脑低温后缓慢复温对近期胎羊全脑缺血后白质恢复的影响
, , , , ,
和 周国庆（K.Q.Zhou）
新西兰奥克兰奥克兰大学生理学系
新西兰奥克兰奥克兰大学生理学系
通讯作者。 2019年3月19日收到；2019年6月27日验收。
开放式访问本文是根据Creative Commons Attribution 4.0国际许可证授权的，该许可证允许以任何媒体或格式使用、共享、改编、分发和复制，只要您对原始作者和来源给予适当的信任，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指出是否进行了更改。本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的知识共享许可证中，除非材料的信用额度中另有说明。如果文章的Creative Commons许可证中没有包含材料，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，则您需要直接从版权所有者处获得许可。要查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. 摘要
人们普遍认为，低温治疗缺氧缺血性脑病后缓慢复温可以改善预后，但其对HI后白质损伤的影响尚不清楚。胎羊（0.85妊娠期）30只 最小缺血-母婴（n = 8） ，或体温过低3-48 h，快速自然复温超过1 h（缺血-48 h低温，n = 8） ，或48 缓慢复温24小时以上 h（缺血-低温复温，n = 7） 或72 h快速复温（缺血-72 h低温，n = 8). 缺血与全部和成熟少突胶质细胞丢失、髓鞘碱性蛋白（MBP）和2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（CNPase；未成熟/成熟少突细胞）面积分数降低以及小胶质细胞和星形胶质细胞增加有关。所有低温方案均增加了少突胶质细胞的总数，但只有缺血72小时低温可以减轻成熟少突胶质的丢失。所有低体温方案都同样增加MBP的面积分数，而对CNPase的面积分数只有中间影响。所有的低温方案都抑制了小胶质细胞，在缺血-72小时低温后减少最大，在缺血缓慢复温后产生中等效果。相反，星形胶质细胞的诱导仅在缺血-低温复温后显著降低。总之，与快速复温相比，低温后缓慢复温并不能提高少突胶质细胞的存活率或髓鞘形成，也不能抑制微胶质增生，但可以适度减少星形胶质细胞增生。
主题术语：疾病的实验模型，缺氧缺血性脑病
介绍
治疗性低温始于前6年 出生后数小时，持续72小时 h显著降低足月和近足月婴儿缺氧缺血性脑病（HIE）后的死亡或中重度残疾1至关重要的是，低温与幸存者长期神经认知和运动障碍的改善有关2虽然低温最佳神经保护所需的大多数参数，包括机会窗口、深度和持续时间，现在都已被很好地理解三，没有人为控制的证据表明最佳复温率。临床前模型中有越来越多的证据表明，复温的大部分效果是由低温的总持续时间介导的4重要的是要认识到，尽管大多数神经保护研究的重点都集中在临床和实验上的神经元损失上，但足月HIE与严重的白质损伤有关。复温速率对白质损伤的影响尚不清楚。
白质损伤的主要临床模式包括内囊后肢损伤和分水岭分布的皮质白质损伤5,6例如，在患有中度至重度HIE的婴儿中，磁共振成像（MRI）内囊后肢的异常信号强度与2岁时受损的独立行走高度相关6同样，在一组84例HIE足月儿中，基底节和丘脑MRI表现正常，白质损伤的严重程度与认知、视觉、语言、行为和癫痫问题显著相关7.
与此一致，30 近期胎羊全脑缺血分钟数与少突胶质细胞的深度丢失、髓鞘的丢失和破坏以及脑回内和脑室周围白质中小胶质细胞数量的增加有关4,8,9.治疗性低温开始90 全脑缺血后几分钟，白质恢复明显改善，但当开始低温延迟至3或5.5时，效果明显减弱 小时9,10。我们最近表明，与低体温开始相比3 缺血小时后持续至72小时 小时，48 低温小时与复温后心电图（EEG）功率显著下降和神经元存活率降低有关4在这些方案中，胎羊在大约1 小时。然后，我们测试了缓慢复温可能缓解48小时后脑电图恶化的可能性 小时协议11有趣的是，在体温过低48天后 24小时以上控制缓慢复温 约0.2小时 与快速自发复温相比，°C/h与脑电图功率恢复的改善有关，但与~5℃快速自发复热相比，灰质存活率较低 °C/h。值得注意的是，48后快速和缓慢复温 与72小时相比，低温小时的组织学神经保护作用降低 数小时的低温和快速复温，表明缓慢复温的效果只是由较长的总冷却时间介导的。在本研究中，在相同的实验队列中11，我们验证了这样一个假设，即48天后缓慢复温，尽管神经元存活率没有改变，但电描恢复较好 通过改善白质保护来调节数小时的低体温。
方法
胎儿外科
我们之前发表了与本研究相同的动物队列的pH值、血气、温度变化、电生理数据和神经元存活率11所有程序和方法均由奥克兰大学动物伦理委员会根据新西兰动物福利法和新西兰政府初级产业部制定的动物研究道德行为准则批准。实验报告符合ARRIVE指南12.
