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开发生物学杂志。2017年12月；5(4): 18.
2017年12月19日在线发布。 数字对象标识：10.3390/jdb5040018
预防性维修识别码：第5831799页
PMID：29615573

Ttc21b型Bergmann胶质瘤需要颗粒细胞径向迁移

Ashley M.司机,1 克里斯托弗·舒姆里克,1和罗尔夫·斯托特曼1,2,*
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补充资料

摘要

小脑的正常发育依赖于严格调控的增殖、迁移和分化事件。其中任何一种的破坏都会导致一系列小脑表型，从共济失调到儿童肿瘤。动物模型表明，适当调节声波刺猬(嘘)信号传导对正常的小脑结构至关重要，而信号传导的增加会导致小脑肿瘤的形成。已知初级纤毛对多种发育信号通路的适当调节是必需的，包括嘘.四三肽重复结构域21B(Ttc21b型)是正常初级纤毛形态和功能所必需的，主要被认为是限制嘘发出信号。在这里，我们调查了Ttc21b型在小脑发育中。令人惊讶的是，Ttc21b型Bergmann胶质细胞的消融导致小脑下叶/后叶异位颗粒细胞的积聚，以及嘘发送信号。Ttc21b型仅Purkinje细胞的消融导致在较少的细胞中出现类似的表型，但遍及小脑的整个范围。这些结果表明Ttc21b型Bergmann胶质细胞的结构和信号在发育中的小脑中需要表达，在某些情况下，这种表达增强而不是减弱嘘发送信号。

关键词：Ttc21b型，纤毛，嘘、小脑、出生后、迁移、Purkinje细胞、Bergmann胶质细胞、Cre、LoxP

1.简介

小脑的发育包括出生后的显著生长和形态变化。哺乳动物大脑中数量最多的细胞类型是小脑颗粒细胞，估计人类约有1000亿个细胞[1]. 在小鼠和人类中，小脑颗粒细胞在出生后产生于外颗粒层（EGL）。有丝分裂后的颗粒细胞在伯格曼神经胶质纤维上径向迁移到小脑内部，最终形成内部颗粒层（IGL）。在人类中，小脑发育受阻可导致多种结构畸形，包括小脑发育不全、正常叶状结构失效和肿瘤形成[2].

音猬因子(嘘)信号转导已成为小脑早期发育的一种公认途径。颗粒细胞增殖和Bergmann胶质细胞迁移束的正常发育都需要Purkinje细胞分泌的声波刺猬（SHH）[3,4,5,6]. 下游GLI转录因子在小脑发育早期具有动态表达模式[7].

更改的级别嘘信号传导具有严重的小脑发育后果，并可导致肿瘤形成。损失嘘信号转导导致颗粒细胞增殖减少和小脑发育不全[8,9,10]. 除了发育不全外Gli2公司带有En1-Cre公司导致Purkinje细胞和Bergmann胶质细胞形态异常[8]. 删除Gli1和Gli2导致叶理和图案的进一步破坏[8]. 在人类中，SHH信号受损与Joubert和Meckel综合征的小脑异常有关[11]. 相反，SHH信号通过丢失已修补-1或组成性激活的平滑突变导致髓母细胞瘤形成[12,13,14,15,16].

初级纤毛是一种非能动的感觉细胞器，现已被公认为对SHH途径的适当调节至关重要[17]. 许多蛋白质通过鞭毛内运输（IFT）通过初级纤毛运输。GLI蛋白尤其需要通过初级纤毛进行IFT，以便正确处理成转录抑制物/激活物形式[18,19]. 纤毛和/或IFT的丢失导致多种缺陷影响SHH信号转导，包括GLI处理模式的扰动。与SHH信号转导中的这一作用一致，初级纤毛的缺失会导致小脑发育不全[10]并调节其他突变对肿瘤形成的影响[14].

在IFT蛋白中，四三肽重复结构域21B(Ttc21b型;139英尺)是正常睫状体逆行运输所必需的[19]以及早期前脑模式和发育[20,21]. 多项研究表明，TTC21B蛋白（或IFT139同源蛋白）存在于初级纤毛中[19,22,23]. 损失Ttc21b型已证明会导致GLI3处理异常，从而增加嘘信号[19,21]. 在人类中，TTC21B型是纤毛病变患者中最常见的突变基因之一，在小脑疾病如Joubert综合征中也存在变异[22]. 我们假设损失Ttc21b型出生后发育期间可能影响SHH信号传导和小脑发育。为了调查这一点并避免围产期死亡Ttc21b型突变体[19]，我们使用Cre-loxP系统分别消融Ttc21b型在Bergmann胶质细胞和Purkinje细胞中。令人惊讶的是Ttc21b型导致小脑后叶出现异位颗粒细胞。对受累肺叶的分析显示Bergmann胶质细胞和Purkinje细胞形态异常，SHH信号减少。这些结果表明Ttc21b型小脑星形胶质细胞中SHH信号减少的首次证明Ttc21b型.

