HDAC9增加通过缺氧时自噬的表观遗传调节抑制成肌细胞分化

低氧通过HDAC9抑制C2C12细胞的肌生成

先前的研究已经证实，低氧介导的肌源性分化抑制是可逆的²然而，我们观察到缺氧条件下第2、4和6代的C2C12中MyoG和MyoD的表达水平低于常氧条件下C2C12的相同代（C2C12在缺氧和常压条件下培养3天用作第1代；图。​图2a）。2a个). MyoG和MyoD的表达水平与传代时几乎相同，并且低于正常细胞（图。​（图2b），2亿)，表明即使细胞在常压条件下培养数代，C2C12中的低氧介导的肌生成抑制也是一致的。

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图2

缺氧对C2C12细胞功能受损的影响以表观遗传依赖性的方式发生。

一,b条C2C12细胞分别在正常（P1）和缺氧（Hy）条件下在MD中培养7天，然后在常氧条件下连续传代6次。通过qRT-PCR分析C2C12细胞第2、4和6代中MyoG和MyoD的表达(一)和western印迹(b条).c（c）C2C12细胞在常氧或缺氧条件下培养7天，组蛋白脱乙酰酶家族的表达(HDAC1-11型)用qRT-PCR检测。d日western blotting检测缺氧刺激后不同时间点C2C12细胞中HDAC9的表达水平。e（电子）在常氧或缺氧条件下，加或不加NaB治疗（NaB剂量为200 μM）。（f）,克western blotting检测C2C12细胞不同传代（正常、Hy7d、HyP2、HyP4和HyP6）中HDAC9和H3K9ac的表达水平。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01. 单向方差分析

越来越多的证据表明，微环境通过乙酰化改变组蛋白的转录后修饰^18——20从而影响细胞的功能¹²因此，我们比较了在常氧条件下培养的C2C12和在缺氧条件下培养的C2C12之间的HDAC家族的表达模式。结果表明，缺氧1天后，HDAC1、2、8和9的表达水平持续升高 h、 24个 h、 和7天。尤其是，与正常对照细胞相比，缺氧暴露的C2C12中HDAC9的表达增加了近5倍（图。​（图2c，2厘米，补充图。2). 接下来，我们重点研究了HDAC9，并检测了缺氧条件下不同时间点HDAC9的表达水平。Western blotting分析表明，低氧条件下HDAC9水平显著升高，并且这种影响在不同的传代中也很明显（图。二维，f). 由于缺氧通常通过缺氧诱导因子（HIFs）影响细胞特性^三,21，我们还检测了缺氧条件下不同时间点细胞中HIF1α和HIF2α的表达水平。Western blotting分析显示HIF1α在1 缺氧h，但随后持续下降，72天后几乎消失 缺氧h，HIF2α的表达模式与缺氧的不同时间点无关（补充图。三). 这些结果表明，C2C12中HDAC9的增加与HIF没有密切关系；因此，我们在其他实验中没有研究这些因素。

已发现HDAC9更喜欢组蛋白H3的赖氨酸9、赖氨酸14和赖氨酸18²²乙酰化以调节基因功能；因此，我们在阻断HDAC9的表达后检测组蛋白3和4的乙酰化位点。结果表明，与曲古抑菌素A（TSA）相比，丁酸钠（NaB）在同时抑制HDAC9表达和促进H3K9乙酰化方面有很强的作用（补充图。4). 赖氨酸残基H3K9的表达模式与上调的HDAC9相反。此外，H3K9在低氧-C2C12的不同代次中也被低乙酰化（超过2倍），尽管HDAC9水平增强（图。2e–克)，表明低氧诱导的HDAC9升高导致组蛋白H3赖氨酸残基9处的组蛋白去乙酰化。

抑制HDAC9缓解低氧诱导的肌生成障碍

在正常氧条件下培养的C2C12中HDAC9的过度表达显著损害了其肌发生。相反，如MyoG和MyoD表达所证实的，在正常氧条件下培养的C2C12中HDAC9表达的抑制部分增强了其肌发生（补充图。5，图。​图3a）。3a年). 这些数据表明，HDAC9调节C2C12的肌发生。接下来我们研究了下调HDAC9对缺氧培养的C2C12功能恢复的治疗作用。我们观察到，NaB成功地挽救了缺氧诱导的MyoG和MyoD表达水平的降低，这表明治疗效果可能是由缺氧诱导的HDAC家族表达受到抑制引起的（图。​（图3b3亿).

