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癌症发现。作者手稿；PMC 2020年9月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症发现。2020年3月；10(3): 460–475.
2019年12月6日在线发布。 数字对象标识：10.1158/2159-8290.CD-19-0837号
预防性维修识别码：项目管理委员会7058506
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院1546053
PMID：31810986

TBK1是VHL缺失癌症的合成致死靶点

胡莲心,1 谢海彪,2 刘西娟,1 弗朗西斯·波特朱伊德,三 林赛·I·詹姆斯,三 艾米丽·威尔克森,4 劳拉·E·赫林,4 谢玲（Ling Xie）,5 西安晨,5 约翰尼·卡斯蒂略·卡布雷拉,1 凯虹（Kai Hong）,6 廖成恒,1 谭显明,1 阿尔伯特·S·鲍德温,1 菅公,2和Qing Zhang（张青）1,4,7,8,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

TANK结合激酶1（TBK1）是一种参与天然免疫反应的重要激酶。这里我们发现，von Hippel-Lindau过度激活了TBK1(VHL（甚高频）)癌细胞缺失或缺氧。肾癌患者的肿瘤VHL（甚高频）缺失显示TBK1磷酸化升高。通过基因消融、药物抑制或一种新的基于脑白质的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）导致TBK1缺失，从而特异性抑制VHL缺陷肾癌细胞的生长，同时保持VHL野生型细胞的完整性。在原位异种移植模型中，TBK1的缺失也显著降低了肾脏肿瘤的发生体内从机械上讲，脯氨酸48上的TBK1羟基化触发VHL以及导致TBK1磷酸化降低的磷酸酶PPM1B结合。我们发现TBK1磷酸化Ser366上的p62/SQSTM1，这对p62稳定性和肾癌细胞增殖至关重要。我们的研究结果表明，TBK1与其在先天免疫信号传导中的作用不同，是VHL缺失癌症的合成致死靶点。

关键词：VHL、TBK1、羟基化、ccRCC、EglN1

简介

2014年，美国估计新发肾（肾细胞癌和肾盂癌）病例和死亡人数分别为63920例和13860例(1). 过去几十年来，肾癌发病率一直在稳步上升，尽管其原因尚不清楚(1). 这个VHL（甚高频）肿瘤抑制基因被确定为ccRCC高危患者的生殖系突变，约占所有肾癌的85%(2). 正在停用VHL（甚高频）突变在散发性肾细胞癌中也起主要作用(三). 已明确pVHL相关复合物具有E3泛素连接酶活性和VHL（甚高频）缺失导致缺氧诱导因子α（HIFα，包括HIF1α和HIF2α）和ZHX2的稳定，这对肾癌的转化表型起着重要作用(2,4——7). 进一步研究表明，pVHL通过铁和2-氧基戊二酸依赖性双加氧酶（EglN1、EglN2和EglN3）的EglN家族成员对定义的HIF1α脯氨酸残基（脯氨酸402和564）进行羟化作用与HIF1α相互作用(8). 由于HIFα因子的积累和转位进入细胞核，HIFα与组成性表达的HIFβ亚基和反式私有基因二聚体，这些基因在启动子或增强子区域具有缺氧反应元件（NCGTG），例如参与血管生成的基因（如VEGF）、糖酵解和葡萄糖转运的基因（例如GLUT1）和红细胞生成（例如EPO）(9). HIF信号/激活是VHL缺乏的ccRCC的重要致癌标志。然而，在ccRCC中针对HIF信号仍然具有挑战性。由于pVHL丢失，HIF2α的稳定对于促进肾肿瘤生长是充分和必要的(7). 最近的报告显示，特异性HIF2α抑制剂PT2399抑制原发性肿瘤生长和一部分肾癌的侵袭(10,11). 然而，很大一部分肾癌仍然对HIF2α抑制剂治疗耐药(10,11)，强调了识别VHL缺陷肾癌的其他治疗漏洞的重要性。

肿瘤特异性基因改变（例如VHL（甚高频）loss）不仅揭示了推动肿瘤进展的生物变化，还揭示了可用于治疗的脆弱性。由于70-80%的肾肿瘤有VHL功能丧失，因此在保留正常细胞的同时，确定肾癌中VHL丧失的合成致死性伙伴仍然很有吸引力。先前的研究已经确定了一些药物抑制剂，包括自噬调节剂STF-62247(12)，高三尖杉酯碱（HHT）(13)，EZH抑制剂(14)，GLUT-1抑制剂(15)和岩石抑制剂(16)，显示选择性杀伤VHL空ccRCC细胞。此外，据报道，CDK6、MET和MAP2K1对VHL缺失的ccRCC细胞系至关重要(17). 其中一些通路是已知的HIF信号调节器，而其他VHL合成致死性伙伴的机制尚不清楚。

TBK1是非典型IκB激酶（IKK）家族的成员，它还具有另一个高度相关的家族成员IKKε。当DNA和RNA病毒感染时，干扰素基因刺激因子（STING）与TBK1结合，并在TBK1激活环内促进其对Ser172的磷酸化，这是其激酶活性诱导Ser366上STING磷酸化和通过指导IRF3磷酸化诱导I型干扰素反应所必需的(18,19). 因此，TBK1是细胞内天然免疫信号的必需元素。近年来，TBK1的作用已扩展到癌症(20,21). 尽管先前的研究表明RalB/Sec5效应器或Axl信号可能在TBK1信号的上游起作用(22,23)目前尚不清楚TBK1活性在癌症中是如何动态调节的，以及这种激活是否与天然免疫中的典型信号有关。在这里，我们通过以HIF非依赖性的方式作为VHL无效肾癌的合成致死伙伴，确定了TBK1信号在癌症中的新作用，与其在先天免疫信号中的作用不同。

