国际分子医学杂志。2018年9月；42(3): 1508–1516.
低氧诱导CXCR4表达通过激活HIF-1α促进滋养层细胞迁移和侵袭
，1,2 ，1 ，1和1,2
詹章
1临床检验科
2郑州大学第三附属医院妇产科，河南郑州450052
欢燕
1临床检验科
2郑州大学第三附属医院妇产科，河南郑州450052
1临床检验科
2中华人民共和国河南省郑州市郑州大学第三附属医院妇产科450052
2017年11月22日收到；2018年5月17日接受。
摘要
胎盘最初在低氧环境中发育到妊娠第8-10周，低氧水平是调节滋养层细胞迁移和侵袭的关键因素。CXC趋化因子受体4（CXCR4）在肿瘤细胞中被缺氧转录激活。然而，CXCR4是否参与生理性缺氧环境中缺氧诱导因子（HIF）-1α依赖性滋养层细胞的迁移和侵袭（3%O2)尚待充分阐明，需要进一步调查。在本研究中，研究了CXCR4在妊娠早期绒毛中的表达，以及滋养层对缺氧的反应，以及CXCR4和HIF-1α在滋养层迁移和侵袭中的作用。与正常足月胎盘相比，妊娠早期绒毛中CXCR4显著升高。体外3%O暴露于JEG3细胞后，CXCR4在mRNA和蛋白水平的表达增加2以时间依赖的方式，JEG3细胞的迁移和侵袭能力被上调。此外，通过转染CXCR4特异性小干扰（si）RNA来敲除CXCR4，减少了暴露于3%O的JEG3细胞的迁移和侵袭2此外，针对HIF-1α的合成siRNA显著抑制了暴露于3%O的JEG3细胞中CXCR4的表达2而pcDNA-HIF-1α显著增加CXCR4的表达。这些结果表明，低氧诱导的CXCR4表达通过HIF-1α的激活促进滋养层细胞的迁移和侵袭，这在胎盘形成过程中至关重要。
关键词：低氧诱导因子-1α、CXC趋化因子受体4、缺氧、滋养层细胞、迁移、侵袭
介绍
在妊娠早期，绒毛外滋养层细胞会形成堵塞物，堵塞螺旋动脉，阻止母体血液进入绒毛间隙，从而形成生理低氧环境(1). 然而，在妊娠10-12周时，随着血管内滋养细胞塞解体后母体血流的开始，胎盘中的氧张力升高(2). 氧水平的增加是胎儿-胎盘发育的重要信号，并限制滋养层细胞的侵袭(三). 虽然从胎盘组织中分离出来的滋养层细胞在低氧浓度下表现出侵袭性降低(4，5)，滋养细胞样细胞系，包括HTR-8/SVneo和JEG3细胞，在暴露于3%的O时表现出更强的侵袭性2(6). 因此，缺氧在决定滋养层细胞侵袭能力方面的作用仍存在争议，需要进一步阐明。
在上述情况下，氧张力的主要调节器是低氧诱导因子（HIF）-1，这是一种在低氧张力下稳定的转录因子复合物，用于介导细胞反应，激活并结合大量靶基因(7). HIF-1是一种异二聚体转录因子，由组成活性的HIF-1β亚单位和通过蛋白酶体途径迅速失活和降解的HIF-1-α亚单位组成，蛋白酶体途径是一个在缺氧条件下被抑制的过程(8). 以前的几项研究表明，HIF-1α在调控CXC趋化因子受体4（CXCR4）表达和功能中的作用是至关重要的(9–12).
趋化因子属于一个小细胞因子样蛋白超家族，作为趋化剂，控制白细胞向炎症部位的迁移(13). 根据四个保守半胱氨酸残基的位置，趋化因子分为四类，即CXC、CC、C和CX3C(14，15). CXCR4是一种G蛋白偶联受体，含有一个7个跨膜跨域，该跨域仅由其同源的基质衍生因子-1α（SDF-1α）激活(15). 已经证实CXCR4在多种癌症中过度表达，并有助于肿瘤细胞的侵袭和迁移(11，16). 越来越多的研究调查了CXCR4与妊娠的关系。此外，Schanz的一项研究等(17)据报道，通过氧水平和细胞分化为侵袭性绒毛外滋养层细胞对人细胞滋养层细胞CXCR4的调节在胎盘的发育中很重要。缺乏这种调节可能会导致浅层细胞滋养层浸润，这可能会导致胎盘发育不足导致先兆子痫发病较晚。
然而，目前对缺氧在滋养层细胞中调节CXCR4的作用的认识仍然有限。据报道，缺氧，特别是HIF-1α，可能促进CXCR4的表达并激活CXCR4/SDF-1α轴，有助于增加肿瘤细胞的侵袭和转移(12). 此外，正常妊娠中滋养层细胞的侵袭和迁移与肿瘤细胞的浸润和远处转移有很大的相似性。此外，CXCR4启动子包含四个位于转录起始位点上游的潜在低氧反应元件（HRE）和一个电子内位点，这表明CXCR4是一个低氧反应基因(18). 因此，推测缺氧可能通过激活HIF-1α改变CXCR4的表达，参与滋养层细胞的侵袭。
本研究比较了CXCR4在妊娠早期绒毛和正常足月胎盘中的表达。使用Transwell迁移/侵袭试验，研究CXCR4对暴露于3%O后滋养层细胞迁移和侵袭的影响2已进行调查。此外，利用RNA干扰介导的CXCR4和HIF-1α的敲除，以及一个过度表达HIF-1β的pcDNA质粒来研究CXCR4在低氧介导的滋养层细胞迁移和侵袭中的潜在作用。
材料和方法
研究人群
在选择堕胎或足月分娩后，获得第一个三个月的绒毛膜组织（平均妊娠周=7.37±0.89，n=30）和正常足月胎盘（平均妊娠周=39.53±0.94，n=30。多胎妊娠、先天性子宫畸形、胎儿畸形、慢性高血压、结缔组织病、糖尿病、多囊卵巢综合征、有早产或子痫前期病史的患者被排除在研究人群之外。足月患者作为对照组，在整个妊娠期血压正常。所有样本均来自郑州大学第三附属医院（中国河南省），并获得所有参与研究的女性的书面知情同意书。该研究方案经郑州大学第三附属医院伦理审查委员会批准（ID号：2015023）。样本组的详细临床特征见.
