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公共科学图书馆一号。2018; 13（1）：e0191034。
2018年1月12日在线发布。 数字对象标识：10.1371/新闻稿.0191034
预防性维修识别码：下午5766150
PMID：29329317

NADPH氧化酶4激活引起的氧化应激促进对比诱导的急性肾损伤

Bo Young Jeong先生,概念化,数据管理,形式化分析,资金获取,调查,方法论,项目管理,资源,软件,验证,可视化,写作-初稿,1 李海英,概念化,监督,1 长焦公园,概念化,监督,1 Jaeku Kang先生,概念化,监督,1 Seong-Lan Yu先生,概念化,数据管理,监督,验证,2 杜日彩,调查,方法论,可视化,三 韩升云,概念化,验证,三 文轩公园,概念化,监督,验证,4 赵成元（Sungkwon Cho）,数据管理,形式化分析,调查,可视化,5 李秀英,数据管理,可视化,2 黄文敏,概念化,监督,5 宋若云,概念化,监督,5 Hye-Myung Ryu先生,数据管理,形式化分析,调查,可视化,6 Eun Joo噢,数据管理,形式化分析,调查,可视化,6 Sun-Hee公园,概念化,数据管理,形式化分析,监督,验证,6 金永林,概念化,数据管理,形式化分析,监督,验证,6和Se-Hee Yoon先生,概念化,数据管理,形式化分析,资金获取,调查,方法论,项目管理,资源,软件,监督,验证,可视化,写作-初稿,写作–审查和编辑5,*
Partha Mukhopadhyay，编辑器
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数据可用性声明

摘要

对比剂诱发的急性肾损伤（CIAKI）是放射治疗后急性肾损伤的主要原因。肾内氧化应激在CIAKI中起着关键作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸3-磷酸（NADPH）氧化酶（Noxs）是活性氧（ROS）的重要来源。在各种类型的Noxs中，Nox4主要在啮齿动物的肾脏中表达。在这里，我们评估了Nox4的作用和Nox4抑制CIAKI的益处体内和在体外模型。用碘海醇、Nox4敲除或不敲除或最特异的Nox1/4抑制剂（GKT137831）处理HK-2细胞。研究了Nox4抑制对CIAKI小鼠的影响。碘海醇暴露后，HK-2细胞中Nox4的表达显著增加。沉默Nox4可以挽救ROS的产生，降低CIAKI中的促炎症标记物（尤其是磷酸化p38），并降低Bax和caspase 3/7活性，这导致碘海醇处理的HK-2细胞的细胞存活率增加。GKT137831预处理通过降低磷酸化p38水平复制了这些效应。在CIAKI小鼠模型中，尽管血浆尿素氮的改善尚不清楚，但用GKT137831预处理导致结构保留，8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8OHdG）和肾损伤分子-1（KIM-1）的表达减少，TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）的数量减少-阳性细胞。这些结果表明，Nox4是导致CIAKI的活性氧物种的关键来源，并为预防CIAKI提供了一种新的潜在选择。

介绍

碘造影剂（CM）引起的急性肾损伤（CIAKI）是指在没有任何其他已知原因的情况下服用CM后肾功能的急性恶化[1]CIAKI仍然是放射治疗后医源性急性肾损伤（AKI）的主要原因。据报道，1–6%的住院患者发生CIAKI[2]. 特别是，CIAKI的发病率在高危患者中可能高达50%，如脱水、糖尿病肾病、肾损害、容量不足或充血性心力衰竭患者，以及老年人[三,4]. 此外，服用大量CM、对比渗透压以及同时服用药物都是CIAKI的危险因素[5,6]. 尽管存在CIAKI的风险，但在计算机断层扫描和血管干预中使用造影剂程序的情况继续增加，特别是在高危和老年患者中，这些患者有主要的合并症[1,7,8].