结果

VHL抑制ccRCC中的TBK1活性

通过使用泛丙基羟基化抗体进行下拉，然后对Hela细胞裂解物进行质谱分析，表明TBK1是羟基化的(24). 由于细胞未经MG132处理，许多VHL降解底物可能无法从下拉中恢复，包括HIF1α和HIF2α(24). 在从质谱分析中删除的列表中，TBK1是少数可能具有治疗靶向性的激酶之一。由于羟基化蛋白可能与VHL相互作用并可能受VHL调节，因此我们决定是否可以通过VHL调节TBK1蛋白水平或其在Ser172上的典型磷酸化，从而控制其活性。为此，我们检测了VHL为空（EV）或VHL恢复的ccRCC等基因细胞系（786-O、UMRC2、RCC4和UMRC6）中TBK1或p-TBK1（Ser172）的水平。有趣的是，尽管总TBK1蛋白水平在VHL表达后没有改变，但VHL显著抑制了所有四种检测细胞系中磷酸化的TBK1(图1A和​和B）。B). 在过度表达VHL的293T细胞中也发现了类似的调节(补充图S1A). 为了证明pTBK1水平是否是TBK1激酶活性的良好预测因子，我们进行了在体外用UMRC2细胞裂解物作为激酶来源，纯化STING蛋白作为底物的激酶分析。STING磷酸化-Ser366抗体检测到STING的磷酸化。作为对照，我们通过特定sgRNA耗尽UMRC2细胞中的TBK1，并发现TBK1耗尽导致Ser366上STING磷酸化降低(补充图S1B)表明该激酶分析可用于可靠检测TBK1活性。我们发现UMRC2空载体细胞的裂解产物显示出比用VHL修复的等基因细胞的裂解物更强的STING磷酸化(图1C). 相反，我们也通过几个独立的sgRNAs和CRISPR-Cas9在VHL精通细胞（293T和Caki-1）中耗尽VHL。一直以来，VHL缺失导致p-TBK1的深度上调，而不影响总TBK1水平(图1D和​和E）。E类). 值得一提的是，作为TBK1的亲密家族成员，IKKε的蛋白质水平和磷酸化状态在这些细胞中不受VHL的影响(图1E；补充图S1C)表明VHL对TBK1磷酸化的调节是特异性的。IL-1β和TNF-α可以独立于STING等适配器激活TBK1活性(25). 为了排除这些细胞因子对TBK1信号的潜在影响，我们检测了EV和等基因VHL细胞培养的条件培养基。虽然大多数培养基样本中的TNF-α低于检测限，但在EV和VHL培养基中IL-1β水平相当(补充图S1D).

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VHL/EglN1与TBK1相互作用并抑制TBK1活性

A、，用空载体（EV）或VHL恢复的RCC4、786-O、UMRC2和UMRC6细胞裂解产物的免疫印迹。

B、，通过图像J.n=3个生物复制品对来自面板A的pTBK1/TBK1信号进行量化。

C中，使用UMRC2裂解物作为激酶和STING蛋白作为底物的激酶分析样品的免疫印迹。

D-E、，感染慢病毒的293T和Caki-1细胞裂解物的免疫印迹，慢病毒编码Ctrl-sgRNA或VHL-sgRNA。

F、，293T、Caki-1和HKC细胞裂解物的免疫印迹2，过夜）治疗。

G、，使用纯化GST、GST-VHL和在体外翻译的FLAG-TBK1。

H、，用载体或HA-VHL转染的293T细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹，然后用DMOG或DFO处理，如图所示。

我，293T、RCC4和786-O细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀（IP）的免疫印迹。

J-L、，感染编码Ctrl或EglN1 sgRNA慢病毒或转染指定质粒的Caki-1、RCC4EV和RCC4VHL细胞裂解产物的免疫印迹。

M、，感染慢病毒编码扰码shRNA（scr）或EglN1 shRNA序列的293T细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹，然后用载体或HA-VHL转染，如图所示。

VHL损失在慢性肾细胞癌中产生假缺氧条件，其特征是组成型HIF稳定(26). 缺氧也是大多数实体癌的特征(27). 我们将VHL熟练细胞（293T、Caki-1和HKC）和表达外源性HA-VHL的RCC4细胞暴露于缺氧条件下（1%O2)还发现p-TBK1持续上调(图1F；补充图S1E). 作为一种正交方法，我们用低氧模拟物（DMOG，DFO）处理VHL-profective Caki-1细胞，或用FG4592或DFO处理VHL-restored RCC4，786-O或UMRC2细胞。在所有病例中，我们发现TBK1磷酸化显著上调(补充图S1F 和 S1G系列). 为了解决这种上调是否是由于HIF上调的问题，我们通过两个独立的sgRNAs耗尽了HIF2α的表达，并发现TBK1磷酸化水平并没有因HIF2β的缺失而降低(补充图S1H). 我们还使用两个独立的sgRNAs在786-O和UMRC2细胞中耗尽ARNT，ARNT是HIF2α转录活性的重要结合伙伴。我们始终没有发现TBK1磷酸化受ARNT缺失的影响(补充图S1I). 总之，我们的结果表明VHL或缺氧以HIF非依赖性的方式调节TBK1磷酸化。

为了进一步确定VHL介导的p-TBK1下调是否由脯氨酰羟基化介导，我们用脯氨酸羟化酶抑制剂（DMOG，DFO）处理HA-VHL再储存的786-O细胞，发现这些抑制剂上调VHL中的p-TBK1水平，使细胞恢复到与载体细胞相似的水平(补充图S1J). 为了检查TBK1和VHL是否直接相互作用，我们使用在体外翻译了FLAG-TBK1并发现它们之间存在直接的相互作用(图1G). 为了确定VHL和TBK1的相互作用是否通过VHL介导TBK1磷酸化调节，我们检测了在没有或存在脯氨酰羟化酶抑制剂（DFO和DMOG）的情况下它们的结合，发现脯氨酸羟化酶抑制剂消除了TBK1和VHL之间的结合，这与TBK1磷酸化增加有关(图1H). 一贯地，DFO和DMOG处理也导致VHL恢复的UMRC2细胞中TBK1磷酸化和活性增加(补充图S1K). 因此，我们的数据表明，脯氨酰羟基化可能促进TBK1和VHL之间的相互作用，从而导致TBK1磷酸化和活性降低。

EglN1脯氨酸羟化酶调节TBK1-VHL相互作用和TBK1磷酸化

为了解决可能有助于TBK1羟基化的脯氨酰羟化酶及其由VHL调节的问题，我们研究了TBK1和三个EglN家族成员（EglN1、2和3）之间的相互作用，发现EglN1是主要的脯醛羟化酶，与TBK1的结合最牢固(补充图S2A). 此外，我们还发现EglN1和TBK1可以在293T、RCC4和786-O等多种细胞系中内源性结合(图1I). 接下来，我们通过两个独立的sgRNAs耗尽EglN1，发现EglN1耗尽导致TBK1磷酸化增加(图1J). 此外，表达HA-VHL的RCC4细胞中EglN1的缺失将TBK1磷酸化上调至与载体控制RCC4相似的水平(图1K). 作为一种正交方法，我们还表明，在EglN1敲除的MEFs中，TBK1磷酸化上调，但在EglN2/3敲除的MEFs中没有上调(补充图S2B). 此外，我们还在293T细胞中用两个独立的shRNAs耗尽EglN1，并持续观察到TBK1磷酸化增加(补充图S2C). 在这些EglN1缺失的细胞中，DMOG处理不能进一步上调TBK1的磷酸化，这表明EglN1是调节TBK1磷酸化的主要羟化酶(补充图S2C). 相反，我们还在Caki-1细胞中过表达EglN1，并观察到野生型但不是催化死亡的EglN1突变体（EglN1 CD，H374A/D376A）的TBK1磷酸化降低(图1L). 经脯氨酰羟化酶抑制剂FG4592或DFO处理的EglN1过度表达细胞中TBK1磷酸化的上调进一步证实了这种调节(补充图S2D 和 S2E公司). 为了研究EglN1是否调节TBK1和VHL之间的相互作用从而促进TBK1磷酸化调节，我们首先进行了在体外羟基化后进行VHL结合分析。在EglN1的存在下，TBK1和VHL之间的结合增加，表明EglN1介导的TBK1上的羟基化促进了TBK1-VHL的相互作用(补充图S2F). 然后，我们通过两个独立的shRNAs耗尽EglN1，发现EglN1耗尽导致TBK1和VHL之间的结合减少，这与TBK1磷酸化增加相对应(图1M). 总的来说，我们的结果表明EglN1使TBK1羟基化，从而导致其与VHL结合并降低TBK1磷酸化。