表一
| 特性 | 第一学期（n=30） | 期限（n=30） | P值 |
|---|
| 母亲年龄（岁） | 29.67±3.29 | 30.47±3.55 | 0.37 |
| 孕龄（周） | 7.37±0.89 | 39.53±0.94 | <0.05 |
| 平均动脉压（mmHg） | 84.90±4.41 | 86.07±4.39 | 0.31 |
| 体重指数（kg/mm2) | 23.08±1.46 | 22.61±1.00 | 0.15 |
| 怀孕次数 | 1.47±0.63 | 1.53±0.68 | 0.69 |
样品采集
扩张和刮除后，立即将绒毛膜组织从受孕产品中分离出来，切成小块，并用0.9%氯化钠彻底清洗，以清除多余的血液、粘液和蜕膜。采集后15分钟内，分别从母体表面中央部分和每个象限（3点、6点、9点和12点）采集五个胎盘小样本，避开任何有明显钙化、坏死和梗死迹象的区域。用无菌滤纸从组织中取出血液后，用0.9%氯化钠清洗每个样品的一部分，然后用10%福尔马林固定以进行免疫组织化学（IHC），剩余的样品立即放置在液氮中，并储存在−80°C下以提取RNA。
细胞培养和治疗
JEG3滋养层样细胞系购自美国类型培养物收集中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯），细胞生长在含有10%胎牛血清（FBS；HyClone；GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州洛根）和1.2 mmol/l l-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，37°C，5%CO2大气（21%O2). 对于缺氧条件，如前所述(6)，细胞在37°C和3%O的三气体培养箱中培养2，5%一氧化碳2和92%N2在指定的时间段内。
国际控股公司
组织样品在室温下固定在10%的福尔马林缓冲液中，并嵌入石蜡中。组织样本被切成4个-µ用于IHC分析的m段。在用二甲苯脱蜡并通过分级乙醇溶液再水化后，在10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中使用微波处理20分钟，进行抗原回收。然后用3%的H培养组织2O（运行）2在37°C下保持15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。随后，将切片与兔抗人CXCR4单克隆抗体（1:500；猫号ab124824；英国剑桥Abcam）在4°C下孵育过夜。阴性对照切片在室温下与磷酸盐缓冲盐水（PBS）孵育2小时。第二抗体（1:200；目录号SP-9001；OriGene Technologies，Inc.，中国北京）用于在室温下孵育组织1小时，并用3,3′-二氨基联苯胺四氢氯化物底物试剂盒（ZSGB-BIO）观察反应产物。切片用苏木精复染2分钟，脱水，清除，盖上盖子。通过系统筛选所有切片，并根据建立的0-3评分标准对其进行评估，从而评估染色强度。图像是用尼康Eclipse Ci显微镜（日本东京尼康公司）以×100倍放大率拍摄的。组织中CXCR4蛋白的染色结果分级如下：0，无染色；1、<1%的细胞有核染色；2、1～10%的细胞核染色和/或弱细胞质染色；3、细胞核染色>10%的细胞和/或明显或强烈的细胞质染色。两位病理学家独立评估了每张幻灯片的免疫染色强度。
细胞迁移/侵袭检测
使用Transwell插入物（8-µm孔径；Costar，剑桥，马萨诸塞州，美国）。Transwell嵌件涂有100层µl Matrigel（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）用于入侵检测。将JEG3细胞接种在6孔板（3×10）中5细胞/孔），让其生长直至达到60%的汇合点，然后进行类似的缺氧处理48小时。细胞在无血清培养基中饥饿过夜，然后收获并重新悬浮在无血清的培养基中。细胞悬浮液（3×104)在200中µl无血清培养基加载到Transwell插件的上腔中，750µ将含有20%FBS的RPMI 1640培养基添加到37°C的下室中24 h。将迁移到膜下表面的细胞固定在4%多聚甲醛中30 min，然后用苏木精染色10 min。在光学显微镜下（放大倍数×200）计算迁移/侵入细胞的数量每个分析从五个随机选择的字段中选择。
逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析