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图3

抑制剂或siRNA下调HDAC9的表达可以缓解缺氧对C2C12细胞肌生成的抑制作用。 一描述了通过慢病毒载体在C2C12细胞中调节HDAC9表达。肌原性诱导后第7天用qRT-PCR和western blotting检测MyoG和MyoD的表达。b条,c（c）为了观察HDAC9对C2C12细胞肌生成的影响，用HDAC抑制剂丁酸钠（NaB）处理C2C12的细胞(b条)或使用HDAC9 siRNA(c（c）). 肌原性诱导7天后，用qRT-PCR和western blotting检测C2C12细胞中MyoG和MyoD的表达水平。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01. 单向方差分析

鉴于HDAC9直接调节C2C12的肌生成，NaB是一种广谱HDAC抑制剂，我们接下来专门下调缺氧培养C2C12中的HDAC9水平。正如预期的那样，在特异性下调HDAC9后，低氧诱导的MyoG和MyoD表达水平的降低也得到了缓解（图。​（图3c）。3厘米). 总之，这些数据表明，缺氧诱导的C2C12肌发生抑制可能是由于HDAC9水平升高，而HDAC9的下调成功地挽救了缺氧损伤的C2C12。

HDAC9通过自噬的表观遗传调控抑制肌生成

在缺氧条件下，自噬是维持细胞功能和体内平衡所必需的^23——25，我们接下来研究了缺氧对C2C12自噬的影响。LC3II在正常细胞中表达，缺氧7天后表达降低。相反，与对照组相比，p62的表达在上述缺氧条件下显著增加，p62作为自噬降解的特异性货物（图。​（图4a）。4a类). 接下来我们应用了自噬抑制剂氯喹（CQ），它可以防止溶酶体降解，从而在自噬活跃时显著增加LC3II的表达²⁶CQ实验表明，与常氧培养的细胞相比，缺氧培养的细胞缺乏进一步形成自噬体的能力，如western blotting和免疫染色所示（图。4a、b). 此外，我们发现缺氧细胞组的自噬体比常氧细胞组少，如透射电子显微镜所示（图。​（图4c）。4c类). 这些结果表明，细胞长期缺氧后，自噬活性受到抑制。此外，自噬活性的下降从P2持续到P6，表明HDAC9的作用相反。因此，缺乏自噬导致缺氧培养的第2代细胞中p62的积累，但在P2和P6之间保持不变（图。​（图4d，第4天，补充图。6). 重要的是，正常C2C12中的自噬被显著激活，并导致在有或无CQ的情况下下调HDAC9的NaB治疗后p62积累减少（图。4e–克)如western印迹和免疫染色分析所示。这些结果表明HDAC9与细胞内自噬可能有密切关系。

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图4

HDAC9表观遗传调节C2C12细胞的自噬水平。

一采用western blotting方法检测缺氧7天（含或不含氯喹（CQ））后自噬相关蛋白Beclin1、LC3I/II和特异性货物p62的表达水平。b条将C2C12细胞置于常压或缺氧微环境中培养7天，加入或不加入CQ。用免疫荧光染色法分析C2C12中的LC3（红色）/细胞核（蓝色）。比例尺：50 μm。c（c）为了观察自噬体，C2C12细胞在常压或缺氧条件下培养7天，然后用电子显微镜观察。比例尺：2 μm。d日western blotting检测C2C12细胞Hyp 2、Hyp 4和Hyp 6中自噬相关蛋白的表达水平。e（电子）用NaB和HDAC9 siRNA处理后，通过western blotting检测自噬相关蛋白的表达水平。（f）,克显示有或无CQ的正常毒性C2C12细胞中HDAC9的下调。免疫荧光染色分析C2C12细胞的LC3（红色）/细胞核（蓝色），western blotting分析自噬相关基因。比例尺：50 μm。小时,我从暴露于或未暴露于缺氧的C2C12细胞中分离出染色质，并使用乙酰化组蛋白H3K9（Ac-H3K9）和HDAC9抗体进行染色质免疫沉淀分析。IgG抗体作为对照。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01. 单向方差分析（ANOVA）

为了检测HDAC9是否直接调节自噬相关基因的表达，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析。结果表明，HDAC9在附件7,贝克林1,生命周期3a、和LC3b公司在C2C12中（图。​（图4h），4小时)表明HDAC9直接与这些自噬相关基因的启动子结合。因此，在C2C12中自噬相关基因的启动子处，H3K9也高度富集（图。​（图4i），4英寸)表明HDAC9表观遗传学调控C2C12的细胞内自噬。