CIAKI的确切机制尚不完全清楚。有研究表明，CM增加渗透负荷，减少肾血流量，并导致肾动脉收缩。这种情况会促进活性氧的生成，导致缺血性肾小管损伤，并可能是直接肾小管毒性的原因[1,9]. 氧自由基是内源性产生的，已经确定了不同来源的ROS，从黄嘌呤-黄嘌呤的氧化酶和线粒体到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸3-磷酸氧化酶（NADPH）（Nox）酶[10]. Nox家族由七个成员组成（Nox1-5、DUOX1和DUOX2）。其中，Nox4是肾脏中的主要形式，在基础和病理条件下，如糖尿病肾病和慢性肾脏病，都与肾脏中ROS的生成有关[10–14]; Nox4的上调可能在肾氧化应激和肾损伤中起重要作用。尽管越来越多的证据表明Nox4参与肾脏病理，但很少有研究评估Nox4在AKI中的作用[10,11]. 为了确定Nox4在CIAKI中的作用，我们使用了最特异的Nox1/4抑制剂GKT137831[2-（2-氯苯基）-4-[3-（二甲氨基）苯基]-5-甲基-1H-吡唑并[4,3-c]吡啶-3,6（2H，5H）-二酮](S1图). GKT137831与Nox酶催化亚单位的胞外部分结合。由于GKT137831未观察到对Nox4或Nox1蛋白表达的影响，它似乎以Nox4和Nox1的酶活性为目标[15,16]. 基于这些观察结果，我们利用CIAKI的体内和体外模型研究了Nox4的作用和抑制Nox4作用的益处。

材料和方法

试剂

Iohexol购自东京化学工业株式会社（日本东京都中央区）。GKT137831是一种Nox1/4选择性抑制剂，由Genkyotex（Chemin des Aulx，Plan-les-Outues，瑞士）提供。

细胞培养

HK-2细胞（人肾近端小管上皮细胞）来自韩国细胞系银行（韩国首尔KCLB）。HK-2细胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640中培养。细胞在37°C和5%CO下培养2在加湿的培养箱中。在无胎牛血清的RPMI中将次级流入细胞饥饿12小时，然后用对照培养基（无血清RPMI）或在无血清培养基中稀释的对比剂培养指定时间。

质粒和siRNA转染

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000或RNAiMAX（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）瞬时转染HK-2细胞。将Nox4 cDNA亚克隆到pcDNA3载体中；空白pcDNA3载体作为阴性对照。Nox4 cDNA和pcDNA3载体由Bae实验室（韩国Ehwa Womans大学）提供。靶向Nox4的siRNAs购自Dharmacon（美国科罗拉多州拉斐特）。对照扰乱序列siRNA购自Invitrogen。在50 pmol/ml的浓度下观察到最大效率，因此所有实验均在50 pmol/ml下进行(S2图).

免疫印迹法

用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤HK-2细胞，并在冰冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中在室温下孵育15分钟。还从整个小鼠肾脏制备组织提取物。将全细胞裂解物和蛋白质提取物（50μg）在8%凝胶上进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭非特定部位2小时，然后在4°C的PBS（pH 7.2）中用一级抗体培养膜过夜。用于免疫印迹的抗体如下：抗Nox4（Abcam，Cambridge，MA，USA，#ab109225）、抗磷酸-p38（Cell Signaling Technology，Danvers，MA（USA），#4511S）、抗磷酸盐-JNK（Cell信号技术，#4668S）、防p38（Santa Cruz Biotechnology，Santa Crux，CA，USA，抗磷酸ERK（Santa Cruz Biotechnology，#sc7383）、抗ERK（Santa Cruz Biotechnology，#sc154）、抗Bax（Santa Cruz Biotechnology，#sc493）、抗Bcl-2（Santa Cruz Biotechnology，#sc7382）、抗SOD2（Abcam，#ab13533）、抗GPx-1/2（Santa Cruz Biotechnology，#sc133160）和抗β-肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology，#sc47778）。抗-pERK（细胞信号技术，#4370）、抗-ERK（细胞信令技术，#9102）、抗-p38（细胞信号科技，#9211）、抗p38（细胞信使技术，#9212）、抗-JNK（细胞信令技术，#9251）、JNK，（细胞信号技术，#9252）和抗β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，#1978）用于组织western印迹。用洗涤缓冲液（PBS中0.1%吐温20）洗涤膜两次，并在室温下与辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育2 h。使用洗涤缓冲液洗涤两次后，使用Image Quant 400仪器（英国白金汉郡GE Healthcare），使用增强化学发光法（美国伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科学公司）对条带进行可视化。

细胞活力

使用ATPlite试剂盒（Perkin Elmer-Cetus，美国康涅狄格州）和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）法测定细胞活力。对于ATP分析，使用哺乳动物细胞裂解液稳定裂解产物。培养5分钟后，将底物溶液添加到每个样品中。使用Lumat LB953光度计（EG&G Berthhold，Bad Wildbad，德国）测量发光。对于MTT分析，传代培养的细胞（1×104细胞/ml）暴露于24孔板中不同浓度的试验化合物中，并在37°C和5%CO中培养72小时2在72 h培养后，向孔中添加5 mg/ml MTT溶液（Sigma），并将细胞再培养4 h。然后去除上清液，并向每个孔中添加1 ml二甲基亚砜（DMSO）。紫色甲霜晶体形成并溶解后，立即收集溶液并用移液管将其移入96 well板中。使用630 nm处的光密度作为参考，在590 nm处测量光密度（VICTOR X3；PerkinElmer，Waltham，MA，USA）。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性测定