从组织和JEG3细胞中提取总RNA，并使用2µl 5X RT缓冲器，0.5µl RT酶混合物，0.5µl底漆混合物和1µg RNA样品，使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒（Toyobo Co.，Ltd.，日本东京）在37°C下放置15分钟，然后在98°C下存放5分钟。然后使用SYBR Green Real-Time PCR Master混合物（Toyopo Co.Ltd.），试剂在95°C下浸泡60秒，然后在40个95°C循环中浸泡15秒，在60°C下搅拌60秒。HIF-1α的引物为：5′-TGACACTGGTGGCTCACATA-3′（正向）和5′-ATGTACTGCAATGCAATGG-3′（反向）。CXCR4的引物为：5′-ACTACACCGAGAGAAATGGGCT-3′（正向）和5′-CCCCACAATGCAGTAAGA-3′（反向）。β-actin的引物为：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′（正向）和5′-CAGGAAGGCTGGAAGG-3’（反向）。所有结果均归一化为β-actin的mRNA水平。第2个-ΔΔCq方法(19)分析所有靶基因的mRNA表达。
蛋白质印迹分析
用RIPA裂解和提取缓冲液（中国北京康文生物技术有限公司）对细胞进行裂解，并收集上清液以使用双茚二酸蛋白检测试剂盒（中国上海桑贡生物技术有限责任公司）测量蛋白质浓度。等量（80µg） 蛋白质裂解产物经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝化纤维素膜上。用5%（w/v）非脂肪乳在含0.1%吐温的Tris缓冲盐水中封闭膜1 h，并与抗HIF-1α的兔单克隆一级抗体（类别号ab51608；1:1000；Abcam）或兔单克隆抗CXCR4（类别号ab124824；1:100；Abcam）和兔多克隆抗β-肌动蛋白（类别号ab5694；1:2000；Abcam）孵育在4°C下过夜。在37°C下与相应的辣根过氧化物酶结合抗兔二级抗体（cat.no.IH-0012；1:10000；中国北京鼎国昌盛生物科技有限公司）孵育1小时后，使用增强化学发光（ECL Plus试剂盒；Beyotime生物技术研究所，中国上海）。使用AI600图像系统（GE Healthcare Life Sciences）量化蛋白质带的光学密度。
合成小干扰RNA和质粒转染
HIF-1α（siHIF-1）或CXCR4（siCXCR4）的合成siRNA是从GenePharma（中国上海）设计和购买的。siHIF-1α的序列为：5′-GATGGAAGCACTAGACAA-3′，siCXCR4的序列为：5′-CGTCCTGTATTGCATTA-3′。合成的siRNAs在250年重新悬浮µl无碱DEPC水，最终浓度为20µM.将JEG3细胞接种在6孔板（3×10）中5/well）在完全培养基中培养过夜。总共50 nM siRNA与Lipofectamine 2000™试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）混合，并转染到细胞中，然后暴露在缺氧条件下。在转染后48小时，从细胞中提取总RNA或蛋白质用于后续实验。此外，如上所述，从GenePharma购买携带HIF-1α的pcDNA质粒（pcDNA-HIF-1），并根据制造商的协议转染到JEG3细胞。
统计分析
所有统计分析均使用SPSS软件包21.0版（IBM SPSS，Armonk，NY，USA）进行。数据表示为平均值±标准偏差。使用独立样本t检验比较两组之间的数值差异。采用单因素方差分析和LSD（L）事后检验进行统计分析。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
CXCR4在妊娠早期绒毛中高水平表达
通过RT-qPCR分析CXCR4的表达，发现与正常足月胎盘相比，早期妊娠绒毛中的CXCR4 mRNA显著升高(). 随后，用IHC对CXCR4蛋白在胎盘中的表达进行定位，结果表明CXCR4主要表达在滋养层细胞的细胞质和膜中，与足月胎盘相比，妊娠早期绒毛中CXCR4的滋养层细胞表达增加(). 免疫染色结果总结如下，根据免疫染色强度分类。与正常足月胎盘相比，妊娠早期绒毛中CXCR4的染色强度较高（χ2=15.75; P<0.001）。
CXCR4在妊娠早期绒毛中高水平表达。（A） 通过逆转录定量聚合酶链反应分析检测CXCR4在早期妊娠绒毛和正常足月胎盘中的mRNA表达。**P<0.01。（B） 在绒毛滋养层细胞中检测到CXCR4的免疫反应性。与正常足月胎盘相比，妊娠早期绒毛中CXCR4的免疫染色增强。比例尺=100µm.CXCR4，CXC趋化因子受体4。
表二
| 妊娠期 | CXCR4染色
|
|---|
| 无 | 弱 | 中等 | 强大 |
|---|
| 第一学期（n=30） | 三 | 5 | 18 | 4 |
| 期限（n=30） | 6 | 20 | 三 | 1 |
缺氧诱导JEG3细胞中CXCR4的表达
为了研究缺氧对滋养层细胞CXCR4表达的影响，将JEG3细胞置于3或21%O中培养2观察到暴露于3%O的JEG3细胞中CXCR4的表达显著升高2(和B），这与胎盘组织中的上述发现一致。由于HIF-1α在缺氧中的重要性，本研究还检测了JEG3细胞中HIF-1β的蛋白表达。数据表明缺氧显著增强HIF-1α的表达，并随着时间的推移逐渐增加(). 这些结果表明，暴露于3%O的JEG3细胞中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平增加2.