2.材料和方法

2.1. 老鼠饲养业

所有动物均按照辛辛那提儿童医院医疗中心IACUC委员会批准的方案进行饲养（IACUC2016-0098）。小鼠被安置在一个光循环12小时的动物饲养场中，可以随意进食和饮水。本研究中使用的所有小鼠等位基因均已发布：Ttc21b型外星人是的空等位基因Ttc21b型[19],Ttc21b型tm1a（KOMP）Wtsi-lacZ公司(Ttc21b型lacZ公司)用于分析Ttc21b型通过LacZ表达盒表达[24],Ttc21b型弗洛克斯[20,24]); a Cre重组酶报告基因B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sor公司tm4（ACTB-td番茄,-EGFP）罗/J型(ROSA公司汤姆医生/EGFP公司)[25]; FVB总重量（GFAP cre）25个月/J（GFAP-核心）[26]和B6.129-Tg（Pcp2-cre）2针/J（Pcp2-Cre）[27].Gli1公司tm2铝合金/J型(Gli1公司lacZ公司)小鼠被用来测量Gli1公司表达式[28]. 对于成人分析，对4个月大的动物进行镇静剂注射，并使用标准程序进行多聚甲醛心内灌注。随后采集大脑，在室温下（RT）将其固定在4%多聚甲醛中48小时，并嵌入石蜡中。对于出生后的大脑采集，用异氟醚给幼崽注射镇静剂，以减少斩首后的不适。收集大脑并在4°C下固定24小时，然后将其埋入O.C.T.培养基（Tissue-Tek）中进行冷冻切片或石蜡切片。

2.2. 组织学和免疫组织化学

为了进行组织学分析，在Leica切片机上采集厚度为5μM的脑切片。对切片进行脱色、苏木精和伊红染色，并使用Cytoseal（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）密封。图像是用蔡司立体镜获得的（所有成对图像均以相同的放大倍数显示）。对于3,3′-二氨基联苯胺（DAB）免疫组织化学，切片脱色并用过氧化氢漂白。切片在RT的一级抗体（NeuN，1:500；Ki67 1:500）中培养过夜。然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗切片，并在RT的生物素化猪抗兔二级抗体（1:500；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）中培养2小时。然后在PBS中清洗切片，并在RT条件下在亲和素-生物素复合物（ABC）溶液（Vector Laboratories）中培养1小时。然后使用DAB清洗切片并可视化3分钟，然后进行PBS清洗、乙醇脱水、二甲苯培养，并用Cytoseal（Thermo）固定切片。对于荧光免疫组织化学，在Leica冷冻恒温器上收集12μM厚的切片，并在用柠檬酸钠缓冲液提取抗原之前在PBS中清洗（根据每个抗体的情况）。然后用PBS清洗切片，并在RT时在封闭缓冲液（PBS+4%正常山羊血清和0.1%Triton-X）中培养1小时。切片在4°C下在封闭缓冲溶液中稀释的一级抗体中培养过夜：Calbindin 1:1000（Abcam，ab25085）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）1:500（Abcam，ab7260）和磷酸氢istone H3（pHH3）1:500（SIGMA，H0412）。然后清洗切片并在Alexa Fluor-conjugated二级抗体中孵育，二级抗体稀释在封闭缓冲液中（1:500，Thermo Scientific，Waltham，MA，USA），然后进行PBS洗涤和DAPI复染（1:1000）10分钟ROSA公司汤姆医生/EGFP公司Cre报告等位基因，切片仅在RT下与抗GFP抗体（1:100，Life Technologies，A21311）孵育1小时，然后进行洗涤和DAPI复染。切片用ProLong Gold（生命科技）密封，图像在尼康C2共焦显微镜上获得。所有配对图像均在相同的放大倍数下拍摄。