在妊娠125-126天（足月145天）时，40只母羊在无菌条件下接受了胎儿器械手术。取走了食物，但没有取走水18 手术前几个小时。保温室的温度保持在16℃ ± 1摄氏度（°C）和50 ± 湿度为10%（%） 小时（h）亮/暗周期（亮时06:00–18:00）。给母羊服用长效土霉素，剂量为1毫升/10公斤（20 mg/kg，Phoenix Pharm，新西兰奥克兰）肌肉注射预防。静脉注射异丙酚（5 毫克/千克；阿斯利康有限公司，新西兰奥克兰），氧气中保持2–3%的异氟醚（O2)插管后（澳大利亚新南威尔士州Bomac动物健康中心）。对母羊进行通风，并持续等渗盐水灌注（约250 mL/h）。训练有素的麻醉人员监测产妇心率、血压和麻醉深度。主要手术野消毒后，沿白线进行剖腹手术，然后在无子叶的区域和平行于子宫主要血管的区域进行5-6厘米（cm）的子宫切口，以暴露胎儿。
在胎儿肱动脉中放置聚乙烯导管，以测量平均动脉压（MAP）。羊膜腔导管固定在胎儿肩部。皮下心电图（ECG）电极（Cooner Wire Co.，Chatsworth，California，USA）缝合在右肩和左第五肋间，用于监测胎心率（FHR）。为了防止缺血期间椎动脉向颈动脉供血，结扎了椎枕吻合口13,14在双侧颈动脉周围放置由硅胶管（Degania silicone，Kibbutz Degania Bet，以色列）内部制造的双基地充气封堵器袖套，以诱导脑缺血。此外，右颈动脉接受了超声流量探头（尺寸3 S、 跨声速系统，纽约州伊萨卡），用于测量颈动脉血流量（CaBF）。
将两对由7股不锈钢丝（AS633–7SSF；Cooner wire Co.）制成的脑电图（EEG）电极放置在矢状旁顶叶皮层（10和20）的两侧半球上 前角前mm和10 mm横向）。电极用氰基丙烯酸酯胶固定在硬脑膜上，并用一根参考接地线缝合在胎儿枕骨上。通过放置第三对电极5测量皮层阻抗 相对于EEG电极横向mm（3SS F、 Cooner Wire Co.）。将另一对电极（Cooner线）缝入颈肌，以记录胎儿肌电图（EMG）的活动。将热敏电阻（Inc-Temp-1；Mallinckrodt Medical，St.Louis，MO）插入矢状旁硬膜（30 mm）。将第二个热敏电阻放入食道，用于测量体温。由硅管（3）制成的冷却盖 × 6 mm，Degania Silicone）放置在胎儿头部并用缝合线固定。
胎儿被送回子宫，并用温热的无菌盐水（约500 37毫升 °C），以抵消羊水损失。所有导联都是通过母体侧腹的切口进行的。庆大霉素（80 mg庆大霉素、Pharmacia和Upjohn，Rydalmere，New South Wales，Australia）用于羊膜腔。布比卡因（10 将ml（0.5%）和肾上腺素（阿斯利康公司，新西兰奥克兰）注射到产妇剖腹手术切口的皮肤上。将一根导管插入产妇的大隐静脉，用于术后护理和安乐死。
术后护理
动物被安置在单独的代谢笼中随意获得食物和水。术后4天内每天对母羊静脉注射预防性抗生素（600 mg苄青霉素钠，诺华公司，新西兰奥克兰，和80 mg庆大霉素）。通过持续追踪MAP、FHR、CaBF、EEG活动以及胎儿血液采样来监测胎儿健康状况。持续注入肝素化盐水（20 0.2时的U/mL mL/h）以确保胎儿导管保持通畅，同时每天用肝素盐水冲洗母体导管。
数据记录
数据记录开始24 实验开始前数小时，并继续进行剩余的实验。使用自定义数据采集程序（LabView for Windows，National Instruments，Austin，Texas，USA）将数据连续记录并保存到磁盘以进行离线分析。采集动脉血样进行导管前pH值、血气、碱过量（美国马萨诸塞州Ciba-Corning Diagnostics 845血气分析仪和协方差仪）、葡萄糖和乳酸测量（美国俄亥俄州黄泉市YSI型号2300）。所有胎儿的胎龄基线生化值均正常。
实验方案
实验开始于129年 ± 1 妊娠日（d）。实验通常在上午9点进行。在缺血结束后的2、4和6小时以及此后的每天采集血样。动物被随机分为五组：假缺血后常温（sham-control，n = 9） ；缺血后出现常温（缺血-缺氧，n = 8); 缺血后72 低温小时数（缺血72小时低温，n = 8） ；缺血后48 低温小时数（缺血-48小时低温，n = 8); 或缺血后48 低温24小时 缓慢复温时间（缺血-缓慢复温，n = 7).