接下来，我们旨在确定TBK1-脯氨酰羟基化位点，这些位点可能对EglN1和VHL对其进行调节很重要。为此，我们在293T细胞中过度表达FLAG标记的TBK1，然后进行DMSO或DMOG处理，并通过质谱分析免疫沉淀的FLAG-TBK1以确定潜在的羟基化位点。我们特别感兴趣的是潜在的脯氨酸位点被羟基化，但其羟基化水平在DMOG处理后降低。我们确定了两个这样的脯氨酸羟基化位点：脯氨酸678和48(补充图S3A 和 S3B型). 接下来，我们将TBK1脯氨酸678和48突变为丙氨酸（P678A，P48A）。虽然TBK1 WT或P678A突变体与VHL有效结合，但经相互免疫沉淀证实，P48A突变型与VHL的结合减弱(图2A)表明脯氨酸48是与VHL结合的主要羟基化位点。随后，我们合成了TBK1 WT或P48-OH肽，并与VHL进行了结合分析。在这些肽中，只有脯氨酸48羟基化肽与VHL结合，尽管与羟基化HIF1α肽和VHL的结合相比要弱得多(图2B). 我们还使用泛羟基脯氨酸抗体进行免疫沉淀，发现WT（但不是催化死亡的EglN1或EglN1与DMOG结合）促进TBK1羟基化(图2C). 与脯氨酸48是TBK1主要羟基化位点的观点一致，泛羟基化IP和FLAG免疫印迹也证实P48A突变体消除了野生型TBK1中存在的所有羟基化信号(图2D). 为了确定脯氨酸48位点是否是影响TBK1磷酸化的主要位点，我们耗尽UMRC2细胞的内源性TBK1，并将WT或P48A TBK1重新导入这些细胞(图2E). 在WT TBK1表达细胞中，VHL过度表达导致TBK1磷酸化降低，与脯氨酰羟化酶抑制剂DMOG同时治疗可上调TBK1的磷酸化(图2F). 另一方面，表达TBK1 P48A突变体的细胞表现出对VHL表达具有抵抗力的构成性TBK1磷酸化(图2F). 值得注意的是，尽管总TBK1水平较低，但TBK1 P48A突变体在基础水平上也表现出较高的TBK1磷酸化。接下来，我们还想研究EglN1对TBK1的羟基化是否主要参与磷酸化调节，我们发现野生型TBK1表达细胞中两个独立的EglN1 siRNA通过EglN1缺失上调TBK1磷酸化(图2G). 另一方面，TBK1 P48A突变体表现出对EglN1缺失具有抵抗力的磷酸化结构性上调(图2G). 根据TBK1二聚体的晶体结构，P48残基位于TBK1激酶结构域的外围，EglN1可能可以访问该结构域(补充图S3C). 然后，我们检测了EglN1与TBK1-WT或P48A突变体之间的结合，发现P48A不能与EglN1结合，这表明脯氨酸48位点是EglN1的主要羟基化位点(图2H). 最后，在三维软琼脂生长试验中，与含有TBK1 WT的细胞相比，含有TBK1-P48A突变的VHL修复UMRC2细胞可以形成更多的集落(图2I). 虽然IKKε和TBK1表现出高度相似性，但围绕Pro48的序列在这两种蛋白质中是不同的(补充图S3D)表明Pro48介导的调控对TBK1是特异性的。此外，TBK1 Pro48（LRP基序）在所有脊椎动物中高度保守，表明其功能重要性(补充图S3E). 总之，TBK1在Pro48残基上羟基化，促进VHL结合并降低磷酸化。

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羟基化Pro48介导TBK1-VHL相互作用

A、，转染有指定质粒的293T细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹。

B、，肽下拉样品的免疫印迹如图所示。

C-D、，用所示质粒转染的293T细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹，并按所示用DMOG（1mM）处理。HyP表示泛羟基Pro抗体。

E、，感染编码vec、HA-TBK1或HA-TBK1-P48A的慢病毒，然后感染编码TBK1 sgRNA（sg2）的慢病毒的UMRC2细胞裂解物的免疫印迹。

F-G、，感染编码HA-TBK1-WT或HA-TBK1-P48A慢病毒并转染指定质粒或siRNA的UMRC2细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹，然后进行指定治疗。

H、，转染有指定质粒的293T细胞的全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹。

我，感染编码HA-TBK1或HA-TB01-P48A的慢病毒，然后转染HA-VHL的UMRC2细胞的代表性软琼脂生长和菌落数（双孔）量化。请参见图2E用于HA-TBK1表达。误差条代表SEM*P（P）<0.05.

J-K、，感染指示慢病毒并转染指示质粒的293T细胞的全细胞裂解物（Input）和免疫沉淀物（IP）的免疫印迹。

下一个问题是VHL与TBK1的结合如何导致其磷酸化降低。VHL通常被发现是E3连接酶复合物的组成部分，VHL在其中结合其羟基化蛋白靶点以实现泛素化和降解。我们检测了VHL对TBK1泛素化的潜在影响，但没有发现VHL诱导TBK1的泛素化(补充图S4A 和 S4B系列). 据报道，PPM1B是TBK1的磷酸酶(28). 此外，VHL还显示与PPM1B结合(29). 我们推测VHL可能影响PPM1B与TBK1的结合，从而促进TBK1去磷酸化。为了验证这个假设，首先我们过度表达VHL，发现VHL过度表达导致TBK1和PPM1B之间的结合增加(图2J)这与TBK1磷酸化降低相对应。接下来，我们通过两个独立的sgRNAs耗尽VHL，发现VHL耗尽导致TBK1和PPM1B之间的结合减少，这有助于TBK1磷酸化的增加(图2K). 总之，我们的数据表明，EglN1可以促进TBK1的羟基化、VHL结合和PPM1B的补充，这有助于TBK1去磷酸化及其活性降低。