2.3. 切片原位杂交与LacZ染色

为了进行RNA切片原位杂交（SISH）和LacZ染色，在Leica低温恒温器上收集厚度为20μM的切片。根据标准方案进行原位杂交。对于LacZ染色，切片在PBS中清洗，然后在冰块上的冷0.5%PFA中固定，然后在冰上的LacZ缓冲液中进行PBS清洗和培养。然后将切片在4°C的X-Gal溶液中培养1-3天，然后在PBS中清洗，在曙红中复染，并脱水。切片用Cytoseal（Thermo）密封，图像在蔡司立体镜上拍摄，所有成对图像在相同的放大倍数下拍摄。

3.结果

3.1. Ttc21b在发育中小脑浦肯野细胞层中富集，GFAP消融Ttc21b-导致小脑异位颗粒细胞

我们使用了Ttc21b型lacZ公司决定模式的等位基因Ttc21b型在发育中的小脑中的表达。P1–P10的LacZ染色显示Purkinje细胞层（PCL）和小脑深核（DCN）表达；图1). 这些阶段的Purkinje细胞层由Purkinje细胞和Bergmann胶质细胞体组成[29].

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Ttc21b型在出生后的小鼠小脑中表达。(A类–F类)来自Ttc21b型lacZ公司报告者在小脑的浦肯野细胞层P1–P10中很明显。中的框A类,C类,E类指出重点领域B类,D类,F类分别是。LacZ染色n≥3。DCN：小脑深部核团；PCL：浦肯野细胞层。

已知SHH信号在出生后早期小脑发育中的作用以及Ttc21b型在调节中嘘信号，我们试图确定Ttc21b型发育中的小脑需要。为了避免围产期死亡Ttc21b型无效突变[19]，我们使用条件遗传方法，并使用GFAP-Cre进行基因消融[26](图S1A-C). 与之前的报告一致，在端脑半球和小脑中观察到GFAP-Cre-simmulated重组。为了确认显示Cre活性的细胞类型，我们使用了Cre重组酶报告基因，ROSA公司汤姆医生/EGFP公司结合免疫组化。我们发现GFP免疫反应的显著共定位表明Cre活性与GLAST标记未成熟星形胶质细胞(图S1G-I)但在Calbindin阳性Purkinje细胞中没有这种共定位(图S1D–F).

我们基因消融了Ttc21b型从Bergmann glia通过交叉GFAP-核心；Ttc21b型氮化铝/重量小鼠Ttc21b型弗洛克斯/弗洛克斯要生成的动物GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝缺乏功能的小鼠Ttc21b型在整个GFAP家族中。组织学分析GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝P7的动物在小脑结节区显示出致密的颗粒细胞区域，而对照组动物没有出现(图2A、 B，箭头；[30]. 4个月大的成人小脑也观察到这种表型。有趣的是，异位细胞出现在小脑后部（第九叶和第十叶；图2C–F）。我们用免疫组化NeuN作为分化神经元的标记物，证明这些细胞是分化的颗粒细胞。增殖细胞的Ki67免疫染色表明这些细胞没有有丝分裂活性(图2G–J）。这表明，异位细胞虽然移位，但并没有像之前在小脑中操纵SHH信号时所显示的那样形成肿瘤。

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烧蚀Ttc21b型星形胶质细胞导致小脑内异位颗粒细胞。P7的H&E染色(A类,B类)和4个月大(C类–F类)显示小脑外层的颗粒细胞GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝对照组中未发现的动物（n>4）。NeuN免疫反应表明这些异位细胞是分化的颗粒细胞(克,H（H），箭头）。成人增殖细胞Ki67免疫染色阴性(我,J型)，表明这些不是增殖性肿瘤。成人组织学检查n≥4，成人DAB染色和P7组织学检查中n≥3。

3.2. Ttc21b缺失后Purkinje细胞和Bergmann胶质细胞发育受到干扰

接下来我们试图确定为什么异位细胞可能存在于GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物。我们最初推断，它们可能是没有从外部颗粒层的形成部位适当迁移的颗粒细胞。作为正常颗粒细胞发育的一部分，这种迁移沿着径向的Bergmann胶质纤维发生[6]. 为了评估这一假设，我们对Bergmann胶质细胞的发育进行了免疫组织化学分析。

如Nestin和GLAST的免疫反应所示，未成熟的Bergmann胶质细胞以大约适当的数量出现，并且P1似乎已经建立了放射状纤维(图3A–D）。Purkinje细胞被指定并迁移到总建筑面积Cre；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝P1小脑(图3E、 F）。然而，通过P11GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物表现出小脑下叶的Bergmann胶质纤维受损，无法形成适当的迁移支架(图3G、 H）。有趣的是，我们没有注意到异位细胞的前叶似乎有正常的Bergmann胶质细胞GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物(图3K、 L）。在P11，Purkinje细胞体排列不规则，树突状树干在GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物与对照组的比较(图3K、 L）。