通过使用不同体积的无菌盐水对每个硅胶颈动脉闭塞器的两个球囊进行充气，并使用夹钳对球囊充气线进行双重夹紧，可实现脑缺血。在EEG活动和CaBF快速下降以及皮层阻抗延迟增加的情况下，封堵被证实是成功的。保持闭塞30 分钟，然后通过释放夹具立即终止。使用至少80%CaBF的恢复来确认闭塞的成功逆转。成功的闭塞还显示闭塞后脑电图背景持续抑制（≤10 分贝）。
冷却已启动3 通过将胎儿头皮上的冷却盘管连接到冷却水浴中的泵（格兰特Tx150，格兰特仪器有限公司，英国剑桥），并通过冷却盘管循环冷水，在闭塞结束后数小时。目标硬膜外温度为31–33 摄氏度。72时停止冷却 缺血72小时低温组48小时 缺血48小时低温组和缓慢复温组均为4小时。在sham-ischemia和ischemia-normothmia组，水没有循环，冷却盘管与胎儿体温保持平衡。
在缺血72小时低温组和缺血48小时低温组中，通过关闭冷却机并让温度自动恢复到基线温度，可诱导快速复温。在缺血-流复温组中，胎儿复温时间超过24小时 通过计算机控制，浴温线性上升高达39度（0.2度） °C/小时。
用过量的戊巴比妥钠（300 mg/mL，戊巴比妥300，新西兰普罗旺特私人有限公司）在缺血7天后注入大隐静脉。记录每次妊娠的胎儿数量、性别、胎儿体重和单个器官重量（大脑、肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肾上腺）。大脑被移除并固定，以进行脑损伤的组织学评估。
组织学分析
现场胎儿大脑的固定是通过灌注500只颈动脉来实现的 mL 0.9%盐水，然后是1000 mL 10%磷酸盐缓冲福尔马林，用标准石蜡组织制剂包埋13切割厚度为10微米（μm）的冠状切片，并将其安装在铬明矾明胶涂层的载玻片上。切片取自背部海马突起明显的层面。
免疫组织化学
组织在二甲苯（2）中脱蜡 × 15 最小值）。在乙醇浓度降低的情况下对组织进行再水化（100、95和70%；5 每分钟）。切片清洗3次，共5次 在磷酸盐缓冲盐水（PBS；3）中每分钟 × 5 最小值）（2 10x PBS的L（0.1 M） ：160 g氯化钠，4 克氯化钾，28.8 g磷酸钠，4.8 g KH2PO4，pH 7.4）。使用柠檬酸缓冲液（dH）通过压力锅（2100 Antigen Retriever，Aptum，Southampton，England）方法进行抗原检索20 450 ml，柠檬酸8 mL和柠檬酸钠42 毫升）。部分在PBS中清洗（3 × 5 每分钟）。在甲醇中使用3%过氧化氢阻断内源过氧化物酶活性30 在室温下用锡箔覆盖分钟，以防止暴露在阳光下。部分在PBS中清洗（3 × 5 并在PBS中用300微升（μL）3%的正常山羊血清（NGS，Life Technologies Ltd，新西兰奥克兰）封闭。
切片在4点孵育过夜 初级抗体中的°C（1:200）。其中包括小鼠抗电离钙结合适配器分子1（Iba-1，Cat#ab15690 Abcam，Cambridge，England），作为小胶质细胞/巨噬细胞的标记物；小鼠抗髓鞘碱性蛋白（MBP，Cat#MAB381，Lot#NG1726107，Millipore，Burlington，Massachusetts，USA）作为髓鞘形成的标志物，小鼠抗2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（CNPase，Cat#ab6319，Abcam）作为未成熟/成熟少突胶质细胞的标志物；小鼠抗APC抗体（CC-1，Cat#ab16794，Abcam）作为成熟少突胶质细胞的标记物；小鼠抗少突胶质细胞谱系转录因子2（Olig-2，Cat#ab236540，Abcam）作为总少突胶质纤维细胞的标记，兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP，Cat#ab 68428，Abcam）作为3%NGS中星形胶质细胞的标记。
用PBS（3）清洗后 × 5 每分钟），切片在室温下培养3 在含有3%NGS的1:200生物素化山羊抗鼠（Cat#BA-9200，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA，Iba-1，CNPase，MBP，CC-1，Olig-2）或抗兔（GFAP，Cat#BA-1000，Vectors Laboratory）二级抗体中放置1小时。在1:200 ExtrAvidin辣根过氧化物酶（Cat#E2886，Sigma-Aldrich Ltd，Auckland，New Zealand）中培养2个 在室温下放置小时。使用3,3-二氨基联苯胺（Sigma-Aldrich，Ltd.）对阳性染色进行可视化。通过显微镜观察组织以限制背景染色。通过浸入PBS溶液中来停止染色。然后在酒精浓度增加的情况下对载玻片进行脱水（70、95和100%；5 最小值）和二甲苯（2 × 15 （西班牙巴塞罗那Scharlab S.L.），使用盖玻片进行安装。
成像和分析
使用Nikon eclipse 80i光学显微镜（Nikon Instruments Inc.，Tokyo，Japan）对每只动物的两个切片进行成像。使用NIS elements Basic Research软件（澳大利亚希尔顿Coherent Scientific）在20倍放大的条件下对Iba-1、Olig-2和CC-1染色切片进行成像，同时在40倍放大的情况下对MBP、GFAP和CNPase进行成像。从两个半球的第一副矢状回（IGWM1）和第二副矢状环（IGWM2）的脑回内白质束和脑室周围白质（PVWM）采集图像。每个动物的每个区域共获得4个视野。