缺氧诱导JEG3细胞CXCR4的表达。（A） 通过逆转录定量聚合酶链反应分析检测暴露于3%O的JEG3细胞中CXCR4 mRNA的表达2在指定的时间段内(**P<0.05）。（B） western blotting分析HIF-1α和CXCR4蛋白水平。β-actin作为内部对照。CXCR4、CXC趋化因子受体4；HIF-1α，低氧诱导因子1α。
缺氧促进JEG3细胞的侵袭和迁移
缺氧显著影响滋养层细胞的生物学过程，包括细胞迁移和侵袭。因此，进行Transwell迁移/侵袭试验以评估暴露于3或21%O的JEG3细胞的迁移和侵袭2发现JEG3细胞暴露于3%O2与暴露于21%O的细胞相比，迁移和侵袭明显增加2(和B），表明缺氧增强了JEG3细胞的迁移和侵袭能力。
缺氧促进JEG3细胞的侵袭和迁移。JEG3细胞暴露于21或3%的O2评估细胞迁移/侵袭。（A） 放大×200倍，外膜上迁移/侵袭JEG3细胞的代表性图像。（B） 数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05。
缺氧诱导的JEG3细胞的侵袭和迁移能力因CXCR4的敲低而降低
由于观察到缺氧促进了JEG3细胞的迁移和侵袭，并且CXCR4在缺氧暴露的细胞中的表达显著增加，因此推测CXCR4参与调节3%O暴露的滋养层细胞的迁移与侵袭2，即生理O2早期胎盘形成时水平。因此，用siCXCR4或阴性对照（NC）-siRNA转染JEG3细胞，发现用siCXCR4转染可显著降低JEG3细胞中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平(和B）。随后，转染siCXCR4或NC-siRNA并用21或3%O处理的JEG3细胞的迁移和侵袭2进行了评估。在暴露于21%O或3%O的细胞中，CXCR4基因敲除可减少细胞迁移和侵袭2(然而，这种作用在暴露于3%O的细胞中更为明显2因此，上述结果表明CXCR4对低氧诱导的细胞迁移和侵袭增加至关重要。
CXCR4敲低可降低低氧诱导的JEG3细胞侵袭和迁移。通过（A）逆转录定量聚合酶链反应和（B）western blot分析分析siRNA对JEG3细胞CXCR4的特异性敲除(**P<0.01）。（C） 转染NC-siRNA或siCXCR4，然后暴露于21或3%O的JEG3细胞的迁移和侵袭2在放大×200倍的情况下，通过Transwell分析进行评估。（D） 迁移或入侵细胞的数量表示为平均值±标准偏差(*siCXCR4与NC-siRNA相比P<0.05；#与21%O下的NC-siRNA相比，P<0.052). CXCR4、CXC趋化因子受体4；小干扰RNA；NC，阴性对照。
缺氧条件下HIF-1α介导CXCR4的表达
为了证实CXCR4的表达是否确实是由HIF-1α在JEG3细胞中介导的，将合成的siHIF-1α和NC siRNA转染到JEG3细胞中。暴露于3%O后248小时后，首先进行western blot分析以验证siHIF-1α对JEG3细胞的疗效。数据表明HIF-1α和CXCR4的mRNA表达水平受到抑制()与NC-siRNA相比，HIF-1α特异性siRNA显著抑制JEG3细胞HIF-1β的内源性表达，并显著抑制低氧诱导的CXCR4上调(). 在暴露于3%O的JEG3细胞中，siHIF-1α转染也可减少细胞迁移和侵袭2(和D）。此外，利用pcDNA-HIF-1α研究HIF-1激活对JEG3细胞CXCR4表达的影响。观察到HIF-1α和CXCR4的蛋白和mRNA水平(和F）上调，细胞迁移和侵袭(与转染对照载体的细胞相比，转染pcDNA-HIF-1α的JEG3细胞中H）增加。这些结果表明，缺氧通过激活HIF-1α诱导CXCR4的表达。
CXCR4的表达由HIF-1α介导。（A） 用siHIF-1α或NC-siRNA转染JEG3细胞，然后在3%O培养基中培养，其HIF-1 A和CXCR4的mRNA和（B）蛋白水平2分别用RT-qPCR和western blot分析48 h(*P<0.05和**P<0.01）。（C） 转染NC-siRNA或siHIF-1α，然后暴露于3%O的JEG3细胞的迁移和侵袭2使用Transwell分析在放大×200倍的条件下进行评估。（D） 迁移和侵入数据以平均值±标准差表示(**P<0.01）。（E） 转染pcDNA-NC或pcDNA-HIF-1α，然后暴露于3%的O2分别用RT-qPCR和western blot分析48 h(*P<0.05和**P<0.01）。（G） 转染pcDNA-NC或pcDNA-HIF-1α，然后暴露于3%O的JEG3细胞的迁移和侵袭2使用Transwell分析在放大×200倍的条件下进行评估。（H） 迁移和侵入数据以平均值±标准差表示(*P<0.05和**P<0.01）。CXCR4、CXC趋化因子受体4；HIF-1α，低氧诱导因子1α；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；小干扰RNA；NC，阴性对照。
讨论
在妊娠的前三个月，滋养层的迁移和侵袭受到多种因素的严格调控，包括细胞因子、生长因子和激素。然而，缺氧是最有效的调节因素之一，对成功怀孕至关重要(20). CXCR4广泛参与胎盘的生物学功能，包括细胞滋养层细胞分化、母胎免疫耐受、血管重塑和外周血自然杀伤细胞分化(21–25). CXCR4及其独特的配体CXCL12已被证实对妊娠早期蜕膜基质细胞的侵袭至关重要，并在母胎界面中起重要作用(23). 在本研究中，发现CXCR4在妊娠早期绒毛中的表达显著高于正常足月胎盘，这与之前的研究一致(26)据报道，来自绒毛和蜕膜的人类细胞滋养层细胞表达高水平的各种趋化因子受体，包括CXCR4。越来越多的证据表明，CXCR4可能参与多种癌症细胞的侵袭和迁移，包括卵巢癌、结肠癌和前列腺癌(27–29). 由于滋养层细胞的侵袭性与肿瘤细胞相似，因此推测缺氧也能增加JEG3滋养层细胞CXCR4的表达。本研究中获得的数据通过揭示低氧诱导JEG3细胞中CXCR4的显著上调来验证这一假设。研究还发现，低氧对CXCR4的上调可促进胃癌细胞和乳腺癌细胞的侵袭和转移能力在体外(12，16). 细胞滋养层细胞正常迁移和侵入母体子宫壁对胚胎成功植入很重要，而异常迁移和侵入会导致妊娠并发症，包括流产、先兆子痫和胎儿生长受限(30，31). 此外，人类巨细胞病毒感染已被证实通过整个妊娠早期CXCR4/CXCL12信号的失调来抑制绒毛外细胞滋养层的迁移和侵袭(32). 与之前的几项研究一致(6，33，34)本研究发现，暴露于3%O后，滋养层细胞的迁移和侵袭增强2因此，有人假设CXCR4在滋养层细胞中的表达依赖于妊娠早期的生理缺氧。