将接种在96周板中的细胞与Caspase-Glo 3/7底物试剂（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）在37℃孵育30分钟。将样品转移到白色板中，并使用Lumat LB953光度计（EG&G Berthhold）测量发光信号。

定量实时PCR

简言之，用TRIzol试剂（Invitrogen）从给定的细胞系中提取总细胞RNA。从培养细胞中分离出总细胞RNA（2μg），并使用寡核苷酸（dT）和M-MLV逆转录酶（Promega）进行反转录。cDNA浓度调整为100 ng/ml，使用iQ SYBR Green Supermix（美国加利福尼亚州Hercules Bio-Rad Laboratories）进行PCR，在95°C预变性5分钟，然后进行40个DNA扩增周期，包括60°C退火30秒和72°C延伸30秒。分析使用以下引物集：NOX4，5′-GGCTGGAGGCATTGGAGAA-3′（转发）和5′-CCAGTCATCCAACAGGGTT-3′（反面）；β-肌动蛋白，5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3′（转发）和5′-CTGCTTTGCTGATCCACATCTG-3′（反向）。用ΔCt法测定反转录（RT）-PCR产物的相对表达。该方法使用以下等式计算相对表达式：折叠诱导=2−（ΔCt），其中Ct是阈值周期，ΔCt=（Ct感兴趣的基因−Ctβ-肌动蛋白). 每个样品一式三份，进行三个独立的实验。ΔCt方程中使用了平均Ct。

Amplex红色分析

过氧化氢（H2O（运行）2使用Amplex红过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒（Invitrogen）通过Amplex红色检测测定Nox4的最终产物。在暗室中，在红光下制备含有50μM Amplex Red试剂和0.1 U/ml过氧化氢酶的50mM磷酸钠缓冲液（pH 7.4）的反应。将含有一式三份样品（100μL/孔）的白色酶联免疫吸附测定（ELISA）板在黑暗中保存30或60分钟或在实验室环境光下保存。在高温超导多标签阅读器（Perkin Elmer）上测量荧光（激发：535 nm，发射：595 nm）。

细胞间活性氧检测

氧化荧光染料DHE来自Thermo Fisher Scientific Inc.。将细胞培养在12孔板的玻片上。在用冷甲醇固定10分钟并用1%牛血清白蛋白渗透30分钟后，用DHE染色40分钟来评估细胞免疫荧光。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA）、，然后用冰镇PBS清洗细胞三次，持续5分钟，并用共焦显微镜检查（LSM710；德国耶拿卡尔蔡司）。至少有三个独立实验显示了具有代表性的图像，结果类似。

老鼠

雄性C57BL/6小鼠购自Samtako（韩国）。Konyang大学机构动物护理和使用委员会批准了本研究中实验的动物护理方案。

CIAKI小鼠模型

如前所述，在小鼠中诱导CIAKI。在隔夜（16小时）缺水并抑制前列腺素和一氧化氮合成后，向小鼠腹腔内注射低渗透性单体碘造影剂碘海醇（Omnipaque，4000毫克碘/kg）。为了抑制环氧合酶和一氧化氮的合成，向小鼠腹腔注射吲哚美辛（10 mg/kg溶于乙醇）和N-硝基-我-精氨酸甲酯（L-NAME；10 mg/kg溶于0.9%生理盐水中），注射碘海醇前15分钟；该模型在注射造影剂后可可靠地产生肾病，之前已在小鼠和大鼠中验证[17,18]. 然后给动物提供食物和水，24小时后对其实施安乐死，以收集血清BUN并切除肾脏。用剂量为0.55ml/100g体重的氯胺酮/甲苯噻嗪（0.5ml 100mg/ml氯胺酮与0.05ml 20mg/ml甲苯噻嗪组合）麻醉处死动物。

为了确定GKT137831是否对小鼠CIAKI有保护作用，我们将小鼠分为以下治疗组：1）对照组（CONT；n=5），2）CIAKI组（n=8），以及3）GKT137.831治疗组（GKT）+CIAKI治疗组（n=8）。GKT组的小鼠在CIAKI诱导注射之前每天接受一次GKT137831（40 mg/kg），连续5天。24小时后，采集两个肾脏进行相关测量。将右肾固定在4%多聚甲醛中进行组织学评估。采集血样以分离血清并储存在-80°C下(图1).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0191034.g001.jpg
碘海醇诱导AKI模型的实验方案。