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Purkinje细胞和Bergmann胶质细胞的发育在GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝小脑。(A类–D类)Nestin对P1处未成熟星形胶质细胞的免疫染色(A类,B类)和GLAST(C类,D类)控件和之间看起来类似GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝动物。(E类,F类)钙结合蛋白免疫染色突出了对照组和对照组P1处浦肯野细胞的存在GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝动物。(克–J型)P11 GFAP阳性成熟星形胶质细胞(克,H（H）)和钙结合蛋白阳性的浦肯野细胞(我–L（左）)在下叶出现异常GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝小脑。(K,L（左）)所有动物的前叶仍显示正常的Bergmann胶质细胞形态。每个基因型n=3。标尺50μm。

3.3. GFAP-Cre中SHH信号减少；Ttc21b型flox/aln公司小脑

由于初级纤毛是嘘信号和丢失Ttc21b型已经证明影响SHH信号传导，然后我们研究了GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物和Gli1公司lacZ公司等位基因[31].Gli1公司lacZ公司Purkinje细胞层的表达减少Gli1公司lacZ公司;GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/铝镍合金动物(图4A–D，箭头）。自Gli1公司Purkinje细胞不表达，这些结果表明Bergmann胶质细胞中SHH信号活性缺失[7]. 另一种RNA切片原位杂交嘘转录靶点-补丁-1(第1页)-在Purkinje细胞层的GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/外星人P11处动物与对照组的比较(图4E、 F，箭头）。然而嘘其本身在GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝和对照动物，表明分泌SHH配体的Purkinje细胞表达不受影响(图5G、 H）。综合起来，这些数据表明嘘成年人的信号传导减少GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝小脑——与之前的观察结果有显著差异Ttc21b型神经系统的功能。

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嘘信令减少GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝小脑。(A类–D类)第11页Gli1公司-LacZ活性在GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝动物(B类,D类)与对照组相比(A类,C类). (E类,F类)补丁1表达式也在总建筑面积Cre；Ttc21b型外汇/氮化铝P11小脑(F类)与对照组相比(E类)特别是在浦肯野细胞层（开放箭头）。(克,H（H）)嘘控件之间的表达式类似(克)和GFAP-核心；Ttc21b型外汇/氮化铝(H（H）)，但组织嘘-切除动物小脑下叶的表达细胞再次出现紊乱。

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烧蚀Ttc21b型具有Pcp2-Cre公司结果异位颗粒细胞表型相似，但较温和。(A类,B类)小面积的移位颗粒细胞（箭头）出现在Pcp2-Cre；Ttc21b型外汇/氮化铝1个月大时的大脑。(B类,D类：中的框A类,B类显示中高亮显示的区域C类,D类). (E类–我)这些细胞在4个月大时仍然可见Pcp2-Cre；Ttc21b型外汇/氮化铝动物(H（H）和NeuN免疫阳性，表明这些细胞是分化的颗粒细胞(J型，箭头）。每个基因型n≥3。

3.4. Ttc21b的Purkinje细胞消融导致轻度异位颗粒细胞表型

自从我们观察到Ttc21b型在既有Purkinje细胞又有Bergmann胶质细胞的Purkinje细胞层中表达，我们进行了类似的基因消融Ttc21b型在具有Pcp2-Cre公司[27](图S2). 在1个月大的时候，组织学分析再次显示在卵巢外层有小面积的异位细胞Pcp2-Cre；Ttc21b型弗洛克斯/铝镍合金小脑(图5A–D，箭头）。4个月大的婴儿也会定期出现这种情况Pcp2-Cre；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝(图5E–H，n=4）。NeuN的免疫组织化学再次表明，这些细胞是分化的颗粒细胞，不能迁移到IGL(图5I、 J）。有趣的是，这种表型的渗透性低于GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物，但不仅限于后叶。

4.讨论

在这里，我们展示了Ttc21b型在发育中的小鼠小脑的Bergmann胶质细胞和Purkinje细胞中。使用GFAP-核心基因消融Ttc21b型，我们发现小脑外层保留了一些颗粒细胞，特别是在第IX和X叶。这似乎是颗粒细胞迁移失败，因为Bergmann胶质细胞作为颗粒细胞迁移的基质，减少了切除动物下叶的放射状投射。相比之下Pcp2-Cre公司Purkinje细胞特异性消融具有相似但不太严重的表型，只有稀疏的异位颗粒细胞区域。此外，虽然GFAP-Cre重组发生在Bergmann胶质细胞中，但我们注意到对Purkinje细胞发育的影响，支持先前的建议，即这两种细胞类型之间的关键相互作用是Purkinje细胞树突状发展所必需的。我们还观察到Ttc21b型导致浦肯野细胞层SHH信号传导减少，这是我们第一次减少嘘失去的途径Ttc21b型.