没有分析妊娠中期的胎盘组织，因为很难获得妊娠中期的胎盘样本。在文献中，关于CXCR4在妊娠中期的作用存在相互矛盾的数据。阿尔·哈西等(35)评估第二和第三孕期滋养层样本中CXCR4的表达，发现在第二孕期人类胎盘滋养层细胞中没有CXCR4表达，尽管它在足月胎盘滋养层中表达。尽管石井等(36)通过检测两名供体孕中期滋养层细胞中CXCR4的表达，提示在妊娠的所有三个月中，CXCR4可能参与胎盘功能的自分泌或旁分泌调节。因此，需要对妊娠中期的更多患者进行进一步研究，以阐明CXCR4的表达模式，并确定CXCR4在妊娠发展中的作用。此外，妊娠中期滋养层细胞的病理性缺氧与妊娠并发症密切相关，包括子痫前期和胎儿生长受限。在这些疾病中，子宫胎盘的主要病理学特征是子宫动脉重塑不良共存，导致胎盘缺氧和滋养层细胞侵袭蜕膜不良(37). 先前的研究表明，CXCR4在子痫前期妊娠胎盘中的表达降低(38)HIF-1α的表达增加(39)与正常妊娠相比。这些发现表明HIF-1α/CXCR4通路的损伤可能参与子痫前期的发病机制。
有报道称，结肠肿瘤细胞中CXCR4的敲低可减轻低氧诱导的迁移和侵袭(40). 在本研究中，发现低氧暴露的JEG3细胞中CXCR4显著增加，CXCR4的敲除抑制了低氧暴露JEG3的迁移和侵袭，表明CXCR4在低氧诱导的滋养层细胞迁移和侵袭的调节中起关键作用。
低氧诱导HIF-1的表达，HIF-1通过与基因启动子内的HREs结合调节许多适应低氧生存的基因，包括葡萄糖转运蛋白-1、促红细胞生成素、血管内皮生长因子、血红素氧化酶、诱导型一氧化氮合酶和不同的糖酵解途径酶(41). 以前的研究(42，43)已证实，与足月对照胎盘的细胞相比，HIF-1α在妊娠早期绒毛外细胞滋养层细胞柱中的蛋白表达显著增高。本研究结果表明，缺氧环境下JEG3细胞HIF-1α和CXCR4的蛋白表达水平显著升高。此外，为了确定HIF-1α是否是通过低氧调节JEG3细胞CXCR4表达所必需的，采用RN干扰抑制HIF-1β的表达，抑制低氧诱导的CXCR4上调，减少低氧暴露下JEG3的迁移和侵袭。相比之下，HIF-1α的过度表达促进了CXCR4的上调，增加了缺氧条件下JEG3细胞的迁移和侵袭，表明CXCR4基因可能是HIF-1β介导的JEG3缺氧的下游靶点。因此，HIF-1α在缺氧诱导CXCR4表达调控滋养层细胞迁移和侵袭中起着关键作用。总之，妊娠早期的低氧环境可能上调CXCR4的表达，从而通过激活转录因子HIF-1α促进滋养层细胞迁移和侵袭。这些结果为理解胎盘发育机制提供了潜在的见解。此外，由于缺氧诱导的滋养层细胞中CXCR4的表达不仅可能影响滋养层细胞的迁移和侵袭，还可能影响滋养层细胞的分化、增殖或其他功能，趋化因子与胎盘受体相互作用的潜在机制可能很复杂，需要进一步研究。
本研究有一些局限性。首先，由于难以获得妊娠中期胎盘组织，因此未检测到CXCR4在妊娠中期绒毛中的表达。其次，未使用HTR-8/SVneo细胞或原始滋养层细胞作为对照细胞。此外，包括JAR和BeWo在内的其他滋养层细胞具有不同的特性，并且对3%O培养有不同的反应2与入侵、迁移、增殖和分泌蛋白酶有关(6，44). 因此，需要在所有实验中使用其他滋养层细胞和初级滋养层细胞进行进一步的研究，以为本研究中提出的结果提供额外的支持。
总之，本研究结果表明，低氧环境下细胞CXCR4的激活对正常妊娠至关重要，并通过HIF-1α的激活促进滋养层细胞的迁移和侵袭。需要进一步研究以阐明CXCR4在初级滋养层细胞中的作用机制。
致谢
作者感谢Ying Shi博士（中国郑州大学第三附属医院）对手稿的有益建议和评论。
基金
本研究得到了河南省科技创新项目（批准号：131PCXTD624）的资助。
数据和材料的可用性
本研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。
作者的贡献
ZZ和PL构思并设计了该研究。ZZ、PL、YW和HY进行了实验。ZZ和PL写了这份手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
道德批准和参与同意
本研究方案经郑州大学第三附属医院伦理审查委员会批准（身份证号：2015023）。
参考文献
1James JL、Stone PR、Chamley LW。妊娠早期氧对滋养层细胞分化的调节。Hum Reprod更新。2006;12:137–144. doi:10.1093/humupd/dmi043。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Jauniaux E、Watson AL、Hempstock J、Bao YP、Skepper JN、Burton GJ。母体动脉血流和胎盘氧化应激的发生。人类早孕失败的一个可能因素。《美国病理学杂志》。2000年；157:2111–2122. doi:10.1016/S0002-9440（10）64849-3。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Hiden U、Eyth CP、Majali-Martinez A、Desoye G、Tam-Amersdorfer C、Huppertz B、Ghaffari Tabrizi-Wizsy N。