接下来，我们测试了NaB或HDAC9 siRNA的治疗效果是否可以通过调节自噬直接拯救缺氧受损的C2C12。Beclin1下调后，自噬水平显著降低，然后抑制C2C12的肌源性分化，而Beclin2的过度表达增强了自噬和肌发生，如qRT-PCR和western blotting所示（补充图。7，图。​图5a）。5a级). 然后，我们观察到，通过上调Beclin1或雷帕霉素激活C2C12中的自噬可以挽救缺氧引起的受损肌肉发生（图。​（图5b，5亿，补充图。8). 更重要的是，NaB可以在缺氧后挽救C2C12的肌生成，但这种作用可以被Beclin1的下调所阻断（图。​（图5c）。5厘米). 总之，这些结果表明，缺氧主要通过HDAC9介导的表观遗传抑制自噬来减少C2C12的肌生成。接下来我们评估了自噬调节肌肉发生的机制。

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图5

HDAC9可能通过自噬调节C2C12细胞的肌源性分化。

一描述了通过慢病毒载体和siRNA对C2C12细胞中Beclin1表达的调节。用qRT-PCR和western blotting检测肌生成相关基因MyoG和MyoD。b条通过过度表达Beclin1或Rapamycin（Rap）激活缺氧C2C12细胞的自噬后，通过qRT-PCR和western blotting检测肌生成相关基因MyoG和MyoD。c（c）C2C12细胞在MD中培养，并在缺氧条件下用NaB或Beclin1 siRNA处理72 h.通过qRT-PCR和western blotting检测C2C12细胞中的肌生成相关基因MyoG和MyoD。对照组为常氧C2C12细胞。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01. 单向方差分析（ANOVA）

自噬通过激活Wnt/β-catenin通路调节C2C12细胞的肌生成

Wnts是一类分泌的信号蛋白，在多种胚胎和成人组织中调节细胞命运决定、细胞增殖和干细胞活性。许多强有力的研究报告称，典型Wnt信号传导对调节成肌细胞的肌肉再生和肌生成非常重要^27,28我们还观察到，如免疫染色和western blotting所示，缺氧后磷酸化GSK3β（p-GSK3？）和活化β-连环蛋白（ac-？连环蛋白）的表达水平均降低。此外CCND1号机组和轴2mRNA是Wnt/β-catenin途径的下游中间产物，在缺氧C2C12中含量低得多（图。6a–c类)表明Wnt/β-catenin通路在缺氧时失活。更令人信服的是，我们观察到Wnt3a对经典Wnt通路的激活有效地挽救了缺氧引起的C2C12中受损的肌生成（补充图。9). 这些数据表明Wnt/β-catenin通路的失活可能有助于缺氧导致C2C12功能受损。

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图6

自噬通过调节典型Wnt通路调节C2C12细胞的肌源性分化。

一——c（c）免疫荧光染色检测p-GSK3β和活性-β-catenin的表达水平(一)和蛋白质印迹(b条)细胞在常氧或缺氧条件下培养72天后 h.通过qRT-PCR分析典型Wnt通路的下游基因(c（c）). 比例尺：50 μm。d日Beclin1下调后，用western blotting检测C2C12细胞中p-GSK3β和活性-β-catenin的表达水平。e（电子）检测了典型Wnt通路的激活48 转染后h进行荧光素酶检测。（f）免疫染色显示，在常氧和缺氧培养72小时的C2C12细胞中，LC3（红色）和p-GSK3β（绿色）重叠 h.比例尺：25 μm。克在MD中培养C2C12细胞，并用对照siRNA或β-连环蛋白siRNA转染，雷帕霉素用于激活自噬。72例治疗后用western blotting检测肌生成相关基因 小时。小时用NaB、3-MA和DKK-1处理C2C12细胞。western blotting检测HDAC9、Beclin1和ac-β-catenin的表达水平。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*P（P） < 0.05, **P（P）<0.01.c（c）单因素方差分析（ANOVA）。e（电子）未配对双尾学生的t吨-测试