Bergmann胶质细胞的放射状纤维是发育中小脑颗粒细胞的主要迁移束[6]这些放射状纤维的断裂以前被证明与异位颗粒细胞有关[32,33]. 我们只在突变体受影响的叶中观察到成熟的Bergmann胶质细胞破裂，这表明这是颗粒细胞迁移失败的主要原因。此外，我们注意到在GFAP-核心；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝符合Bergmann胶质细胞和Purkinje神经元之间大量相互作用的动物[34,35,36]. 异位颗粒细胞表型在Pcp2-Cre；Ttc21b型弗洛克斯/氮化铝动物。这可能表明不同的细胞特定要求Ttc21b型的确TTC21B型变异体显示，除了纤毛异常外，人类足细胞的细胞骨架也异常，表明纤毛异常与足细胞的多种功能有关TTC21B型[37]. 此外，Pcp2-Cre公司重组在发育过程中发生的时间比GFAP-Cre（P5）晚，并且可能不会完全消融Ttc21b型直到许多细胞已经完成迁移。

之前的报告Ttc21b型氮化铝/氮化铝突变体除了GLI异常处理外，还显示SHH信号增加。胚胎期，失去Ttc21b型导致GLI3的翻译增加和异常蛋白水解过程[19]. 在胚胎前脑中也发现SHH活性不适当Ttc21b型氮化铝/氮化铝GLI3处理异常的突变体[19,21]. 在出生后删除Ttc21b型，GLI2活性增加导致多囊肾[24]. 与这些发现相反，我们报告下游已修补和Gli1公司，与减少的一致嘘发送信号。

While期间GFAP-核心应导致损失Ttc21b型在整个小脑中，我们只在后叶观察到异位颗粒细胞表型。GLI2富集于P5周围发育中小脑后叶的Purkinje细胞层，已被证明是SHH阳性信号的主要效应器[7]. 虽然所有三种GLI转录因子都在发育中的小脑中表达，Gli1公司局限于Purkinje细胞层的Bergmann胶质细胞[7]. 然而，这里报告的表型不太可能仅仅是由于对Gli1公司，作为Gli1公司纯合无效突变体具有表型正常的小脑[38]. 两者都有Gli2公司和Gli3公司null小鼠小脑发育异常，主要是叶理缺陷[39]. 此外Gli2公司已经证明导致异常的Bergmann胶质细胞形态和Purkinje细胞排列[8]. 初级纤毛是将GLI2蛋白正确加工为转录激活物和GLI3蛋白正确加工成转录阻遏物所必需的。正常纤毛功能的丧失可能对不同组织中的SHH信号产生不同的影响，取决于哪种GLI蛋白在发育的特定时间起着更为突出的作用。给出了Gli2公司在与异位细胞及其在刺激SHH信号传导中的作用相同的区域，出生后小脑中SHH的减少可能比GLI3阻遏物更能反映GLI2激活物形式的丢失。

睫状体基因和SHH信号转导在人类小脑发育中的作用是一个迅速扩展的研究领域。Joubert综合征和Meckel综合征患者细胞中SHH信号失调[11]. 有趣的是，TTC21B型变异与Joubert综合征患者相关[40]. 我们的研究表明Ttc21b型在小脑胶质细胞和Ttc21b型在不同组织中可导致SHH信号的增加和减少。

鸣谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01 NS085023）的支持。

补充资料

以下内容可在线获取，网址为网址：www.mdpi.com/2221-3759/5/4/18/s1图S1:GFAP-Cre重组发生在小脑的Bergmann胶质细胞中，图S2:Pcp2-Cre重组发生在小脑的Purkinje细胞中。

作者贡献

A.M.D.和R.W.S.构思并设计了实验；A.M.D.和C.S.进行了实验；A.M.D.、C.S.和R.W.S.分析了数据；A.M.D.和R.W.S.撰写了这篇论文。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，以及在决定公布结果时。

工具书类

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文章来自发育生物学杂志由以下人员提供多学科数字出版研究所（MDPI）