TBK1缺失选择性抑制VHL阴性ccRCC细胞生长

由于我们表明VHL缺失导致TBK1过度激活，我们接下来的目的是观察TBK1缺失是否会对VHL缺失的ccRCC细胞造成合成致死性。为此，我们通过在几个VHL缺失（空载体，EV）或VHL恢复的ccRCC细胞系中使用几个独立的sgRNA来减少TBK1的表达。在UMRC6细胞中，CRISPR-Cas9通过sgRNAs介导的TBK1缺失导致了等基因细胞系中TBK1的有效缺失(图3A). 值得注意的是，VHL恢复VHL（甚高频）在富含血清的培养基中，无效的ccRCC细胞不影响细胞增殖和集落形成，这与先前发表的文献一致(30). 值得注意的是，TBK1的缺失导致VHL阴性细胞的严重细胞增殖缺陷，而VHL修复细胞基本上未受影响(图3B). 我们还通过三维软琼脂生长证实了这一表型(图3C——D类)并在UMRC2和RCC4细胞中进行了这些实验，得到了类似的结果(图3E——H（H）；补充图S5A 和 5亿). 然后，我们耗尽了VHL完整细胞系（如293T和HKC）中TBK1的表达，并发现未观察到强劲的生长缺陷(补充图S5C 和 S5D系列). 为了确保TBK1 sgRNA的作用是由于其对TBK1的靶向作用，我们还使用在sgRNA识别位点上携带沉默突变的TBK1构建物恢复了TBK1表达，并发现TBK1恢复可以挽救TBK1缺失诱导的细胞增殖缺陷(图3I和​和J），J型)，证明了TBK1 sgRNA的靶向作用。

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TBK1缺失选择性抑制VHL空ccRCC细胞生长

A-D、，感染了编码Ctrl-sgRNA或TBK1-sgRNA慢病毒的UMRC6EV/VHL细胞的裂解物免疫印迹（A）、结晶紫染色（B）、三维软琼脂生长图片（C）和菌落数量量化（D，重复孔）。

E-H、，感染了编码Ctrl-sgRNA或TBK1-sgRNA慢病毒的UMRC2EV/VHL细胞的裂解物免疫印迹（E）、结晶紫染色（F）、代表性三维软琼脂生长（G）和细胞集落数量量化（H，三倍微孔）。

I-J、，如图所示，感染编码sgCtrl、sgTBK1（sg2）或pLenti6-vec、pLenti6-FLAG-TBK1的慢病毒的UMRC2细胞的裂解物免疫印迹和结晶紫染色。

K-M公司，经4μM CMPD1处理的UMRC6EV/VHL细胞的代表性结晶紫染色（K）、三维软琼脂生长图（L）和菌落数（M，重复孔）的定量。

N-P、，如图所示，经二甲基亚砜或3μM TBK1 PROTAC（UNC6587）处理的UMRC6EV/VHL细胞的裂解物免疫印迹（N）、代表性三维软琼脂生长图片（O）和菌落数量（P，重复孔）的量化。

误差条代表SEM*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，n.s.表示无显著性。

为了进一步确定TBK1缺失对这些表型的影响是否依赖于其酶活性，我们表达了TBK1催化死亡突变体K38A(31)发现与WT TBK1相比，该突变体表现出细胞增殖缺陷(补充图S5E)表明TBK1酶活性对细胞增殖很重要。我们还用化合物1（CMPD1）（一种最近开发的TBK1抑制剂）处理UMRC6和UMRC2 EV或VHL表达细胞(32)并发现CMPD1有效地阻止EV细胞的软琼脂集落生长，但不阻止VHL恢复细胞的生长(图3K——M（M）；补充图S5F 和 S5G系列). 除CMPD1外，我们还使用了两种先前发表的TBK1抑制剂，BX795和MRT67307(33,34). 我们还发现，当VHL丢失时，这些TBK1抑制剂优先抑制ccRCC细胞的生长，并且在VHL恢复时，它们仅轻微影响这些细胞(补充图S5H). UMRC2细胞对最近报道的HIF2α抑制剂PT2399具有耐药性(10). 我们想知道TBK1抑制剂和PT2399之间是否有协同作用。为了回答这个问题，我们用CMPD1和PT2399处理UMRC2细胞。与单一治疗相比，我们没有发现这两种化合物之间有任何协同作用(补充图S5I 和 第5页)，这与最近发表的研究结果一致，即CDK4/6抑制剂并没有增强HIF2α抑制剂耐药细胞系中HIF2β抑制剂的疗效(35).

为了消除与这些抑制剂相关的潜在非靶向效应，我们还根据先前的文献（命名为UNC6587，补充图S6A)自之前报道TBK1 PROTACs通过补充VHL E3连接酶促进TBK1降解(36,37). 用UNC6587处理可有效消除ccRCC细胞中TBK1蛋白水平，但不会影响其近家族成员IKKε(补充图S6B 和 S6C系列). 更重要的是，尽管TBK1 PROTAC以类似的方式有效降解VHL空区和VHL WT ccRCC细胞中的TBK1(图3N；补充图S6D)，TBK1降解仅导致VHL阴性细胞中三维软琼脂上的细胞生长缺陷(图3O和​和P；P（P）；补充图S6E 和 S6F系列)，同时不影响VHL WT细胞。因此，我们的数据表明TBK1可能是伴有VHL丢失的ccRCC的治疗靶点。

TBK1缺失抑制VHL阴性ccRCC肿瘤生长

此外，我们通过向UMRC2细胞中引入两个可诱导的TBK1 shRNAs来检测TBK1对维持ccRCC肿瘤生长是否重要。添加强力霉素后，这些发夹有效地耗尽TBK1水平(图4A). 添加多西环素后，TBK1缺失导致细胞增殖降低和软糖生长减少(图4B和​和C）。C). 接下来，将对照细胞或TBK1 shRNA（#3185）细胞原位注射到NSG小鼠的肾包膜中。确认肿瘤生长后体内通过连续每周生物发光成像，我们喂小鼠多西环素诱导TBK1发夹表达，并成像小鼠以监测肾肿瘤生长。添加强力霉素10周后，表达对照发夹的细胞容易生长，而TBK1发夹表达细胞未能增殖体内(图4D——F类). 肺体外影像学数据显示，TBK1的缺失也抑制了肿瘤细胞的自发肺转移(图4G和​和H）。H（H）). 我们的累积结果表明，TBK1对ccRCC肿瘤的发生都很重要在体外和体内.

