乳腺癌集体浸润可塑性的活体显微镜观察

集体入侵和个体化的活体显微镜检查

4T1和MMT肿瘤中的集合细胞浸润在1-2内开始 植入后第天，与E-cadherin表达无关(图2A；图S1A). 表达E-cadherin的4T1细胞以可检测到的先导细胞的固体聚集链侵入(图2A、 上排和B，左侧）。缺乏E-cadherin但表达N-cadherin的MMT细胞(图S1A、B)，如报告所示(Firlej等人，2008年)，入侵时组织不太紧密，但却是集体的，带有多细胞组织和头尾细胞排列的链或网络(图2A、 下一行和B，右侧）。将4T1和MMT球状体植入三维胶原基质培养时，也获得了类似的集体侵袭，其中多细胞侵袭链中的细胞保留富含丝状肌动蛋白和粘附连接蛋白E-钙粘蛋白（4T1）和β-连环蛋白（MMT）的细胞-细胞连接(图S2A). 集合链中沿细胞-细胞连接的膜/细胞质E-cadherin荧光比率为～1.5，分离的单个细胞中降至～0.5(图S2B).

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图2。

乳腺肿瘤成像模型中的集体和个体细胞侵袭模式和血管生成。（A） 双光子显微镜监测4T1（上排）和MMT（下排）肿瘤生长和血管生成的时间进程。概述图像是单独图像的蒙太奇，表示z（z）-用5获得堆栈 µm间隔。点线框显示了集体入侵链和单个细胞的特写镜头。箭头表示单个单元格。（B） 乳腺脂肪垫4中4T1（左）和MMT（右）细胞的集体侵袭 球体植入后第天。水平（XY）和正交（XZ）投影z（z）-堆栈。虚线标记正交视图的横截面平面的位置。箭头表示Lifeact-eGFP沿细胞-细胞连接处富集。（C） 每个肿瘤的集体入侵链数、集体入侵链的长度和每个肿瘤的单独入侵细胞数。集合链被确定为从多细胞球体径向突出的连接肿瘤细胞群（基于GFP或DsRed2信号）。细胞-细胞接触被检测为核H2B-eGFP信号，Lifeact-eGFP沿细胞-细胞边界（4T1）或连续DsRed2信号（MMTz（z）-堆栈。数据表示每个细胞系来自4只小鼠的7-12个肿瘤的9-16个集体链和9-10个单细胞。（D） 血管网面积归一化为肿瘤面积。数据表示每个细胞系4只小鼠的4-11个肿瘤。C和D中的方框图显示了中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。P（P）-值通过Mann-Whitney检验获得。比例尺：200 μm（A，概述）；25 μm（A，右侧虚线框中放大的区域）；50 μm（B）。

4T1和MMT细胞都能够以细长的纺锤状形态单独分离和迁移(图2A、 右柱）和细胞表面下调的E-cadherin(图S2B). 与球状主肿块相比，分离的单个细胞更接近于集合链，这表明与主肿块相比较，单细胞分离更有可能发生在集合浸润部位(图S2C). 与4T1肿瘤相比，MMT中的个体化更为丰富，后者发展出更频繁的尖端细胞和分离细胞(图2C） ●●●●。球体植入模型中细胞个体化与E-cadherin表达的反向关联体内与4T1球体相比，MMT的3D器官型培养中观察到的单细胞释放增加相一致(图S2D)人小叶癌和乳腺导管癌患者样本的比较(图S2E) (Khalil等人，2017年).

因此，移植的4T1和MMT肿瘤主要发展为乳腺组织的集体浸润，这与E-cadherin阳性导管和E-cadherin-阴性小叶乳腺癌的人类样本中发现的主要集体浸润模式一致(Bronsert等人，2014年;Cheung等人，2013年;Khalil等人，2017年).

乳腺癌细胞的组织导向结构

在窗口模型中，肿瘤生长和侵袭伴随着新生血管生成(图2A、 D）和成纤维细胞在肿瘤-基质界面显著积聚，与人体样本相似(图3A、 B）。我们绘制了侵袭边缘附近和之前的三维组织拓扑图，以确定早期集体侵袭是否遵循微环境结构，这是一个在基因工程乳腺癌中单个移动乳腺癌细胞和集体侵袭间充质肿瘤的过程(Gligorijevic等人，2014年;Weigelin等人，2012年). 包括尖端细胞在内的集合链通常与胶原束平行排列，重现了人类病变中多细胞链沿基质胶原的排列(图3C） ●●●●。然而，早期的集体侵袭是否会导致重塑，或是遵循预先存在的胶原纤维排列体内未知。相比之下，单独定位的4T1和MMT细胞表现出更多的可变、松散的角度分布和沿胶原结构排列(图3D类；图S2F). 这些数据表明，集体入侵遵循更精确排列的胶原和界面，而分离的单个细胞更有可能改变引导组织结构之间的方向。因此，植入的微病灶再现了肿瘤的集体和个体侵袭模式，并通过基质结构进行指导(Schedin和Keely，2011年).

