C、5%co中的谷氨酰胺、50 ng/mL NGF、5%FBS和1%Peni-Strepto（共培养基）₂共培养5天，每48小时更换一次共培养基。在表面划痕的引导下，DRG轴突可以在高真空油脂屏障下生长到外侧隔室（L）。

DRG外植体与骨骼肌纤维的共培养

培养5天时，将新分离的FDB肌纤维放置在Campenot室的外侧（L）室，位于DRG远端轴突上方。在37°C和5%co的共培养基中保持共培养₂持续5天；共培养基每48h更换一次。

神经支配肌纤维的定量

共培养5天时，固定细胞，并使用抗神经丝200和抗AchRε抗体进行免疫荧光显微镜检查，如上所述。所有肌纤维均通过相位对比图像进行识别。在肌纤维上，抗神经丝200和抗AchRε之间的共定位被认为是受神经支配的肌纤维，而非共定位则被认为是无神经支配的肌肉纤维。通过测定受神经支配的肌纤维的百分比来量化受神经支配肌纤维。

肌纤维周围远端轴突的定量

在共培养5天时，将细胞固定，并使用抗神经丝200进行免疫荧光显微镜检查，如上所述。为了便于远端轴突的量化，将图像转换为单色并反转。用相控仪对肌纤维进行鉴定，并将其变成黑色图形。为了量化肌纤维周围的远端轴突数量，放置了5个以肌纤维为中心的同心圆，间距为15μm，计算远端轴突与这些圆的交点数量，并将其表示为交点的平均值。N个 = 5; 在每个独立实验中记录的至少55个肌纤维，每个值为平均值±SEM。

染料偶联

通过将离子导入HCO中5%wt/vol Lucifer黄（150 mM）的一个细胞，在亚融合培养物（85%）中评估HeLa-Cx43细胞（ATCC）之间通过缝隙连接的细胞间通讯⁻_三通过玻璃微电极，用pH 7.2的10 mM HEPES缓冲的游离F-12培养基。简单地说，将含有细胞的盖玻片放在灌注室中，并在配备氙弧灯和路西法黄滤光片（激发波长450–490 nm；发射波长高于520nm）。染料注射后1分钟，检查周围细胞以确定是否发生染料转移。染料偶联的发生率计算为染料转移到至少一个相邻细胞的情况百分比，以及染料扩散到的细胞数量，并表示为染料偶联指数。在所有实验中，通过注射至少10个细胞来评估染料偶联的发生率。

数据分析和统计

结果表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。N个指独立实验的数量。使用Student’st吨测试。对于多重比较，进行单因素方差分析，通过Bonferroni事后检验观察显著性。使用Image-J（NIH）进行图像分析，使用Prism 8.0软件GraphPad Inc.进行统计分析。第页 < 0.05被认为具有统计学意义。

J.C.S.感谢国家发展基金会（Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico，FONDECYT）的资助1111033、1191329，以及智利ICM-ECONOMIA的ICM-ECONOMIA资助P09-022-F。B.A.C.感谢FONDECYT拨款3170938和CINV。C.V.感谢FONDECYT拨款11614338、BASAL拨款FB0807和H2020-MSCA-RISE-2016拨款734801 MAGNAMED的支持。C.C.感谢退伍军人事务部康复研究与发展服务拨款B-2020-C的支持。我们还感谢Teresa Vergara提供的卓越技术援助，感谢Egon Alvarez Vargas提供的分子分析协助，以及Dr。智利圣地亚哥大学的Claudio Acuña提供了P2X₇击倒老鼠。