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TBK1缺失选择性抑制VHL阴性ccRCC肿瘤生长

A-C中，感染了编码可诱导Ctrl-shRNA或可诱导TBK1-shRNA的慢病毒的UMRC2细胞的裂解物（A）、代表性结晶紫染色（B）和三维软琼脂生长图片（C）的免疫印迹，然后按照指示使用强力霉素进行处理。

D-E、，强力霉素治疗前（0周）和治疗10周后的代表性生物发光成像（D）和定量强力霉素处理后的生物发光成像，来自感染编码Teton-control（Ctrl）Teton-shTBK13185（shTBK1）慢病毒的UMRC2荧光素酶稳定细胞将原位注射到NSG小鼠的肾包膜中。对大肠杆菌进行双向方差分析。

F、，肾肿瘤重量的量化（n=12）。

G-H、，代表性肺活体外生物发光成像（G）和活体外成像定量（H，n=12）。

误差条代表SEM*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001

为了检测ccRCC中TBK1过度激活的生理相关性，我们获得了18对ccRCC肿瘤和邻近正常组织，然后用总TBK1和磷酸化TBK1进行染色。通过测序和IHC染色检查这些肿瘤中VHL的表达。18个肿瘤中有8个经测序证实含有VHL突变或剪接变异体(6). 其他10个肿瘤，尽管测序没有显示VHL突变，但IHC染色显示VHL表达降低(补充图S7)这可能是由于表观遗传或其他机制。总的来说，与正常人相比，大多数ccRCC肿瘤（18对中的13对）表现出较高的TBK1磷酸化(图5A和​和B；B；补充表S1). 为了在大规模临床队列中验证这一发现，我们还获得了两组ccRCC组织微阵列（TMA），并用TBK1和p-TBK1免疫组织化学（IHC）对这些TMA进行染色。通过计算p-TBK1和TBK1的比值，与两组TMA正常值相比，ccRCC肿瘤中的p-TBK1显著上调，这反映在典型的IHC图像和定量分析中(图5C——F类；补充表S1). 注释信息表明，除TMA2中的一个外，所有肿瘤样本都是ccRCC，其中可能包含高达85%的VHL突变(2). 为了进一步确认VHL丢失状态，我们用VHL抗体对TMA2进行染色，发现45对中有37对肿瘤中的VHL水平低于配对正常组织，3对显示正常组织和肿瘤之间的可比水平，而其他5个肿瘤的VHL高于正常组织。当所有样本根据VHL状态进行划分时，我们发现肿瘤表达最高的p-TBK1水平均来自VHL（N>T）组(图5G). 根据我们的数据，相当多的VHL缺失的肿瘤对TBK1磷酸化没有影响。这可能是由于肾脏TMA的复杂性，包括拥有方法、获取时间和TMA的年龄，这可能导致某些VHL丢失的肿瘤中TBK1磷酸化丢失。

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ccRCC肿瘤组织中TBK1磷酸化增加

A-F中，来自21对ccRCC队列（a，B）、ccRCC TMA1（C，D）和TMA2（E，F）的肿瘤和配对正常组织的代表性TBK1和pTBK1（Ser172）IHC染色图片和相对pTBK1/TBK1信号强度的量化。误差条代表SEM**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001（Wilcoxon配对试验）。

G、，根据VHL表达，TMA2样本分为3组。条形图表示每个肿瘤样本的相对pTBK1/TBK1比率。

善意Ser366位点上的TBK1磷酸化物p62和对ccRCC的贡献

接下来，为了将肾癌相关TBK1活性与其已知的先天免疫功能联系起来，我们发现尽管可以检测到IRF3蛋白水平，但我们无法检测到典型的IRF3磷酸化(补充图S8A)，表明存在一种新的机制，通过该机制TBK1的激活有助于肾脏肿瘤的发生。此外，STING是dsDNA感染后先天免疫中TBK1的一个重要上游调节因子，其缺失并不影响多个ccRCC细胞系中的TBK1蛋白水平或其磷酸化(补充图S8B)进一步加强了TBK1可能以先天免疫非依赖性的方式在ccRCC中发挥作用。因为Akt是另一种发挥致癌功能的TBK1底物(38,39)，我们还通过检测Akt在Ser473和Thr308上的磷酸化来检测其活性。我们的结果表明，在TBK1缺失时，Akt-Ser473和Thr308的磷酸化没有降低(补充图S8C). 为此，我们对使用特定TBK1抑制剂CMPD1处理0、15分钟、1小时和3小时的UMRC2细胞进行了无偏见的磷酸蛋白质组学筛选(图6A). 我们选择在短时间内使用TBK1抑制剂，以期确定其直接底物。我们鉴定出3320个与1243个蛋白质相匹配的局部磷酸肽(补充图S9A). 对于每个治疗，我们都进行了三次重复分析，并且在重复之间实现了高度相关性。在差异表达的磷酸肽中，我们对至少在两个连续时间点（15 min/1hr、1hr/3hr或15 min/1hr/3hr）减少的磷酸肽特别感兴趣。通过方差分析比较，我们获得了一组显示出显著下降的磷酸肽，定义为p值<0.05，log2倍变化≤-0.5(图6B). 在这个列表中，我们注意到p62被报道为5q染色体上的一个癌基因，在肾癌中显著扩增(40). 通过将我们的列表与之前从质谱中检索到的潜在p62磷酸化位点的研究进行比较(41)，我们发现p62/SQSTM1 Ser366是从这两项研究中检索到的唯一常见位点。有趣的是，在我们的列表中，之前在先天免疫信号中指出的p62（Ser403）上的另一个磷酸化位点没有恢复(42)这表明，与某些癌症相比，先天免疫中的p62磷酸化依赖于环境。因此，我们决定研究p62作为新型TBK1底物及其磷酸化（Ser366）在肾癌中的潜在作用。

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TBK1磷酸化Ser366上的p62并稳定肾癌细胞中的p62

A、，用于识别ccRCC细胞中TBK1底物的全局定量磷蛋白组筛查示意图。

B、，MS的热图确定了磷酸化位点，其磷酸化水平在CMPD1治疗后15分钟/1h、1小时/3h或15分钟/1hr/3小时下降。

C中，免疫印迹和放射自显影在体外如图所示，用热ATP进行激酶分析。

D、，转染有指示质粒的7293T细胞裂解物的免疫印迹。

E、，来自感染慢病毒的786-O、UMRC2和UMRC6细胞的裂解物的免疫印迹。选择嘌呤霉素后3-5天收集细胞。

F、，感染编码shTBK1（3185）的慢病毒并用强力霉素治疗指定时间的UMRC2细胞裂解物的免疫印迹。

G-I、，感染慢病毒的786-O、UMRC2和UMRC6细胞裂解物的免疫印迹，然后按指示用MG132（10μM）或BA1（10nM）处理过夜。

J-L、，如图所示，感染了编码Ctrl-sgRNA或TBK1-sgRNA的慢病毒，然后感染了编码FLAG-p62突变体的慢病毒的UMRC6细胞的裂解物免疫印迹（J）、代表性三维软琼脂生长图片（K）和菌落数量化（L，重复孔）。误差条代表SEM*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，n.s.表示无显著性。