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图3。

植入乳腺肿瘤和患者样本中的基质重塑（A）表示4T1球体植入（上排）后和8天后小鼠乳腺脂肪垫中基质成分的示例图像 天（中排），与人类浸润性导管癌（IDC）病变（下排）相比。箭头表示波形蛋白阳性的成纤维细胞。（B） 瘤周基质中波形蛋白阳性基质细胞的数量。每组数据代表来自3只小鼠和4个独立人类IDC样本的5个肿瘤。B中的方框图显示中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。P（P）-数值通过Mann–Whitney检验获得。（C） 4T1（上排）和MMT（中排）细胞的集体和单细胞侵袭4 与人类IDC（下排）侵犯富含胶原蛋白的基质和脂肪组织相比，球体植入后第天。（D） 分析原理（左）和肿瘤细胞沿胶原纤维排列的量化（右）。4T1和MMT肿瘤中的细胞和胶原纤维4 球状体植入后第天和人类IDC被确定，如C所示。细胞相对于胶原纤维排列的量化，以0±25°扇区内的分数表示。数据代表来自每个细胞系3只小鼠的8个肿瘤的34（4T1）和21（MMT）集体链，以及21（4T1）和17（MMT）单细胞，以及来自5个独立的人类IDC样本的35个集体链。B和D中的方框图显示中值（黑线）、25/75百分位（方框）和最大值/最小值（胡须）。P（P）-值通过Mann-Whitney检验获得。比例尺：50 微米。

细胞系和培养

表达胞浆DsRed2和核H2B-eGFP的小鼠乳腺癌细胞4T1[CRL-2539，美国型培养物收集（ATCC）]和MMT（MMT 060562，ATCC）（由美国圣地亚哥抗癌博士R.M.Hoffman善意提供）保存在RPMI 1640生长培养基中（Thermo Fisher Scientific）补充10%胎牛血清（Sigma-Aldrich）、1%丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素（PAA实验室），和2 mM L-谷氨酰胺（赛默飞世尔科技公司）（37°C，5%CO₂，增湿空气）。通过短串联重复序列（STR）DNA分析（IDEXX BioResearch）验证肿瘤细胞的身份。未检测到哺乳动物种间污染。首次获得MMT细胞的STR DNA图谱：MCA-4-2，21.3NA；MCA-5-5，14 NA；MCA-6-4，18 NA；MCA-6-7，13 NA；MCA-9-2，15不适用；MCA-12-1，16 NA；MCA-15-3，22.3不适用；MCA-18-3，19 NA；MCA-X-1，24 NA。此配置文件与之前报告的任何配置文件都不匹配。细胞定期检测支原体污染（Myco Alert，Lonza）。根据制造商的协议，ViraPower表达系统（生命科技）在HEK293T细胞中生成慢病毒颗粒。H2B-mCherry是从pcDNA 3.0 H2B-mCerry（荷兰奈梅亨Radboud大学医学中心a.J.C.de Groof博士的礼物）亚克隆到慢病毒主干pLenti6.2v5（生命技术）中的。为了生成双色细胞，将pLentiCMV-MCS-Lifeact-eGFP载体（法国格勒诺布尔阿尔伯特·邦尼奥研究所Olivier Destaing博士的礼物）引入H2B-mCherry-expressing 4T1细胞。通过用blasticin（5 μg/ml）和嘌呤霉素（3 μg/ml），然后进行单细胞分选（FACS Aria SORP，Becton Dickinson）。

球体生成

球体是使用吊放方法生成的。用1 计算mM EDTA和0.075%胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific），并在25个培养基中培养500-1000个细胞 µl滴补充有0.12%甲基纤维素（Sigma-Aldrich）的RPMI 1640生长培养基（18 h、 37°C，5%一氧化碳₂，增湿空气）。细胞聚集后，在含有0.9 mM钙²⁺和0.5 mM镁²⁺（赛默飞世尔科技公司）进行后续分析。

球体侵入三维胶原晶格

球体从鼠尾肌腱中并入I型胶原（BD Biosciences；最终浓度4 mg/ml），根据制造商的协议，在pH 7.4下聚合之前，并在侵入培养之前覆盖完整的生长培养基（48 h） ●●●●。