在注射碘海醇之前的四天内，每天口服一次GKT137831（6 mg/ml或5 ml/kg）或生理盐水（5 ml/kg。给小鼠注射4000 mg/kg碘海醇。

血液生化指标分析

采用自动生化分析仪（日立7600；日本一芝）测定血尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）水平。超氧化物歧化酶（SOD）活性根据制造商的方案使用SOD检测试剂盒进行测定，SOD活性表示为μg/ml。脂质过氧化，根据丙二醛（MDA）水平进行测定，根据制造商的协议使用MDA检测试剂盒（Sigma）测定血清中的脂质过氧化。血清MDA结果以μM表示。

组织学检查和组织病理学评分

为了检测肾脏损伤，将固定的左肾在乙醇中脱水并包埋在石蜡中。将肾组织块切割成2μm厚的切片，并进行苏木精-伊红（H&E）染色和周期性酸性希夫（PAS）染色。组织学评分通过对10个随机选择的非重叠区域中的肾小管坏死、刷状边界丢失、铸型形成和肾小管扩张进行分级来评估。根据以下标准评估肾损伤程度：0，无；1, 0–10%; 2，11–25%；3, 26–45%; 4, 46–75%.

免疫组织化学

石蜡样品被切割成2μm厚，脱蜡，再水化。用3%H灭活内源过氧化物酶后2O（运行）2将载玻片与10%胎牛血清在Dako缓冲液（Dako）中预先孵育，以阻止非特异性反应。将样品与兔多克隆抗TIM-1抗体（10μg/ml，ThermoFisher，PA5-20244）和山羊抗8-羟基鸟苷多克隆抗体（8-OHdG）（2μg/ml，Abcam，San Francisco，CA，USA，ab10802）在4℃孵育过夜。使用抗-Nox1（Abcam，San Francisco，CA，USA，ab131088）、抗-Nox2/gp91phox（Abcam-San Franchisco，CA-USA，ab80508）和抗-Nox4（Abcam-San Frankisco，CA-USA，ab133302）检测各种NDAPH同源物。在室温下，在10%FCS/Dako缓冲液中应用次级抗体1小时。最后，在室温下，将切片与亲和素过氧化物酶（1:100，Sigma-Aldrich）在10%FCS/Dako缓冲液中培养1h。使用DAB（Sigma-Aldrich）常规观察抗体结合。用苏木精对切片进行复染，脱水，然后装在尤基特。

末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析

根据制造商的说明，使用TUNEL检测试剂盒进行TUNEL分析（HRP试剂盒DBA；意大利米兰Apotag）。简单地说，切片在室温下用15μg/ml蛋白酶K孵育15分钟，然后用PBS洗涤。用3%的H灭活内源性过氧化物酶2O（运行）2在室温下培养5分钟，然后用PBS清洗。将切片浸泡在末端脱氧核苷酸转移酶和生物素化dUTP的TdT缓冲液中，在37°C的潮湿环境中培养90分钟，然后使用PBS清洗切片。在室温下用抗辣根过氧化物酶结合抗体培养30分钟，用二氨基联苯胺对信号进行可视化。在每个编码幻灯片的5-10个场中，对每个高功率场的TUNEL阳性细胞数量进行计数。

统计分析

数据显示为平均值±标准偏差（SD）。使用Student t检验评估两组之间的差异。通过方差分析和Bonferroni多重比较试验评估三个或更多组之间的差异。

结果

碘海醇诱导HK-2细胞中Nox同源物的差异表达

我们检测了碘海醇对培养的HK-2细胞中Nox同源物（Nox1、Nox2、Nox3、Nox4和Nox5）mRNA表达的影响。如所示图2在碘海醇治疗30分钟后，Nox2和Nox4 mRNA表达显著增加(图2A).