使用Image J软件（美国贝塞斯达国家卫生研究所）对免疫组织化学图像进行量化。伊巴-1 + ve小胶质细胞/巨噬细胞 + ve星形胶质细胞，Olig-2 + ve少突胶质细胞和CC-1 + ve成熟少突胶质细胞通过人工计数每个阳性标记细胞进行定量。包括静止（分支）和活动（变形虫）小胶质细胞。使用图像J（美国国家卫生研究所）上的Auto（MBP）和Huang（CNPase）以及Mean（GFAP）自动阈值设置，对MBP、CNPase和GFAP染色的面积分数进行量化。
统计
采用混合设计方差分析（ANOVA）评估脑缺血和低温对生理和组织学参数的影响，使用时间或区域作为重复测量（SPSS v23，SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）。当发现统计显著性时，使用单变量方差分析和Tukey校正进行事后比较。使用Kruskal–Wallis检验评估非参数数据。当P < 0.05，数据表示为平均值 ± 平均值标准误差（SEM）。
结果
胎儿人口统计数据、pH值、血气分析和温度
尸检时，各组之间的性别、胎儿体重、器官重量或单胎婴儿比例没有差异（表). 与假对照组相比，缺血-母性贫血与脑重量显著降低相关（P < 0.05），在缺血72h低温组显著减弱。缺血-低温复温组和缺血-48 h低温组的脑重量与缺血-母体血相比没有显著差异。
表1
| 组 | N个 | 胎儿（克） | 大脑（g） | 单身：双胞胎 | 女性：男性 |
|---|
| Sham-control公司 | 9 | 4930 ± 275 | 48.9 ± 1.9 | 8: 1 | 4: 5 |
| 缺血常温 | 8 | 4575 ± 311 | 40.1 ± 1.5* | 7: 1 | 5：3 |
| Ischemia-48h体温过低 | 8 | 4263 ± 204 | 41.9 ± 1.7* | 8: 0 | 6: 2 |
| 缺血-流动复温 | 7 | 4744 ± 247 | 43 ± 1.4* | 7: 0 | 3: 4 |
| 缺血-72h低温 | 8 | 4720 ± 145 | 44.9 ± 0.9# | 8: 0 | 4: 4 |
低温与大脑温度显著降低至31.3相关 ± 0.2 缺血72小时低温组和32.3℃ ± 0.3 缺血-48小时低温和缺血-低温复温组的温度为°C，而对照组为39.5 ± 0.1 °C，缺血-母婴组（p < 0.05)11.食管温度降至37 ± 1 低温期间的°C（P < 0.05). 在缺血-48h低温组和缺血-72h低温组中，冷却结束时，大脑温度在48和72时迅速升高 小时。相反，在缺血-低温复温组，脑温逐渐升高（0.2 °C/小时） 缺血后小时。
免疫组织化学
缺血-母性贫血与1型糖尿病患者脑回内白质Olig-2阳性少突胶质细胞数量的总体减少有关标准（IGWM1）和2第（IGWM2）矢状旁回和室周白质（PVWM）与假对照组相比（P < 0.05），所有低温方案均部分减弱（P < 0.05，图). 与假手术对照组相比，缺血母血症还与CC-1阳性成熟少突胶质细胞数量的显著减少有关（P < 0.05，图). 与缺血常温相比，缺血72小时低温与CC-1阳性成熟少突胶质细胞数量的显著增加有关，并且与假对照没有显著差异，而与缺血常温相比，缺血48小时低温和缺血缓慢复温没有显著影响。
第一脑回内白质中的总Olig-2阳性少突胶质细胞数（左）和显微照片（右）(B类,E类,H（H）,K,N个)和第二个(C类,F类,我,我,O（运行）)矢状旁回和室周(一个,D类,G公司,J型,M（M）)假对照中的白质(A–C，个 = 9） 、缺血-母婴(D–F型，个 = 8） ，缺血-48小时低温(G–I型，个 = 8） ，缺血-缓慢复温(J型–我，个 = 7） 和缺血72小时低温(米-米，个 = 8） 组。数据是平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05 vs假手术对照。#P（P） < 0.05 vs缺血-母婴。比例尺200 微米。
第一个脑回内白质中成熟的CC-1阳性少突胶质细胞数量（左）和显微照片（右）(B类,E类,H（H）,K,N个)和第二个(C类,F类,我,我,O（运行）)矢状旁回和室周(一个,D类,G公司,J型,M（M）)假对照中的白质(一个–C类，个 = 9） 、缺血-母婴(D类–F类，个 = 8） ，缺血-48小时低温(G–I型，个 = 8） ，缺血-缓慢复温(J型–我，个 = 7） 和缺血72小时低温(M（M）–O（运行），个 = 8） 组。数据是平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05 vs假手术对照。#P（P） < 0.05 vs缺血-母婴。比例尺200 微米。
与对照组相比，缺血与所有白质区MBP染色面积分数的总体减少有关（P < 0.05，图). 所有低温组MBP标记的面积分数均比缺血-母婴血增加，与假对照组相比无显著差异。同样，缺血与CNPase标记面积分数的整体显著降低有关（P < 0.05，图). 总的来说，低温与CNPase标记的中间面积分数有关。事后测试显示，缺血-48 h低温组和缺血缓慢复温组与假对照组或缺血常温组没有显著差异，而缺血-72 h低温组的CNPase标记面积分数显著低于假对照组（P < 0.05).