基质金属蛋白酶12的表达对妊娠早期的非增殖性侵袭性滋养层细胞具有高度特异性，并受包括HIF-1A在内的氧依赖机制的暂时调节。组织化学细胞生物学。2018;149:31–42. doi:10.1007/s00418-017-1608-y。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Crocker IP、Wareing M、Ferris GR、Jones CJ、Cartwright JE、Baker PN、Aplin JD。血管来源、氧气和肿瘤坏死因子α对体外母动脉滋养层细胞侵袭的影响。病理学杂志。2005;206:476–485. doi:10.1002/path.1801。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Onogi A、Naruse K、Sado T、Tsunemi T、Shigetomi H、Noguchi T、Yamada Y、Akasaki M、Oi H、Kobayashi H。人类妊娠早期，缺氧通过减少基质金属蛋白酶（MMP）-2的活化抑制绒毛外滋养层细胞的侵袭。胎盘。2011;32:665–670. doi:10.1016/j.placenta.2011.06.023。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Lash GE、Hornbuckle J、Brunt A、Kirkley M、Searle RF、Robson SC、Bulmer JN。低氧浓度对滋养层样细胞系侵袭的影响。胎盘。2007;28:390–398. doi:10.1016/j.placenta.2006.06.001。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7哈达德JJ。氧感应机制和氧化还原反应转录因子在发育和病理生理学中的调节。Respir Res公司。2002;三：26.doi:10.1186/rr190。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Ziello JE，Jovin IS，Huang Y.低氧诱导因子（HIF）-1调节通路及其在恶性肿瘤和缺血治疗干预中的潜力。耶鲁生物医学杂志。2007;80:51–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Zagzag D、Lukyanov Y、Lan L、Esencay M、Mendez O、Yee H、Voura EB、Newcomb EW。低氧诱导因子1和VEGF上调胶质母细胞瘤中的CXCR4：血管生成和胶质瘤细胞侵袭的意义。实验室投资。2006;86:1221–1232. doi:10.1038/lipinvest.3700482。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Wang X，Li C，Chen Y，Hao Y，Zhou W，Chen C，Yu Z。缺氧通过HIF-1α激活增强CXCR4表达，有利于小胶质细胞迁移。生物化学与生物物理研究委员会。2008;371:283–288. doi:10.1016/j.bbrc.2008.04.055。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Ishikawa T、Nakashiro K、Klosek SK、Goda H、Hara S、Uchida D、Hamakawa H。缺氧通过激活HIF-1增强口腔鳞癌中CXCR4的表达。Oncol代表。2009;21:707–712.[公共医学][谷歌学者] 12哦，YS，Kim HY，Song IC，Yun HJ，Jo DY，Kim S，Lee HJ。低氧通过激活低氧诱导因子-1α诱导胃癌细胞CXCR4表达和生物学活性Oncol代表。2012;28:2239–2246. doi:10.3892/或.2012.2063。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Yoshie O，Imai T，Nomiyama H。免疫中的趋化因子。高级免疫学。2001;78:57–110. doi:10.1016/S0065-2776（01）78002-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Zlotnik A，Yoshie O.趋化因子：一种新的分类系统及其在免疫中的作用。免疫。2000年；12:121–127. doi:10.1016/S1074-7613（00）80165-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15默多克·C·CXCR4：超常趋化因子受体。免疫学评论。2000年；177:175–184. doi:10.1034/j.1600-065X.2000.17715.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Cronin PA、Wang JH、Redmond HP。低氧通过上调CXCR4增加乳腺癌细胞的转移能力。BMC癌症。2010;10：225.网址：10.1186/1471-2407-10-225。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Schanz A、Winn VD、Fisher SJ、Blumenstein M、Heiss C、Hess AP、Kruessel JS、Mcmaster M、North RA。子痫前期与胎盘合胞体滋养层细胞和母亲血液中CXCL12水平升高有关。欧洲妇产科学杂志。