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碘海醇诱导HK-2细胞中Nox同源物的差异表达和时间依赖性Nox4表达。

（A）HK-2细胞暴露于碘海醇30分钟。1号,否2,3号,第4个、和氮氧化物5用实时定量PCR检测碘海醇暴露后mRNA水平。(B）将HK-2细胞暴露于碘海醇0分钟、1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时和24小时。为了检查碘海醇暴露后HK-2细胞的长期生存能力，在1或2小时后去除含有碘海醇的培养基，并用新鲜的无血清培养基替换23和22小时（分别为1/23和2/22小时）。第4个(氮氧化物4)用实时定量PCR检测碘海醇暴露后mRNA的表达。用western blotting法测定Nox4蛋白水平。数据为平均值±SD（n=5）*第页<0.05和***第页与对照组相比<0.001。

我们进一步研究了碘海醇对细胞的影响第4个培养HK-2细胞的mRNA和蛋白表达。如所示图2B在碘海醇治疗后第4个通过实时聚合酶链反应（PCR）检测，在5分钟内表达。碘海醇也增加了Nox4蛋白水平，如western blotting所测。碘海醇暴露后，Nox4蛋白表达逐渐增加，2 h后达到峰值，24 h后下降，仍高于对照（未处理）细胞。为了检测碘海醇暴露后HK-2细胞的长期生存能力，在1-2小时后取出含有碘海醇的培养基，并用新鲜无血清培养基替换。第4个在去除碘海醇后23和22h（1/23h和2/22h）测定mRNA和蛋白质水平。第4个mRNA表达降至对照水平，而Nox4蛋白水平在去除碘海醇刺激后23和22小时仍明显升高(图2B).

Nox4参与碘海醇诱导人近端肾小管细胞凋亡

为了确定Nox4在碘海醇诱导的细胞凋亡中的作用，用编号4小干扰RNA（siRNA）或对照siRNA。将HK-2细胞与碘海醇孵育2h后，用新鲜无血清培养基替换含有碘海醇的培养基，并评估caspase 3/7活性。通过转染Nox4沉默第4个在碘海醇暴露后30分钟和去除碘海醇后22小时（2/22小时），siRNA导致caspase 3/7活性显著下降。如caspase 3/7激活所示，用20μg/ml的GKT137831预处理HK-2细胞也能消除碘海醇诱导的凋亡反应(图3A). 此外，通过ATP测定和MTT测定，沉默Nox4可显著提高HK-2细胞对碘海醇的存活率。GKT137831的预处理复制了第4个击倒(图3B).第4个击倒效率如所示S3A–S3C图分别检测caspase 3/7活性、ATPlite试验和MTT试验。

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敲低Nox4和GKT137831处理对碘海醇诱导的HK-2细胞凋亡和细胞死亡的影响。

将HK-2细胞培养至70-80%的汇合处，并添加碘海醇。将细胞与指定浓度的碘海醇孵育30分钟。为了检查碘海醇暴露后HK-2细胞的长期生存能力，在2小时后取出含有碘海醇的培养基，并用新鲜无血清培养基替换22小时（2/22小时）。(A类)通过测定caspase 3/7活性来检测HK-2细胞的凋亡反应。(B类)用ATPlite和MTT法检测HK-2细胞的活性。数据为平均值±标准差（n=5）**第页<0.01与对照组和##第页< 0.01,###第页<0.001，仅与碘海醇治疗相比。

人近端肾小管细胞的超氧化物和活性氧水平

我们测量了有或无碘海醇暴露后HK-2细胞的超氧物生成第4个使用二氢乙硫铵（DHE）染色进行敲除和GKT137831预处理(图4A). 我们还使用Amplex红试验测量了有无过氧化氢生成第4个击倒和GKT137831(图4B). 碘海醇暴露后1小时和2小时，碘海醇的存在导致ROS生成显著增加。值得注意的是，碘海醇诱导活性氧水平的程度在第4个沉默和GKT137831预处理。术后用免疫印迹法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）水平编号4击倒(S3D图). GPx和SOD水平在第4个击倒。

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Nox4对碘海醇诱导ROS生成的影响。

细胞暴露于碘海醇0、1或2小时，有或无第4个击倒和GKT137831。(A类)DHE染色细胞的共焦显微图像。原始放大倍数，×200；标尺，20μm。(B类)H（H）2O（运行）2Nox4的产物，用Amplex红法测定。数据为平均值±SD**第页< 0.01, ***第页与对照组和##第页< 0.01,###第页<0.001，仅与碘海醇治疗相比。

丝裂原活化蛋白激酶介导氧化还原敏感性碘海醇诱导近端肾小管细胞凋亡

为了阐明碘海醇和Nox4介导的细胞凋亡的信号机制，我们分析了氧化还原敏感性MAPK通路（p38、c-Jun N末端激酶[JNK]和细胞外信号调节激酶[ERK]通路）的激活。在碘海醇暴露后5分钟内，以150 mg/ml的浓度将HK-2细胞与碘海醇孵育，导致p38、JNK和ERK的磷酸化增加(图5A和S4图).