第一脑回内白质髓鞘碱性蛋白（MBP，左）和显微照片（右）的面积分数(B类,E类,H（H）,K,N个)和第二个(C类,F类,我,我,O（运行）)矢状旁回和室周(一个,D类,G公司,J型,M（M）)假对照中的白质(A–C，个 = 9） 、缺血-母婴(D–F型，个 = 8） ，缺血-48小时低温(G–I型，个 = 8） ，缺血-低温复温（J-L，n = 7） 和缺血72小时低温(米-米，个 = 8） 组。数据是平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05 vs假手术对照。#P（P） < 0.05 vs缺血-母婴。比例尺200 微米。
第一脑回内白质中2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（CNPase，左）和显微照片（右）的面积分数(B类,E类,H（H）,K,N个)和第二个(C类,F类,我,我,O（运行）)矢状旁回和室周(一个,D类,G公司,J型,M（M）)假对照中的白质(A–C，个 = 9） 、缺血-母婴(D–F型，个 = 8） ，缺血-48小时低温(G–I型，个 = 8） ，缺血-缓慢复温(J–L型，个 = 7） 和缺血72小时低温(M–O型，个 = 8） 组。数据是平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05 vs假手术对照。比例尺200 微米。
与假对照组相比，缺血与所有白质区Iba-1阳性小胶质细胞数量的总体增加有关（图，p < 0.05). 与缺血-母体血相比，所有低温方案均显著降低了小胶质细胞数量，但在缺血-48小时低温和缺血-低温复温组中，小胶质细胞的数量仍显著高于假对照组。缺血-低温复温显示小胶质细胞数量中度减少，与缺血-48小时低温或缺血-72小时低温无显著差异。缺血72小时低温与小胶质细胞数量的最大绝对减少相关，显著低于缺血48小时低温，与假手术对照组无显著差异（P = 0.05).
心室周围白质中的电离钙结合适配器分子1（Iba-1）阳性小胶质细胞数（左）和显微照片（右）(一个,D类,G公司,J型,M（M）)第一个脑回内白质(B类,E类,H（H）,K,N个)和第二矢状旁回(C类,F类,我,我,O（运行）)在假控制中(一个–C类，个 = 9） 、缺血-母婴(D类–F类，个 = 8） ，缺血-48小时低温(G公司–我，个 = 8） ，缺血-低温复温（J-L，n = 7） 和缺血72小时低温(M（M）–O（运行），个 = 8） 组。数据是平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05 vs假手术对照#P（P） < 0.05与缺血常温相比。一个P < 0.05 vs缺血-48小时低温。比例尺200 微米。
缺血与GFAP阳性星形胶质细胞数量的总体显著增加有关（P < 0.05），但总面积分数呈下降趋势（P = 与假对照组相比，在所有白质区（图). 与缺血母婴相比，缺血再温与所有白质区GFAP阳性星形胶质细胞数量的总体显著减少相关，而缺血48小时和缺血72小时低温组仍显著高于假对照组（P < 0.05). 缺血-48小时低温组和缺血-低温复温组的GFAP面积分数与缺血-缺氧组相比显著增加，而缺血-72小时低温组出现了中间效应，与假对照或缺血-缺氧无显著差异。