2011;157:32–37. doi:10.1016/j.ejogrb.2011.02.023。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Krishnamachary B、Berg-Dixon S、Kelly B、Agani F、Feldser D、Ferreira G、Iyer N、LaRusch J、Pak B、Taghavi P、Semenza GL.低氧诱导因子1对结肠癌细胞侵袭的调节。癌症研究。2003;63:1138–1143.[公共医学][谷歌学者] 19Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2（-Delta Delta C（T））方法分析相关基因表达数据。方法。2001;25:402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Bischof P，Irminger-Finger I.人类细胞滋养层细胞，单核变色龙。国际生物化学与细胞生物学杂志。2005;37：1–16.doi:10.1016/j.biocel.2004.05.014。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Yang Y，Zou L，Li M，Zhao Y.滋养层细胞中CXCL12/CXCR4的表达参与母胎免疫耐受和血管重塑。华中科技大学医学科学杂志。2006;26:466–468. doi:10.1007/s11596-006-0423-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22James JL、Stone PR、Chamley LW。妊娠早期的细胞滋养层细胞分化：绒毛外滋养层细胞和合胞体滋养层细胞分离祖细胞的证据。繁殖。2005;130:95–103. doi:10.1530/rep.1.00723。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23任磊，刘玉强，周文华，张玉姿。滋养细胞衍生的趋化因子CXCL12促进CXCR4的表达和人类早期妊娠蜕膜基质细胞的侵袭。哼哼重复。2012;27:366–374. doi:10.1093/humrep/der395。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Takashima A、Takeshita N、Kinoshita T。妊娠第12天的子宫NK细胞含有CXCR4或IL-15受体承载细胞和干扰素-γ产生细胞。人类代表。2014;29:135. [谷歌学者] 25Ba H，Li B，Li X，Li C，Feng A，Zhu Y，Wang J，Li Z，Yin B。跨膜肿瘤坏死因子-α通过TNFR2上调CXCR4的表达，促进MDSC向肿瘤组织的募集。国际免疫药理学。2017;44:143–152. doi:10.1016/j.intimp.2016.12.028。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Schanz A、Red-Horse K、Hess AP、Baston-Büst DM、Heiss C、Krüssel JS。氧通过控制趋化因子和受体的表达来调节人类细胞滋养层细胞的迁移。胎盘。2014;35:1089–1094. doi:10.1016/j.placenta.2014.09.012。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Chiaramonte R、Colombo M、Bulfamante G、Falleni M、Tosi D、Garavelli S、De Simone D、Vigolo E、Todoerti K、Neri A、Platonova N.Notch途径通过CXCR4/SDF1α趋化因子系统促进卵巢癌生长和迁移。国际生物化学与细胞生物学杂志。2015;66:134–140. doi:10.1016/j.biocel.2015.07.015。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Zhang SS，Han ZP，Jing YY，Tao SF，Li TJ，Wang H，Wang Y，Li R，Yang Y，Zhao X等。CD133（+）CXCR4（+）结肠癌细胞具有转移潜能，预测患者预后不良。BMC医学。2012;10：85.doi:10.186/1741-7015-10-85。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Akashi T、Koizumi K、Tsuneyama K、Saiki I、Takano Y、Fuse H.趋化因子受体CXCR4在转移性前列腺癌患者中的表达和预后。癌症科学。2008;99:539–542. doi:10.1111/j.1349-7006.2007012.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30田福杰，秦CM，李旭霞，吴凤，刘旭荣，徐伟民，林毅。stathmin-1表达减少抑制滋养层细胞增殖和侵袭，并与反复流产相关。《美国病理学杂志》。2015;185:2709–2721. doi:10.1016/j.ajpath.2015.06.010。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Kaufmann P，Black S，Huppertz B。血管内滋养层细胞侵袭：宫内生长迟缓和子痫前期发病机制的意义。生物繁殖。2003;69：1-7.doi:10.1095/biolreprod.102.014977。