M、，正常条件下（VHL-WT）和VHL损失/缺氧条件下TBK1活性的羟基化依赖性调节的示意模型。

接下来，我们执行了一个在体外激酶分析发现，重组TBK1（而非IKKε）磷酸化p62(图6C). 此外，CMPD1以剂量依赖的方式抑制TBK1诱导的p62磷酸化(图6C). 然后我们进行了非放射性检查在体外用p62进行激酶分析，然后进行质谱分析，发现p62 Ser366是磷酸化的主要位点(补充图S9B 和 S9C系列). 此外，我们还证实TBK1可以促进转染后Ser366位点p62的磷酸化(图6D)可通过CMPD1治疗肾癌细胞（包括786-O和UMRC2）抑制(补充图S9D). 有趣的是，通过将TBK1转染细胞，我们发现尽管WT p62水平显著升高，但p62 S366A突变体的上调表达减弱(图6D). TBK1诱导的p62上调依赖于TBK1的酶活性，因为TBK1催化死亡突变体K38A未能诱导p62上调(补充图S9E). 相反，几个ccRCC细胞系（786-O、UMRC2和UMRC6）中TBK1的缺失都导致p62蛋白水平降低(图6E). 为了排除p62蛋白水平的变化是TBK1丢失诱导细胞死亡的次要影响，我们用多西环素以时间进程方式（1至3天）处理诱导的TBK1 shRNA。我们发现，细胞凋亡标志物cleaved-caspase3直到强力霉素诱导的第三天才明显出现，这发生在TBK1和p62水平降低之后，这表明TBK1对p62的调节是直接的，而不是细胞死亡的间接结果(图6F). 我们的结果表明，TBK1可以直接磷酸化Ser366位点上的p62，这对p62蛋白的稳定非常重要。根据这一假设，用外源性VHL恢复的VHL-null ccRCC显示TBK1磷酸化减少，p62蛋白水平降低(图6G). 为了确定TBK1-depletion诱导的p62下调是由于蛋白酶体降解还是溶酶体降解，我们用蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂包括BA1和NH处理这些细胞4Cl发现溶酶体而非蛋白酶体抑制剂显著提高了TBK1缺失细胞或VHL过度表达细胞中p62的表达(图6H和​和I；我；补充图S9F 和 S9G公司). 接下来，为了检测p62 Ser366磷酸化是否对介导TBK1敲除诱导表型很重要，我们在TBK1 sgRNA感染的细胞中过度表达p62 S366A或S366D，发现p62 S366 D可以有效地修复TBK1缺失诱导的细胞增殖缺陷，但S366 A不能(图6J——L（左）). 因此，TBK1诱导的p62 Ser366磷酸化对促进ccRCC肿瘤细胞生长至关重要。

我们还对18对肿瘤队列和2个TMA进行了p62 IHC染色。在这两种TMA中，肿瘤中的p62蛋白水平显著高于配对正常组织(补充图S10A 和 S10B型；补充表S1). 然后我们进行了相关分析，但没有发现p-TBK1/TBK1比率和p62蛋白水平之间存在显著相关性。这可以用多种机制解释，这些机制有助于p62蛋白的稳定性(43,44). 特别是，据报道，低氧诱导的自噬可以促进p62的降解(45)可能广泛存在于癌细胞中。正如之前发表的，肾癌的特征是染色体5q增加(46)导致SQSTM1/p62水平增加(40). 因此，具有5q增益的肿瘤可能不需要增加磷酸化TBK1，因为p62在这种情况下是高度活化的。这可能部分解释了p-TBK1水平和p62蛋白水平之间没有相关性。然而，这并不排除TBK1磷酸化也可能有助于除p62外的其他途径激活，这些途径将与5q增益协调以增加肾脏肿瘤发生，这将在未来的研究中进行研究。

综上所述，我们的结果提供了新的机制见解，TBK1过度激活促进Ser366上的p62磷酸化，从而导致p62总量和磷酸化的上调，从而促进ccRCC肿瘤的发生。

讨论

在本研究中，我们发现了VHL缺失或缺氧促进TBK1磷酸化和活性的新机制，从而促进其下游p62磷酸化、蛋白质稳定性和ccRCC肿瘤发生。在VHL恢复或常氧条件下，TBK1对脯氨酸48残基进行EglN1介导的羟基化，这将诱导VHL结合并招募PPM1B磷酸酶与VHL和TBK1相关。结果，PPM1B将使TBK1去磷酸化，从而导致TBK1活性降低。在低氧条件下，EglN1酶活性受到抑制，不能使TBK1在脯氨酸48上羟基化。因此，与VHL丢失类似，TBK1不能与VHL和PPM1B结合，这将导致构成性TBK1磷酸化。由于TBK1过度激活，TBK1将磷酸化Ser366残基上的p62并促进肾肿瘤的发生(图6M). 我们的研究描述了TBK1在肾癌细胞中的自主功能，这与其在先天免疫信号中的作用不同。

VHL丢失是透明细胞肾细胞癌的一个特征，而透明细胞肾癌占肾癌的大多数。在这种情况下，HIF2α是一个众所周知的癌基因，该基因已导致新的HIF2β拮抗剂PT2399的临床试验。然而，只有一部分ccRCC癌细胞株会显示HIF2α抑制剂的生长抑制作用(10,11). 此外，只有一部分ccRCC患者会对HIF2α抑制剂产生反应，其中一些患者对该抑制剂产生耐药性，这可能是因为缺乏针对最近发现的VHL新底物（包括ZHX2）的靶向策略(6). 我们的研究不仅添加了TBK1激酶作为VHL阴性ccRCC的新型合成致死性伙伴，而且将TBK1作为缺氧肿瘤细胞的潜在治疗靶点。然而，尽管缺氧是大多数实体癌的特征，但它不一定是所有癌细胞的普遍特征，因为在有限数量的癌症中观察到肿瘤范围的假缺氧，包括VHL缺乏的ccRCC。TBK1磷酸化在缺氧条件下其他类型癌细胞中的作用有待进一步详细研究。

p62是肿瘤细胞自噬的重要介体，因为它将通过自噬促进特定蛋白质的降解(47). 先前的研究还表明，VHL缺失的ccRCC显示了较高的自噬基础水平(48). 有趣的是，导致自噬增加的抑制剂导致VHL阴性ccRCC细胞死亡(12). 一个重要的考虑因素是p62翻译后修饰可以调节VHL阴性ccRCC细胞的表型。我们的研究首次证明由TBK1激酶介导的p62 Ser366磷酸化在维持ccRCC致癌表型方面起着重要作用。我们正在进行的研究集中在p62 Ser366磷酸化是否会调节ccRCC中的自噬信号。