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Western blot分析显示碘海醇诱导HK-2细胞凋亡中的细胞内Nox4信号。

将HK-2细胞与碘海醇孵育指定时间（0分钟、5分钟、30分钟、1小时、2小时或3小时）。为了检测碘海醇暴露后HK-2细胞的长期生存能力，在5分钟、0.5小时、1小时、2小时或3小时后取出含有碘海醇的培养基，然后用新鲜无血清培养基替换24小时、23.5小时、23小时、22小时或21小时（5分钟/24小时、0.5小时/23.5小时、1/23小时、2/22小时或3/21小时）。(A类)Nox4对MAPK家族成员（p38、JNK和ERK）、bax、bcl-2和p65磷酸化的影响。(B类和C类)Nox4敲除和GKT137831预处理对碘海醇诱导的细胞凋亡的影响。

为了检测碘海醇暴露后HK-2细胞的长期生存能力，将HK-2细胞与碘海醇孵育5分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时后，用新鲜无血清培养基替换碘海醇培养基，并评估MAPK的磷酸化和活化以及凋亡信号通路。在MAPK中，只有磷酸化p38在去除碘海醇后保持较高水平。去除碘海醇后Bax水平也保持升高(图5A).

为了确定MAPK通路的激活是否依赖于氧化还原和Nox4，我们使用Nox4 siRNA敲除Nox4并发现在碘海醇暴露30分钟后，Nox4敲除降低了碘海醇诱导的p38、JNK和ERK磷酸化。与暴露于碘海醇的对照细胞相比，添加碘海醇后30分钟，Nox4敲低HK-2细胞中的Bax水平也显著降低。为了检测碘海醇暴露后HK-2细胞的长期生存能力，将HK-2细胞与碘海醇孵育2 h后，用新鲜无血清培养基替换碘海醇培养基，并评估MAPK的磷酸化和活化以及凋亡信号通路。与相同条件下的对照细胞相比，在去除碘海醇后22小时，沉默Nox4降低了p38的磷酸化和Bax的表达(图5B). 此外，GKT137831预处理也复制了这些结果(图5C).

我们通过在HK-2细胞中过度表达Nox4进一步证实了Nox4和MAPK之间的关系。通过转染Nox4 cDNA过度表达Nox4可增加p38、JNK和ERK磷酸化(图6A). 值得注意的是，分别用SB203580、SP600125和PD98059抑制p38、JNK和ERK，可降低caspase3/7活性(图6B). 然而，分别用SB203580、SP600125和PD98059抑制p38、JNK和ERK，表明碘海醇暴露后Nox4没有显著降低(图6C).

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HA载体介导的Nox4过度表达对HK-2细胞凋亡的影响。

表达HA载体的病毒用作对照。(A类)HA载体-Nox4对p38、JNK和ERK磷酸化影响的Western blot分析。(B类)通过caspase 3/7活性测定测定p38（SB203580）、JNK（SP600125）和ERK（PD98059）抑制剂对细胞凋亡的影响。(C类)在抑制p38（SB203580）、JNK（SP600125）和ERK（PD98059）后测量Nox4蛋白的水平。数据为平均值±SD（n=5）**第页与对照组和###第页<0.001，仅与碘海醇治疗相比。

GKT137831对CIAKI小鼠肾功能不全和氧化应激的影响

我们评估了碘海醇和Nox4抑制剂GKT137831的作用体内与对照组相比，碘海醇和GKT137831预处理组的BUN水平显著升高(*第页< 0.05). 然而，两组之间的血浆肌酐水平没有差异。对于氧化应激测量，评估血清SOD水平。与碘海醇组相比，GKT137831预处理组的血清SOD水平显著升高(表1).

表1

研究组的肾功能和肾氧化应激参数（平均值±SD）。
组
参数G1（n=8）
控制		G2（n=8）
碘海醇		G3（n=8）
碘海醇+GKT137831
（40毫克/千克）
尿素氮（mg/dL）22.0 ± 1.445.4 ± 24.8*39*± 9.4
铬（mg/dL）0.16 ± 0.060.21 ± 0.0370.22 ± 0.05
SOD活性（μg/ml）90.2±1.789.4±1.396.3 ± 2.3#

数据为平均值±SD（n=8）。

*第页< 0.05

**第页< 0.01

***p<0.001与对照组和

#第页< 0.05

##第页< 0.01

###第页与碘海醇相比<0.001。

缩写：G1，组1；G2，第2组；G3组3；BUN，血尿素氮；Cr，肌酐；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL；超氧化物歧化酶。