脑室周围白质中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞数量（左上）、面积分数（左下）和显微照片（右）(一个,D类,G公司,J型,M（M）)第一个脑回内白质(B类,E类,H（H）,K,N个)和第二矢状旁回(C类,F类,我,我,O（运行）)在假控制中(一个–C类，个 = 9） 、缺血-母婴(D类–F类，个 = 8） ，缺血-48小时低温(G公司–我，个 = 8） ，缺血-缓慢复温(J型–我，个 = 7） 和缺血72小时低温(M（M）–O（运行），个 = 8） 组。数据是平均值 ± 扫描电镜*P < 0.05 vs假手术对照#P（P） < 0.05 vs缺血-母婴。比例尺200 微米。
讨论
本研究表明，复温时间和复温速度对近期胎羊脑缺血后白质恢复有不同的影响。48后缓慢复温 与48小时和72小时相比，低温对组织白质恢复的影响较小 数小时的低温和快速复温，包括星形胶质细胞数量和面积分数的正常化。然而，低温的总持续时间和常温后的复温率对少突胶质细胞的总数或髓鞘碱性蛋白的表达没有影响。然而，与48小时的低温相比，低温持续了72小时 快速复温的小时数与成熟少突胶质细胞的更好恢复和Iba-1阳性小胶质细胞的更大减少相关，但GFAP阳性星形胶质细胞面积分数的恢复略有减少。
HIE后，磁共振成像（MRI）上的白质和灰质损伤非常常见，两者都与随后的神经发育损害密切相关15队列研究表明，与非制冷婴儿相比，治疗性低温可以改善MRI的各向异性分数，这表明低温可以减少内囊前后肢体、胼胝体和视辐射的损伤16在许多婴儿中，尽管接受治疗性低体温治疗，但仍存在持续的白质损伤，这与本研究中所有低体温组的部分白质保护相一致。此外，这种残余损伤与不良的神经发育结果有关17这表明发展或完善干预措施以进一步减轻白质损伤非常重要。
缺氧缺血性脑病患儿在治疗性低温治疗后的最佳复温速度尚不清楚。HIE典型复温新生儿治疗性降温的随机临床试验 °C/小时18,19然而，这是基于案例研究的有限证据，表明快速复温可能会导致低血压或反弹性癫痫20,21以及临床前研究引起的经验担忧，即它可能逆转潜在有害过程的抑制22,23动物研究中只有有限的证据表明，长时间低温后的复温速度会严重影响神经结果。暴露于缺氧缺血性疾病的新生仔猪，18 低温持续数小时，然后在0.5℃下复温 与4℃复温相比，°C/h与大脑皮层和白质束中caspase-3激活较少相关 摄氏度/小时24,25然而，18 小时是一个非常短、高度次优的低温持续时间。现在，成人和新生儿研究中都有大量临床前证据表明，在延迟开始治疗后，必须持续大约72天的低温治疗 达到最大神经保护的时间4,26因此，由于这些先前的研究没有控制冷却的总持续时间24,25缓慢复温后白质损伤的明显减轻可能是由治疗性低温持续时间的增加所介导的。
我们最近展示了48 短期胎羊缺血后数小时的低温与皮层和海马的部分神经保护有关，缓慢复温并没有改善，而当低温持续时间增加到72小时时，神经元存活率恢复到接近假对照水平 小时11相比之下，在本研究中，48小时后出现的少突胶质细胞总数的部分保护 体温过低的小时数不受复温速度或持续时间延长的影响。72个成熟少突胶质细胞的存活率略有提高 48小时低温但不缓慢复温 几个小时的体温过低。鉴于少突胶质细胞总数没有改善，这表明低温持续时间越长，可能与少突胶质成熟度提高有关，而不是生存率提高。
有趣的是，少突胶质细胞的存活似乎比神经元的存活更容易延迟低温的开始，而不是低温后的复温时间或速率。例如，我们之前已经表明，体温过低始于90 缺血后几分钟对少突胶质细胞和神经元有很强的保护作用，但低温开始时间推迟到5.5 数小时后，少突胶质细胞失去了保护，尽管有显著的，尽管是部分的神经保护10,13,27.将低温持续时间从48延长到72或120 小时数不影响少突胶质细胞总数，但显著调节神经元存活4,9,28.