十年来，随着靶向TBK1小分子的识别和开发，对TBK1的研究和兴趣不断扩大。目前已知至少有七种不同的小分子抑制TBK1活性，包括BX795、化合物II、CYT387（莫莫替尼）、MRT67307、GSK2292978A、氨来西诺和CMPD1(49). 然而，选择性问题限制了这些化合物的应用。例如，据报道，BX-795可抑制包括PDK1在内的其他激酶(33,50). MRT67307也可能抑制ULK1/2并阻断自噬(51). 只有莫莫替尼和氨来xanox在临床试验中进行了测试，但没有用于治疗肾癌(49). 最近开发的抑制剂CMPD1对TBK1的选择性优于IKKε(32)在我们的研究中使用，并显示选择性杀伤VHL阴性ccRCC细胞。我们在本研究中表明，基于Cereblon的TBK1-PROTAC可能有效抑制VHL-null ccRCC软琼脂集落生长，但不会影响VHL-WT细胞。我们正在进行的研究是优化TBK1-PROTACs以获得更高的疗效，并测试其在肿瘤异种移植中的作用。最近的报告表明，TBK1的缺失可以提高免疫检查点抑制剂在癌症中的疗效(32,52). 因此，可能通过靶向TBK1激酶，不仅可以抑制肿瘤细胞的自主信号传导，而且可以提高肾癌的免疫治疗效果。

方法

细胞培养

RCC4、786-O、UMRC2、UMRC6、Caki-1、HKC和293T细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养。786-O、Caki-1和293T是从ATCC获得的。HKC来自W.Kimryn Rathmell博士(53). 如前所述，RCC4、UMCR2和UMRC6是从Sigma获得的(6). 细胞在解冻后10-20代内用于实验。所有细胞均通过短串联重复测试进行验证。对所有细胞进行测试以确保无支原体。

抗体和试剂

兔抗TBK1（3504），兔抗TBK1磷酸-Ser172（pTBK15483），兔抗IKKε（2905），兔抗IKKε磷酸-Ser172（pIKKε，8766），兔抗STING（13647），兔抗STING磷酸-Ser366（19781），兔抗VHL（68547），兔抗EglN1（3293），兔抗HIF1α（3716），兔抗p62（39749），兔抗GST（2625），兔抗HA标签（3724）、兔抗FLAG标签（14793）、兔抗裂蛋白3（9664）、鼠抗α-管蛋白（3873）来自细胞信号技术。小鼠抗HIF2α（ab157249）、小鼠抗TBK1（ab12116）、小鼠对抗EglN1（ab103432）、兔抗PPM1B（ab70804）均来自Abcam。小鼠抗Ub抗体（8017）来自圣克鲁斯。兔抗p62磷光体-Ser366（AF7374）来自Affinity BioSciences。过氧化物酶偶联山羊抗鼠二级抗体（31430）和过氧化物酶偶联羊抗兔二级抗体。DMOG（D1070–1g）来自Frontier Scientific，去甲氧胺（DFO）（D9533–1g）、BX-795（204001–10mg）、MRT67307（506306–5mg）和Bafilomycin-A1（BA1，B1793）来自Millipore-Sigma，FG4592（15294–25mg）来自Cayman Chemical。CMPD1由无锡APP Tech按照上述程序合成(54).

TBK1上羟基脯氨酸位点的质谱鉴定

为了制备用于质谱分析的样品，用FLAG-TBK1转染293T细胞，然后进行DMSO或1mM DMOG处理。细胞在添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的EBC缓冲液中进行裂解（罗氏应用生物科学）。然后将细胞裂解物与FLAG M2珠（Sigma）在4°C孵育过夜，以捕获FLAG-TBK1蛋白。第二天，用EBC缓冲液清洗珠子三次，用SDS-PAGE分析键蛋白。凝胶经Commassie Bright Blue染色，并切除FLAG-TBK1条带进行质谱分析，以确定潜在的羟基化位点。

肽下拉试验

LifeTein合成了含有WT-Pro48（VFNNISFLRPVDVQMREFE）或羟基化Pro48（VVNNISFLR（P-OH）VDVQRMEFE）的TBK1肽。所有肽均标记有N末端生物素基团。为了进行下拉分析，将10μg WT或羟基化肽与10μl NeutraAvidin珠（Thermo Fisher 29200）在4°C的NETN缓冲液中孵育4小时。孵育后，用NETN缓冲液洗涤亲和素珠以去除游离肽，然后在NETN缓冲溶液中与体外翻译系统（Promega L1170）生成的VHL蛋白孵育。然后用Western Blot检测输入和结合VHL。

体外羟基化

将纯化的GST-TBK1蛋白（SignalChem T02–10G）与10μl EglN1（体外翻译）和75μl羟基化缓冲液（0.5M HEPES pH7.4，含10mM FeSO）混合4、1M抗坏血酸、0.1Mα-酮戊二酸和1500单位/ml过氧化氢酶C-100），形成100μl反应体系。反应在37℃下进行1小时。反应后，加入500μl NETN缓冲液和10μl GST珠（GE Healthcare），并在4°C下培养4小时，以降低GST-TBK1。然后用NETN缓冲液清洗GST珠以去除未结合蛋白，并与VHL蛋白（体外翻译）孵育过夜。第二天，经过3次洗涤后，所有输入和下拉样本均用Western Blot进行检测

体外激酶检测

用于以p62为底物的激酶分析将6μl重组人p62蛋白（Enzo Life Sciences）与22μl激酶反应缓冲液（20mM Tris-HCl pH7.4、500mMβ-甘油磷酸盐、12mM醋酸镁）、1μl 10mM ATP和1μl GST-TBK1（SignalChem）混合，形成30μl反应体系。激酶反应在30°C，500rpm下进行1hr。反应后，用SDS-PAGE分离p62蛋白，并用Commassie Bright Blue染色。剪切这些条带进行MS分析，以鉴定磷酸化位点。

使用STING作为底物进行激酶分析将5μl重组人STING蛋白（Active Motif，81182）与33μl激酶反应缓冲液（同上）、2μl 10mM ATP和10μl UMRC2细胞裂解液混合，形成50μl反应体系。激酶反应在30°C，500rpm下进行1hr。反应后，用Western blot检测总STING和磷酸化STING（Ser366）。

鉴定TBK1底物的全球定量磷蛋白组学分析

1.蛋白质组学分析的样品制备

对于磷酸蛋白质组学，UMRC2细胞用二甲基亚砜或CMPD I处理15分钟、1小时或3小时（n=3个生物复制/时间点）。用冰镇冷PBS清洗细胞三次，然后用8M尿素（Sigma，U4883）、Tris-HCl（pH 7.6）和蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche Applied Bioscience）溶解细胞。用5 mM DTT还原裂解液，用15 mM碘乙酰胺烷基化，然后用胰蛋白酶（Promega）以1:50酶蛋白比消化。使用SepPak C18 SPE滤筒（Waters，100mg吸附剂）对所得肽样品进行酸化和脱盐。洗脱液通过真空离心干燥。采用皮尔斯定量比色法测定肽浓度。通过合并12个样品中的每一个样品的等分（85μg）来生成混合样品。用200 mM TEAB重新配制500μg每个样品（和1 mg混合样品），然后在室温下用TMT 10-plex试剂（Thermo Fisher）单独标记5小时。通过对两种试验混合物进行LC-MS/MS分析，评估标记效率和样品比率。样品用50%的羟胺淬火至最终浓度0.4%。将标记的肽样品以1:1的比例混合，形成两组TMT 7复合物，通过真空离心干燥，然后使用SepPak C18 SPE滤筒（Waters，500mg吸附剂）脱盐。使用高pH反相自旋柱（Pierce）将100μg的每个TMT 7-plex组分分为六个“全局蛋白质组”组分。如前所述，使用MagReSyn Ti-MAC珠（ReSyn Biosciences）对剩余的混合样品（每个TMT 7-plex中的3 mg）进行磷酸肽富集(55). 使用高pH反相自旋柱（Pierce）将富含磷酸肽的样品分为三个“磷酸蛋白质组”组分。通过真空离心干燥蛋白质组和磷酸蛋白质组组分，并将其储存在−80°C下，直至进一步分析。