GKT137831对碘海醇所致肾组织学改变的影响

我们对注射碘海醇的小鼠进行的组织病理学检查显示，肾小管上皮细胞脱落、基底膜裸露、肾小管内皮细胞空泡变性、蛋白管型形成、肾小管扩张、肾小动脉刷状缘丢失以及部分肾小管表皮细胞坏死。然而，在GKT137831预处理小鼠中，只观察到肾小管上皮细胞变性。光镜检查和半定量分析表明，碘海醇组的肾小管病理评分显著高于对照组动物(**第页< 0.01). 如肾小管病理评分所示，GKT137831预处理显著减弱了这些病变的发展(第页#< 0.05) (图7和S5图).

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苏木精和伊红（H&E）染色肾切片的代表性显微照片，以及腹腔注射碘海醇（无论是否进行GKT137831预处理）后24小时肾小管损伤的半定量评分分析。

经GKT137831治疗，碘海醇引起的明显肾小管损伤减轻。为了半定量分析形态学变化，随机选择每组10只小鼠的外髓质皮层和外柄的10个高倍视野（×200）。放大倍数，×400和×200；比例尺，100μm。

碘海醇暴露后Nox同源物的表达

免疫组织化学（IHC）检测Nox 4和其他Nox（Nox1和Nox2）的表达体内(S6图). 对照组、碘海醇组和GKT预处理组之间Nox4和Nox1的表达无显著差异。碘海醇组中Nox2的表达显著增加，而GKT预处理组中则显著降低。Nox4在细胞核和细胞质中表达，而Nox2在细胞膜中表达。两者主要存在于近端肾小管上皮细胞中。

GKT137831对碘海醇诱导的肾ROS的影响

我们研究了GKT137831是否降低碘海醇诱导的活性氧水平。碘海醇给药后24小时的肾脏切片进行免疫染色，以检测是否存在脱氧鸟苷的氧化衍生物（8-OHdG）。碘海醇组超氧化物8-OHdG阳性肾小管数量与对照组相比显著增加。相比之下，与对照组相比，GKT137831给药明显减少了超氧化物8-OHdG阳性细胞的数量(图8).

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GKT137831对碘海醇诱导肾毒性大鼠氧化应激的改善作用。

对照小鼠或经或未经GKT137831预处理的碘海醇治疗的小鼠腹腔注射碘海醇后24小时肾脏8-OHdG（8-羟基-2'-脱氧酶）免疫染色的代表性显微照片。对染色的程度和强度进行图像分析。数据表示为平均值±SD（n=4-5）**第页与对照组和##第页与仅使用碘海醇治疗相比，<0.01。放大倍数，×200；比例尺，100μm。

GKT137831对碘海醇引起的有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、促凋亡和促生存蛋白变化的影响

从暴露于碘海醇的动物身上切下的小鼠肾脏制备全组织裂解物，并进行蛋白质印迹，结果如S7A和S7B图MAPK和凋亡信号。GKT137831预处理组的磷酸化p38/p38、磷酸化pJNK/pJNK和磷酸化ERK/ERK水平显著降低(S7A图). Iohexol引起促凋亡蛋白Bax水平的显著增加。然而，在碘海醇暴露后，生存前蛋白Bcl-2的水平也降低了。GKT137831显著抑制Bax水平，GKT137031也显著增加Bcl-2水平(S7B图).

GKT137831对碘海醇致肾小管凋亡和坏死的影响

TUNEL免疫染色用于评估肾小管凋亡(图9A). 碘海醇组的肾脏显示TUNEL阳性的肾小管上皮细胞数量显著增加。相反，与碘海醇组相比，GKT137831治疗组的TUNEL阳性细胞数量显著减少。我们还对肾损伤分子-1（KIM-1）进行免疫染色，以检测急性肾小管坏死，从而确定GKT137831对CIAKI小鼠的影响。注射碘海醇后KIM-1阳性细胞数量显著增加，GKT137831治疗逆转了这种情况(图9B).