在本研究中，复温率对髓鞘蛋白MBP或CNPase的表达没有影响。有趣的是，72 与缺血48小时低温和缺血-低温复温组相比，低温48小时与CNPase表达的面积分数略有下降相关。鉴于缺血72小时低温组成熟髓鞘化少突胶质细胞增加，尚不清楚为什么CNPase表达降低。此外，CNPase的这种小幅度减少对髓鞘结构和功能的影响尚不清楚。
与许多以前的研究一致，脑缺血与所有白质区域Iba-1阳性小胶质细胞数量的显著增加有关，例如。4,9所有低温治疗方案都显著减少了小胶质细胞的数量。然而，72 与48小时相比，低温快速复温的小时数与小胶质细胞数量的大幅减少有关 几个小时的体温过低。缓慢复温组显示中间数量的小胶质细胞，与72或48没有显著差异 体温过低数小时。这表明，缓慢复温组的任何益处都可能归因于低温持续时间更长，而不是复温率本身的真正影响。
缺血与GFAP阳性星形胶质细胞数量显著增加相关，但标记面积分数明显减少（P = 0.068），与星形胶质细胞形态的变化一致。只有缺血-低温复温与缺血-母体血相比，星形胶质细胞数量显著减少，而缺血-48小时和缺血-72小时低温方案对星形胶质细胞的数量没有影响。缺血-48小时低温组和缺血-低温复温组的GFAP标记面积分数均显著高于缺血-母体血症组，而缺血-72小时低温组的中间效应与缺血-母质血症组或假对照组无显著差异。先前已经显示星形胶质细胞的结构重塑72 新生猪脑缺氧缺血数小时后，受损的星形胶质细胞失去了正常情况下从健康星形胶质细胞胞体延伸出来的复杂精细突起树干，导致标记物的面积分数减少29这些数据表明，在当前的研究中，缺血与星形胶质细胞数量增加有关，但这些精细过程消失。缓慢复温方案最能恢复GFAP标记的星形胶质细胞数量和面积分数，表明星形胶质细胞形态得到改善。考虑到缓慢复温方案比48种方案更有效 小时或72 数小时的低温和快速复温，这表明缓慢复温对星形细胞增生的真正益处，而不是延长低温持续时间。
我们之前已经证明，与48例患者相比，缓慢复温方案与脑电图功率恢复的显著改善有关 尽管缓慢复温对神经元存活没有影响，但持续数小时的低温和快速复温11因此，我们推测继发性星形细胞增多可能有助于电生理恢复。星形胶质细胞在维持脑内稳态方面发挥着关键作用，包括细胞外谷氨酸的吸收和再循环、钾离子的缓冲以及通过其对“三部分突触”的贡献调节突触传递30此外，在本研究中，我们仅评估了白质星形胶质细胞的变化。然而，新生猪脑灰质星形胶质细胞在缺氧缺血后表现出类似的星形胶质细胞结构重塑31如果缓慢复温方案显示出对灰质星形胶质细胞的卓越保护，这可能也有助于改善缓慢复温后脑电图功率的恢复11.
结论
低温后复温速度和低温持续时间对全脑缺血后白质恢复的影响是复杂的，且具有细胞类型特异性。以0.2的速率缓慢复温 48℃后每小时 与48或72小时相比，低温小时与星形胶质细胞数量和面积分数正常化程度的适度提高有关 数小时的低温和快速复温。然而，48天后缓慢复温，Iba-1阳性小胶质细胞有中度改善 48小时低温与快速复温的比较 小时和72 低温时间，与延长低温持续时间而非复温速度的效果一致就其本身而言此外，低温持续时间和常温后复温速度对少突胶质细胞总数或MBP保存无影响。最后，低温治疗72 快速复温小时与成熟少突胶质细胞的最大恢复相关，尽管CNPase标记面积分数的恢复略有减少。总的来说，从实用角度来看，这些数据表明，与治疗性低温后的复温速度相比，低温的净持续时间对缺氧缺血性白质损伤的影响更为重要。
致谢
本研究由新西兰健康研究委员会（17/601）、神经基金会（NF1715-PG）和马斯登基金会（17-UOA-232）资助。
作者贡献
J.O.D.、A.J.G.、L.B.对作品的构思或设计做出了贡献。J.O.D、V.D.、G.W.、K.Q.Z.对作品数据的获取、分析或解释做出了贡献，J.O.D.A.J.G、L.B.、V.D.G.W.和K.Q.Z.对起草作品或对重要知识内容进行批判性修改作出了贡献。
脚注
出版商备注：Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。
工具书类
1Edwards AD等人。BMJ（临床研究版）2010.围产期缺氧缺血性脑病亚低温治疗18个月大时的神经学结果：试验数据的综合和荟萃分析；第c363页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Shankaran S等，新生儿脑损伤的磁共振成像模式作为新生儿缺氧缺血性脑病低温试验后儿童预后的生物标志物。《儿科杂志》。2015;167：987–993 e983。doi:10.1016/j.jpeds.2015.08.013。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Wassink G等人。低温神经保护的工作模型。生理学杂志。2018;596:5641–5654. doi:10.1113/JP274928。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Davidson JO等。胎羊缺血后大脑冷却的最佳神经保护时间足够多长？J.塞雷布。血流代谢。2018;38:1047–1059. doi:10.1177/0271678X17707671。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Miller SP等人。足月新生儿脑病的脑损伤模式。《儿科杂志》。2005;146:453–460. doi:10.1016/j.jpeds.2004.12.026。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Martinez-Biarge M等人。预测足月缺氧缺血性脑病的运动结局和死亡。神经病学。2011;76:2055–2061. doi:10.1212/WNL.0b013e31821f442d。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Martinez-Biarge M等。缺氧缺血性脑病的白质和皮层损伤：先行因素和2年结果。《儿科杂志》。2012;161：799–807。doi:10.1016/j.jpeds.2012.04.054。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Davidson JO等。连接蛋白半通道阻断可改善胎儿缺血模型的预后。安。神经。2012;71:121–132. doi:10.1002/ana.22654。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Davidson JO等人。延长体温过低的持续时间并不能进一步改善等位胎羊缺血后的白质保护。科学。代表。2016;6：25178。doi:10.1038/srep25178。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Roelfsema V等人。近期胎羊脑缺血后出现脑低温和白质损伤的机会窗口。J.塞雷布。血流代谢。2004;24:877–886. doi:10.1097/01.WCB.0000123904.17746.92。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11J.O.戴维森。