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Warner JA、Zwezdaryk KJ、Day B、Sullivan DE、Pridjian G、Morris CA。人类巨细胞病毒感染抑制CXCL12介导的人类绒毛外细胞滋养层细胞的迁移和侵袭。维罗尔J。2012;9：255。doi:10.11186/1743-422X-9-255。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Wang L，Yu Y，Guan H，Liu T，Qiao C.67-kDa层粘连蛋白受体通过介导基质金属蛋白酶-9参与低氧诱导的滋养层样细胞迁移和侵袭。临床实验药理学。2015;42:549–558. doi:10.1111/1440-1681.12389。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Zhu J，Wang K，Li T，Chen J，Xie D，Chang X，Yao J，Wu J，Zhou Q，Jia Y，Duan T。缺氧诱导的TET1通过HIF1α信号通路促进滋养层细胞的迁移和侵袭。科学代表。2017;7：8077.doi:10.1038/s41598-017-07560-7。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Al-Harthi L、Guilbert LJ、Hoxie JA、Landay A.滋养层细胞被1型HIV的CD4依赖性分离物有效感染。艾滋病Res-Hum逆转录病毒。2002;18:13–17. doi:10.1089/088922202753394673。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Ishii M、Hayakawa S、Suzuki MK、Yoshino N、Honda M、Nishinarita S、Chishima F、Nagaishi M、Satoh K。人类胎盘细胞功能性趋化因子受体的表达。美国生殖免疫学杂志。2000年；44:365–373. doi:10.1111/j.8755-8920.2000.440608.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Hayashi M、Sakata M、Takeda T、Tahara M、Yamamoto T、Okamoto Y、Minekawa R、Isobe A、Ohmichi M、Tasaka K、Murata Y。通过低氧诱导因子-1α上调c-met原癌基因产物的表达参与低氧条件下滋养层细胞的侵袭。内分泌学。2005;146:4682–4689. doi:10.1210/en.2005-0416。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38陆杰，周浩，任立，张艺珍。CXCR4、CXCR7和CXCL12与滋养层细胞凋亡相关，并与重度子痫前期的病理生理学相关。实验分子病理学。2016;100:184–191. doi:10.1016/j.yexmp.2015.12.013。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Rath G、Aggarwal R、Jawanjal P、Tripathi R、Batra A.HIF-1α和胎盘生长因子在妊娠合并子痫前期中的作用：定性和定量分析。临床实验室分析杂志。2016;30:75–83. doi:10.1002/jcla.21819。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Romain B、Hachet-Haas M、Rohr S、Brigand C、Galzi JL、Gaub MP、Pencreach E、Guenot D。缺氧对结肠癌中CXCR4和CXCR7信号的差异调节。摩尔癌症。2014;13：58.网址：10.1186/1476-4598-13-58。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41Semenza GL.低氧诱导因子1对哺乳动物氧稳态的调节。年收入细胞开发生物。1999;15:551–578. doi:10.146/annrev.cellbio.15.1.551。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Rajakumar A，Conrad KP。人胎盘中低氧诱导转录因子的表达、个体发育和调节。生物繁殖。2000年；63:559–569. doi:10.1095/biolreprod63.2.559。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 43Pringle KG，Kind KL，Sferruzzi-Perri AN，Thompson JG，Roberts CT。超越氧气：妊娠期缺氧诱导因子的复杂调节和活性。Hum Reprod更新。2010;16:415–431. doi:10.1093/humupd/dmp046。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Rothbauer M、Patel N、Gondola H、Siwetz M、Huppertz B、Ertl P。四种不同人类滋养层衍生细胞系之间五个关键生理参数的比较研究。科学代表。2017;7：5892.doi:10.1038/s41598-017-06364-z。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