鉴于新出现的研究表明自噬可能有助于调节典型Wnt通路²⁹，我们首先检测慢病毒调节自噬后p-GSK3β和ac-β-catenin的表达。下调贝克林1在正常氧条件下，C2C12损伤Wnt通路，模拟缺氧C2C12的表型。相反，恢复贝克林1如western blotting和TOPflash分析所证实的，缺氧细胞中的表达重新激活了Wnt途径（图。第6天，第5天). 这些结果表明Wnt通路被激活或失活取决于自噬水平。更重要的是，我们在常氧和缺氧条件下培养C2C12 72 h，并通过共焦激光扫描显微镜观察p-GSK3β和LC3。结果表明，LC3在常氧和缺氧条件下均能与p-GSK3β共定位。值得注意的是，合并后的图像显示，由于p-GSK3β和LC3的表达水平降低，缺氧细胞组中p-GSK3－β和LC3－的共定位降低（图。​（图6f）。第6页). 总之，这些结果表明，自噬可能通过磷酸化GSK3β直接调节典型Wnt途径。

然后我们研究了自噬是否通过Wnt/β-catenin途径调节肌源性分化。结果表明，β-catenin表达下调降低了C2C12的肌生成。重要的是，β-catenin下调后，雷帕霉素不能恢复被抑制的肌生成（补充图。10，图。​图6g）。6克). 最后，为了确认组蛋白去乙酰化酶、自噬和典型Wnt通路的调控网络，C2C12被NaB、3-MA和DKK-1处理。值得注意的是，NaB抑制HDAC9的表达并促进其余下游基因的表达，而自噬抑制剂3-MA抑制Beclin1和ac-β-连环蛋白的表达。此外，典型Wnt途径抑制剂DKK-1仅阻断ac-β-catenin的表达（图。​（图6h）。6小时). 总之，这些结果表明，经典Wnt途径受到HDAC9介导的自噬的下游调节。

MTT分析

根据制造商的方案（Sigma-Aldrich），使用为期8天的3-（4,5-二甲基噻唑-2yl）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定在常氧或缺氧条件下培养的C2C12成肌细胞的活性。在490时测定吸光度 nm，使用微孔板阅读器（美国弗吉尼亚州威努斯基市Bio-Tek仪器公司）。实验一式三份。

5-乙炔基-2′-脱氧尿苷测定

根据制造商的说明，使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）DNA体外增殖检测试剂盒（RiboBio，中国广州）测定在常氧或缺氧条件下培养的C2C12成肌细胞的增殖。流式细胞术对这些先前标记有EdU的细胞进行。

细胞凋亡分析

根据制造商的说明，使用凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen）测定在常氧或缺氧条件下培养的C2C12成肌细胞的凋亡。通过检测Annexin-V和碘化丙啶（PI）染色，并将百分比与对照组测定的数字进行比较，流式细胞术分析细胞凋亡，区分存活细胞、死亡细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。

免疫荧光染色

C2C12细胞在常氧或缺氧条件下培养，直到汇合，然后在分化培养基中维持3天，以促进成肌细胞融合。然后用4%多聚甲醛固定细胞15 4时最小值 °C，用0.2%Triton X-100在PBS中透化10 min，在5%正常山羊血清中阻断30分钟 对于免疫荧光染色，C2C12细胞与肌球蛋白（R&D系统，1:100，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国，MAB4470）或LC3I/II（细胞信号，1:100和12741）一级抗体在4℃孵育过夜 摄氏度。随后，将其与Cy3-/FITC二级抗体孵育1 根据制造商的说明，在室温下放置h。

qRT-PCR分析

根据制造商的说明，使用TRIzol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从C2C12细胞中分离出的总mRNA被反转录为cDNA。使用Primescript进行实时PCR检测^TM（TM）RT主混合液（Takara Bio Inc.，日本Otsu）、SYBR Premix Ex TaqTMII（Takar Bio Inc.）和CFX96商标实时PCR检测系统（Bio-Rad，加利福尼亚州，美国）。的表达式级别肌细胞生成素,MyoD公司,HDAC1-11型,生命周期3,贝克林1,附件7,轴2、和CCND1号机组使用补充表中列出的引物（中国桑光生物技术公司）进行检测1.GAPDH公司作为一种家政基因。实验一式三份。