等脑低温后缓慢复温对近期胎羊全身脑缺血的益处有限。J.塞雷布。血流Metab.，271678X18791631，（2018）。[PMC免费文章][公共医学] 12Kilkenny C、Browne W、Cuthill IC、Emerson M、Altman DG。动物研究：报告体内实验–ARRIVE指南。J.塞雷布。血流代谢。2011;31:991–993. doi:10.1038/jcbfm.2010.220。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Gunn AJ、Gunn TR、de Haan HH、Williams CE、Gluckman PD。胎羔缺血后长时间选择性头部冷却的显著神经元挽救。临床杂志。投资。1997;99:248–256. doi:10.1172/JCI119153。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Williams CE，Gunn AJ，Mallard C，Gluckman PD。发育中的绵羊大脑缺血后的结果：脑电图和组织学研究。安。神经。1992;31:14–21. doi:10.1002/ana.410310104。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Shapiro KA等人。新生儿脑病儿童大脑结构的早期变化与语言结果相关。神经影像临床。2017年；15:572–580. doi:10.1016/j.nicl.2017.06.015。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Porter EJ、Counsell SJ、Edwards AD、Allsop J、Azzopardi D.磁共振图像的基于轨迹的空间统计，以评估围产期窒息性脑病的疾病和治疗效果。儿科。物件。2010;68:205–209. doi:10.1203/PDR.0b013e3181e9f1ba。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17G.J.格纳。等新生儿弥散张量成像确定的白质损伤与足月新生儿窒息和治疗性体温过低后神经发育结果的相关性：一项探索性初步研究。J.儿童神经病学., 883073819841717, (2019).[PMC免费文章][公共医学] 18Gluckman PD等。新生儿脑病后选择性头部冷却伴轻度全身低温：多中心随机试验。柳叶刀。2005;365:663–670. doi:10.1016/S0140-6736（05）17946-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Shankaran S等。新生儿缺氧缺血性脑病的全身低温治疗。北英格兰。医学杂志。2005;353:1574–1584. doi:10.1056/NEJMcps050929。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Thoresen M，Whitelaw A.缺氧缺血性脑病婴儿轻度治疗性低温和复温期间的心血管变化。儿科。2000;106:92–99. doi:10.1542/peds.106.1.92。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Battin MR、Bennet L、Gunn AJ。复温过程中反弹发作。儿科。2004;114：1369.doi:10.1542/peds.2004-1695。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Hashimoto T，Yonetani M，Nakamura H。选择性脑低温通过减少羟自由基的产生，保护新生大鼠免受缺氧缺血性损伤。Kobe J.医学科学。2003;49：83–91。[公共医学][谷歌学者] 23Nakashima K，Todd MM。低温对缺血去极化后兴奋性氨基酸释放速率的影响。(打、击等的)一下。1996;27:913–918. doi:10.1161/01.STR.27.5.913。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Wang B等。治疗性低温复温在新生缺氧缺血性脑病猪模型中诱导皮层神经元凋亡。J.塞雷布。血流代谢。2015;35:781–793. doi:10.1038/jcbfm.2014.245。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Wang B等。延迟低温和复温可增加新生仔猪缺氧缺血性脑病模型的白质凋亡。神经科学。2016;316:296–310. doi:10.1016/j.neuroscience.2015.12.046。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Colbourne F，Li H，Buchan AM。大鼠前脑严重缺血6小时后轻度低温诱导的CA1区神经保护作用。J.塞雷布。血流代谢。1999;19：742–749。doi:10.1097/00004647-199070000-00003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Gunn AJ、Gunn TR、Gunning MI、Williams CE、Gluckman PD。胎羊缺血后癫痫发作前开始采用头部长时间冷却的神经保护。儿科。1998;102:1098–1106. doi:10.1542/peds.102.5.1098。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Davidson JO等。胎羊缺血后大脑冷却时间过长多久？J.塞雷布。血流代谢。2015;35:751–758. doi:10.1038/jcbfm.2014.259。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Sullivan SM、Bjorkman ST、Miller SM、Colditz PB、Pow DV。新生猪白质星形胶质细胞对缺氧/缺血反应的形态学变化。大脑研究。2010;1319:164–174. doi:10.1016/j.brainres.2010.01.010。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Davidson JO等。连接蛋白半通道在传播缺血性脑损伤中的关键作用。货币。药物靶点。2013;14:36–46. doi:10.2174/138945013804806479。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Sullivan SM、Bjorkman ST、Miller SM、Colditz PB、Pow DV。缺氧/缺血后新生猪脑灰质星形胶质细胞的结构重塑。格利亚。2010;58:181–194. doi:10.1002/glia.20911。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