2.LC/MS/MS分析

使用Easy nLC 1200耦合QExactive HF质谱仪（Thermo Scientific）通过LC/MS/MS分析蛋白质组和磷酸蛋白质组组分。将样品注入Easy Spray PepMap C18色谱柱（75μm id×25 cm，2μm粒径）（Thermo Scientific）并用90分钟的方法分离。对于体外激酶反应样品，通过45分钟的方法分离样品。分离梯度由5–50%流动相B组成，流速为250 nl/min，其中流动相a为水中0.1%甲酸，流动相B为80%ACN中0.1%甲酸。QExactive HF在数据依赖模式下运行，其中15个最强烈的前体被选择用于随后的HCD裂解。前体扫描的分辨率（m/z 350–1600）设置为60000，目标值为3×106离子，最大注入时间为100 ms。ms/ms扫描的分辨率设置为6000，目标值是1×105离子，最大注射时间为100毫秒。固定的第一质量被设置为110m/z，并且HCD的归一化碰撞能量被设置为32%。动态排除设置为30 s，肽匹配设置为首选，排除电荷未知或电荷状态为1且≥8的前体。

3.数据分析

对于蛋白质组和磷酸蛋白质组数据，使用MaxQuant版本1.6.1.0处理原始数据文件，设置为“reporter ion MS2”和“10plex TMT”。分离纯度设置为>0.7。使用MaxQuant中的Andromeda，根据审查过的Uniprot人类数据库（2018年2月下载，包含20245个序列）搜索峰值列表，并附上常见污染物数据库。所有组分均搜索到最多两个缺失的胰蛋白酶裂解位点、固定Cys氨基甲酰化修饰、动态Met氧化和N-末端乙酰化修饰。肽错误发现率设置为1%。数据在Perseus、Microsoft Excel和R中进行了进一步分析和可视化。仅报告了在两个TMT集合中鉴定的磷酸肽，其定位概率得分>0.7。为了说明蛋白质水平，在蛋白质组和磷酸肽水平上对log2强度进行中值归一化。通过使用归一化蛋白质log2强度中值计算比率，将磷酸肽log2强度归一化为蛋白质。采用0.05的p值截止值对珀尔修斯进行方差分析（ANOVA）多样本测试。

对于p62 in-intro激酶分析样品，使用Proteome Discoverer 2.1（Thermo Scientific）处理原始数据。使用Sequest根据审查过的Uniprot人类数据库搜索峰值列表，并附上常见污染物数据库。以下参数用于鉴定胰蛋白酶肽用于蛋白质鉴定：10ppm前体离子质量耐受性；0.02Da产物离子质量耐受性；多达两个胰蛋白酶裂解位点缺失。Cys的氨基甲酰化被设置为固定修饰，Met的氧化和Ser、Thr和Tyr的磷酸化被设置成可变修饰。磷酸化RS节点用于定位磷酸化位点。肽假发现率（FDR）由Percolator节点使用诱饵数据库搜索计算，并使用1%的FDR截止值过滤数据。

原位肿瘤生长

六周龄NOD SCID伽玛小鼠（NSG，Jackson实验室）用于异种移植研究。约5×105将存活的UMRC2肾癌细胞重新悬浮在20μl新鲜DMEM培养基中，并按前述方法将其原位注射到每只小鼠的左肾中(40). 如前所述进行生物发光成像(56,57). 对于可诱导的TetOn-TBK1 shRNA，在注射后和连续几周的生物发光成像以确保肿瘤成功植入肾脏后，给小鼠喂食带有多西环素的嘌呤啮齿动物chow#5001（Research Diets，Inc.）。处死小鼠后，立即进行肺活体外成像检查肿瘤转移。肿瘤的粗略肿块以平均值±SEM表示，并使用t吨测试。所有动物实验均符合美国国家卫生研究院指南，并得到北卡罗来纳大学教堂山动物护理和使用委员会的批准。

统计分析

除非另有说明，否则未成对的双尾学生t吨-测试用于比较两组数据的实验。除非另有说明，否则所有图表均表示平均值±SEM。图形由GraphPad Prism生成。*，*****分别表示p<0.05、0.01和0.001的p值。n.s.表示无意义。

​

重要性

导致肿瘤中TBK1激活的机制以及这种激活是否与其在先天免疫中的作用有关尚不清楚。在这里，我们发现TBK1与其在先天免疫中的作用不同，在癌症中被VHL丢失或缺氧激活。

补充材料

1

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2

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致谢

我们感谢北卡罗来纳大学LCCC组织采购机构、北卡罗来纳大学动物研究中心和北卡罗来纳大学转化病理学实验室的出色帮助。感谢Michael Kracht教授、Samuel Bakhoum博士和Xuewu Zhang博士提供FLAG-TBK1、shSTING质粒和TBK1结构信息。我们要感谢UT西南大学的肾癌研究项目（KCRP）为我们提供了测试材料。这项工作得到了国防部肾癌研究计划创意发展奖（W81XWH1910813，授予Q.Z）、肾癌研究联盟（KCCure）、得克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT，RP190058，授予Q.Z）和国家癌症研究所（Q.Z，R01CA211732和R21CA223675；a.B.，R35CA197684）的部分支持。Q.Z是美国癌症学会研究学者、V学者、Kimmel学者、Susan G.Komen Career Catalyst获奖者和玫琳凯基金会获奖者。所有作者均声明无利益冲突。本研究部分基于使用UNC蛋白质组学核心设施开展的工作，该设施部分由P30 CA016086癌症中心核心支持拨款支持，以支持UNC Lineberger综合癌症中心。

财务支持：这项工作得到了国防部肾癌研究计划创意发展奖（W81XWH1910813，授予Q.Z）、肾癌研究联盟（KCCure）、德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT，RP190058）和国家癌症研究所（Q.Z，R01CA211732和R21CA223675；a.B.，R35CA197684）的部分支持。Q.Z是美国癌症协会研究学者、V学者、Kimmel学者、Susan G.Komen职业催化剂奖获得者和玫琳凯基金会奖获得者。

脚注

利益冲突：提交人声明没有利益冲突。

参考文献

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