蛋白质印迹分析

C2C12细胞在RIPA裂解缓冲液中采集（中国上海贝尤泰姆生物技术研究所）。使用BCA分析对全细胞蛋白提取物进行定量，用SDS-PAGE 8–12%分离，然后转移到PVDF膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。抗体包括Myogenin（Abcam，1:1000，ab124800，Cambridge，MA，USA）、MyoD（Santa Cruz，1:200，sc-377460）、HDAC9（Abcam1:1000，ab59718）、HIF1α（Abcam-1:1000，ab 179483）、HIF2α（Abcam，1:1000；ab179825）、H3K9（Abcam，1:11000，ab32129）、H3C14、H3K18、H4K16（Cell Signaling，1:1000）、LC3I/II（Cell信号，1:1000、12741）、，Beclin1（Cell Signal，1:1000，3738）、Atg5（Cell信号，1:1000、12994）、Atg 7（Cell Signal，1-1000，8558）、Atg12（Cell Signal，1/1000，4180）、p62（Cell信令，1:1000和23214）、p-GSK3βSer9（Cell Sygnal，1:000，9323）、GSK3？（Cell Senal，1:100012456）和活性-β-catenin（Millipore，1:800，05–665）。用GAPDH（Abcam，1:4000，ab181602）对剥离膜进行重复处理，作为负荷控制。与抗兔或抗鼠IgG二级抗体孵育后，使用ECL试剂盒（Beyotime生物技术研究所）进行信号检测（CoWin Bioscience Co.，中国北京）。实验一式三份。

转染试验

将抗小鼠HDAC9（Gene-Pharma Co，中国上海）、β-catenin（Gene-Pharma Co，上海）、Beclin1（Gene-Partra Co）或阴性对照（Gene-Pathara Co）的siRNA双链寡核苷酸以最终浓度50转染到正常和缺氧的C2C12成肌细胞中 nM使用siPORTNeoFX。更换培养基8 小时后。实验一式三份进行。

小分子给药

为了研究丁酸钠（NaB）对C2C12细胞肌发生的影响，在缺氧条件下用NaB（200 μM，西格玛，156-54-7）。为了检测NaB和曲古抑菌素A（TSA）对C2C12细胞自噬的影响，在常氧条件下，用NaB（200 μM）和TSA（100 nM，西格玛，58880-19-6）。雷帕霉素（100 nM、Sigma、53123-88-9）、NaB（200 μM），3-MA（5 mM，Sigma，5142-23-4）和重组小鼠DKK-1（100 ng/ml，BioLegend，San Diego，CA，USA，759604）加入到在常氧或缺氧条件下培养的C2C12细胞中，以检测自噬和信号通路之间的关系。所有用于qRT-PCR和western印迹的细胞样本均按照制造商的说明收集。

透射电子显微镜（TEM）分析

用胰蛋白酶收集C2C12细胞，用无血清PBS洗涤，主要固定在4%戊二醛和4%多聚甲醛（Sigma，pH 7.2）中过夜。用PBS清洗后，细胞在一系列乙醇溶液（50、70、95和100%）中逐渐脱水，然后原位嵌入LX-812树脂中（美国拉德研究工业公司）。随后，超薄切片（60 nm）用1%乙酸铀酰（30 和柠檬酸铅（10 最小值）。然后使用加速电压为100的FEI Tecnai G12 Spirit BioTwin透射电子显微镜（美国FEI公司）观察细胞的超微结构 数字图像由Veleta CCD摄像机拍摄（德国奥林巴斯SIS）。

染色质免疫沉淀

我们使用染色质免疫沉淀（ChIP）检测试剂盒（Merck Millipore，Billerica，MA，USA，17–371）根据制造商的方案确认蛋白质和基因启动子之间的结合。使用抗HDAC9抗体（Abcam，ab59718）和多克隆抗组蛋白H3抗体（乙酰基K9）（Abcam，ab10812）作为检测抗体，使用正常兔IgG（Merck Millipore）作为阴性对照。用qRT-PCR分析所有沉淀DNA样品，并将结果归一化为输入值。跨H3K9-/HDAC9-结合位点的引物附件7，Beclin1，LC3a、和LC3b公司发起人（中国桑光生物技术公司）列于补充表2.

后肢缺血模型

雄性4个月大的小鼠购自中国西安第四军医大学动物中心。16只小鼠被随机、均匀地分为两组（每组8只），接受假手术或股动脉结扎手术。简单地说，在腹股沟韧带下方的近端区域和股骨深支上方的远端区域结扎股动脉。然后在结扎部位之间切开。所有涉及动物的程序都得到了第四军医大学动物使用和护理委员会的批准（许可证编号：SYXK 2012-0023）。

人类受试者

第四军医大学附属医院因动脉硬化闭塞症对两名动脉硬化闭塞患者（男性）进行了检查，年龄分别为48岁和53岁。从两名46岁和50岁的车祸致骨折患者（男性）身上采集健康人体肌肉样本。

该临床研究得到了第四军医大学附属医院伦理委员会的批准，并在样本采集前获得了所有参与者的书面知情同意。

这项工作得到了国家自然科学基金（31571532）、陕西省重点研发计划项目（2017ZDXM-SF-038）和国家自然科学项目（81271176和31601099）的资助。