原发性乳腺癌样本

对5例浸润性导管癌（IDC）和3例浸润性小叶癌（ILC）患者在原发性乳腺癌手术切除后进行组织样本采集（荷兰奈梅亨Radboudumc病理科）。按照机构审查委员会的批准，并根据国家法律和《赫尔辛基宣言》，以匿名方式对肿瘤样本进行加密和分析(Nagelkerke等人，2011年). 根据荷兰法律，本研究无需获得研究伦理委员会的批准，因为使用了从常规诊断工作流程中获得的编码组织，并且纳入的患者不受本研究的影响。出于研究目的匿名或编码使用多余组织是与Radboudumc医院患者签订的标准治疗协议的一部分，患者可以选择退出。被纳入的患者中没有一人反对使用残余材料。患者材料的使用符合赫尔辛基宣言。

免疫组织化学

在Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0，95°C，15 min），然后与3%过氧化氢酶孵育[10 min，室温（RT）]，在0.1中清洗 M Tris/HCl缓冲液（pH 7.5，3×，5 min），与一级抗体孵育（4℃，过夜），清洗（3×，10 min），与与辣根过氧化物酶标记的聚合物结合的二级抗体孵育（30 最小，RT），清洗（3×，10 min）并与二氨基联苯胺（DAKO；5）孵育 min，RT），然后苏木精染色（1-2 最小值）。切片安装在Pertex培养基（Histolab）中并进行扫描（Pannoramic 250 Flash II，3DHistech）。

共焦显微镜

为了进行免疫荧光染色，将胶原蛋白包埋的球体固定在4%多聚甲醛中，与溶解在PBS/0.1%牛血清白蛋白/0.1%Triton X-100（Sigma-Aldrich）（12 h、 4°C），清洗（PBS，3×，30 min），与第二抗体、鬼笔肽和DAPI（2 h、 RT），并嵌入定制的成像室中。

厚组织切片（200 μm）通过福尔马林固定乳腺癌样品或小鼠乳腺脂肪垫的振动切片（Leica，VT100s）获得。在Tris-EDTA缓冲液（pH 9；95°C，15）中提取抗原后 min），用一级抗体孵育组织切片，洗涤5倍，用二级抗体和DAPI孵育。所有清洗和培养步骤均在含有0.1%Triton-X100、2%山羊血清和0.05%叠氮化钠（24 h、 20°C）。

共聚焦显微镜（Olympus FV1000）使用20×/0.50 NA和40×/0.80 NA长工作距离物镜进行。使用20×Olympus XLUMPlanFI 206/0.95物镜对固定的3D组织样品进行双光子显微镜（LaVision BioTec）。

体内球形植入与乳腺窗成像

Balb/C（用于4T1肿瘤）和Balb/C-nu/nu（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl；用于MMT肿瘤）雌性小鼠（6-8 周龄）。动物程序由奈梅亨拉德布大学动物伦理委员会批准（RU-DEC 2012-129），并根据《荷兰动物实验法》和欧洲FELSA协议的指导方针进行。

为了植入乳窗，在徕卡MZFLII显微镜下，通过手术切口暴露麻醉小鼠（氧气中的1-2%异氟醚）的第四个乳腺脂肪垫。使用30G注射器针头（BD Medical）在脂肪垫内创建一个表面微通道，将单个球形微粒（2 使用凝胶加载吸管尖端（0.3 mm内径，生物塑料）。在同一组织区域内植入多达10个球体后，插入一个乳腺成像窗口，通过在皮肤边缘周围轻轻拧紧一条绷带缝合线将其固定在皮肤上，并用盖玻片和弹簧圈封闭，如前所述(Alieva等人，2014年). 通过全身荧光成像（FluorVivo100，INDEC BioSystems）监测多灶肿瘤的发展，并通过DsRed2和H2B-eGFP信号的2D投影量化乳腺窗口中的肿瘤总面积。

活体内双光子显微镜

在配备3个可调谐Ti:Sa激光器和光学参数振荡器（相干/APE）的定制垂直TrimScope II多光子显微镜（LaVision BioTec）上进行活体内成像使用20×Olympus XLUMPlanFI 206/0.95浸水物镜和最多5个带差分滤波器配置的探测器（395/8或447/60，蓝色；525/50，绿色；593/11、593/40或620/60，红色；675/67、710/75或810/90，远红色；Semrock或Chroma Technology）。麻醉小鼠的乳腺成像窗口（氧气中的1-2%异氟烷）在温度控制阶段（37°C）由定制支架稳定。静脉注射70 与Alexa Fluor 750（2）偶联的kDa葡聚糖 mg/小鼠，分子探针）。以3D堆栈和延时电影的形式，通过910的顺序激励，获得多通道记录 纳米（eGFP），1090 nm（二次谐波产生，DsRed2，mCherry，Alexa Fluor 750）和1180 20-60 nm（三次谐波产生） mW平均功率达到目标值4 h个观察期。

自发转移试验

通过将10个球体（每个1000个细胞）植入乳腺成像窗口内的同一乳腺脂肪垫中，生长出4T1或MMT肿瘤。球体植入后2至3周，处死小鼠，收获原发性肿瘤和肺部，将snap冷冻在液氮（MMT）中或固定在缓冲福尔马林（4%，24 h） 然后包埋在石蜡中（4T1）。双色MMT细胞的转移事件的绝对数量通过将整个肺切成14个来计数 µm切片，间隔70 μm，然后用DAPI染色和DAPI、eGFP和DsRed2的全场荧光扫描（Pannoramic 250 Flash II）。对于患有4T1肿瘤的小鼠，在3 数周的增长体内，通过细胞角蛋白8染色鉴定肿瘤细胞，并将全肺切成5片进行计数 µm切片，间隔70 µm，然后进行全切片扫描（Pannoramic 250 Flash II）。细胞角蛋白8染色也检测到正常肺细胞（即肺细胞），并根据非聚集细胞形态、肺泡中的位置以及细胞核与4T1癌细胞核相比的较小尺寸和规则形状将其排除在量化范围之外。转移负荷计算为每个肺74-85（4T1）和85-124（MMT）切片的每个组织切片的平均转移细胞簇数。作为纳入分析的最小尺寸，≥3 4T1和MMT细胞被视为转移性集群。

图像处理和分析

图像是使用z（z）-步长为5 µm，表示为使用斐济（1.49s，国立卫生研究院）进行的单层、最大投影和3D重建。缝合3D堆栈（马赛克插件），在延时记录期间纠正漂移（StackReg插件），并手动分割以计算肿瘤面积。血管面积是通过右旋糖酐通道（Alexa Fluor 750）的自动单通道阈值化获得的，该通道代表灌注的血管，并归一化为肿瘤区域。胶原纤维相对于侵入的集体股或单个细胞的排列被量化为两个各自长度轴之间的角度。

肌动蛋白动力学分析

肌动蛋白动力学测量为Lifeact-eGFP荧光强度在空间和时间上的波动，从单个成像平面穿过细胞体中心，没有漂移迹象。使用定制的半自动MATLAB代码（MathWorks）分割细胞体，并基于3.02的源图像计算皮层肌动蛋白的边界运动和变异性 µm或1.45 µm像素分辨率和调整后的信噪比，如所述(Driscoll等人，2014年). 使用具有200个边界点的自动snake算法以亚像素精度定义细胞边界。细胞体的边缘层是通过从细胞体的完整掩模中减去细胞体侵蚀的二元掩模来定义的。通过执行最小二乘拟合来匹配后续帧的边界点，可以检测到随时间变化的边界运动。计算沿细胞边界每个边界点附近区域的皮层Lifeact-eGFP变化。每个区域的边界长度为1.73 µm，大于测量边界位置的平均波动，因此足以准确捕获皮层肌动蛋白。将每个边界区域的平均强度随时间绘制成曲线图，并用于计算延时自相关，定义如下：

在这个方程式中，n个表示边界指数和强度偏移量减去每个细胞内的平均背景荧光。对给定的时间延迟（Δt吨). 强度变异性计算为1减去由1表示的时延自相关-c（c）_n个(Δt吨). 因为1的相关性表明皮质肌动蛋白随时间的完全稳定，所以该参数对应于皮质肌动素的时间可变性。

我们感谢Evelyne Beerling和Jacco van Rheenen在调整乳腺成像窗口方面的专家培训和技术支持；Robert M.Hoffman提供MMT-DsRed2-H2B-eGFP细胞；Paul Span提供带注释的临床乳腺癌样本；以及Bianca Lemmers-Van de Weem和Kitty Lemmens-Hermans，为动物实验提供专家技术支持。我们进一步感谢安托万·哈利勒（Antoine Khalil）和雷切尔·李（Rachel Lee）的有益讨论，以及米尔贾姆·泽格斯（Mirjam Zegers）和瑞安·尼尼（Ryan Nini）批判性地阅读了手稿。