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GKT137831对碘海醇致肾小管凋亡和坏死的影响TUNEL染色（A）和KIM-1的免疫染色（B）在对照小鼠或碘海醇诱导肾病小鼠中，使用或不使用GKT137831治疗。TUNEL的典型共焦显微照片-（A）和KIM-1-（B）腹腔注射4000 mg/kg碘海醇后24 h，对照组小鼠、碘海醇治疗组小鼠和GKT137831预处理后碘海醇处理组小鼠肾脏切片染色。数据表示为平均值±SD（n=4-5）**第页与对照组和##第页与仅使用碘海醇治疗相比，<0.01。对染色的程度和强度进行图像分析。放大倍数，×200；比例尺，100μm。

讨论

在本研究中，我们发现肾近端小管细胞暴露于CM后，随着ROS的增加，Nox4的表达和活性显著增加。击倒第4个Nox1/4抑制剂GKT137831的转录和预处理可降低肾近端小管细胞的细胞内氧化应激和ROS介导的凋亡。此外，GKT137831预处理可减轻CIAKI动物模型中近端肾小管细胞的损伤。

先前的研究表明，肾脏中Nox4的表达与慢性肾脏疾病的发展和进展有关，尤其是糖尿病肾病伴肾纤维化[11–14]. 然而，其在AKI中的作用尚未得到广泛调查。在本研究中，我们使用实时PCR和western blotting显示，碘海醇暴露后Nox4表达显著增加。最近Netti等据报道，CM暴露后Nox4蛋白表达增加[19]. 然而，Nox4在CIAKI中的病理作用尚未得到彻底检查。我们首次通过磷酸化p38 MAPK途径证明了Nox4作为CM暴露后细胞凋亡的关键介质的作用。

尽管CIAKI的发病机制存在争议，但以往的研究表明，氧化应激和肾小管凋亡在CIAKI发生发展中起着重要作用[4,19–23]. 与之前的研究类似，在本研究中，DHE染色和amplex红试验表明，近端肾小管细胞暴露于CM诱导的氧化应激。在体内，8-OHdG的积累在CM暴露后增加。

一些治疗方案，如N-乙酰半胱氨酸（NAC；活性氧清除剂）、抗坏血酸、生育酚和阿托伐他汀，已被评估为降低活性氧（ROS）水平以预防CIAKI[24–27]. 然而，在许多临床研究中，预防效果并不明确[28–31]. 因此，我们假设直接减少ROS生成可能比抑制下游信号通路更有效地预防ROS相关CIAKI。在之前的一项研究中，在CIAKI大鼠模型中证明了罗布青素的保护作用[32]. 已经证明，载脂蛋白可以防止白细胞、单核细胞和内皮细胞中p47phox向Nox2的移位[33,34]. 然而，Nox4的活性由mRNA表达决定；因此，罗布青素在降低肾脏ROS水平方面的功效可能不够。在本研究中，通过抑制Nox4直接抑制ROS生成，可显著减弱CM-诱导的肾近端小管细胞中ROS和caspase 3/7活性。此外，这些变化导致CIAKI动物模型中凋亡细胞数量减少。

血管紧张素II、胰岛素、肿瘤坏死因子（TNF）α、内质网应激、剪切应激、颈动脉球囊损伤、缺氧和缺血被称为各种细胞类型中Nox4的诱导剂[35]. CM还具有直接的血管收缩作用，并加剧了血管缺血，因为血管收缩激素（如肾素、内毒素和腺苷）增加，而血管扩张激素（如前列腺素和一氧化氮）减少[36]. 这些介质可能参与碘海醇暴露后Nox4的表达。

最近，Nlandu-Khodo等人[37]据报道，Nox4在缺血/再灌注损伤中具有抗凋亡作用。这些发现与将Nox4确定为肾脏疾病介质的观察结果相矛盾。尽管H具有有益的信号作用2O（运行）2在各种细胞中，H浓度过高仍然是事实2O（运行）2诱导炎症、纤维化、凋亡，甚至坏死。因此，Nox4是有害的还是有益的主要取决于其含量[38]. 不同水平的氧化应激对低氧肾损伤的影响不同。

活性氧通过多种机制触发细胞凋亡；在这些机制中，MAPK是被广泛证实的参与细胞凋亡的氧化还原敏感介质[39–42]. 在这项研究中，我们发现p38、JNK和ERK的磷酸化在碘海醇暴露后约1小时高度增加。尽管去除CM后，JNK和ERK的磷酸化水平随着时间的推移逐渐降低，但去除CM后磷酸化p38的水平仍保持在较高水平。因此，我们推测p38可能在CM处理的HK-2细胞的长期细胞死亡/存活中发挥更重要的作用。这一观察结果与其他研究一致，这些研究显示p38在CIAKI中具有类似的促凋亡作用[43,44]. 然而，ROS激活近端肾小管细胞p38的机制尚不清楚。为了响应活性氧生成的增加，p38的激活已被证明直接影响一些促凋亡Bcl-2家族蛋白的磷酸化和活化，如Bim和Bax[39]. 与此相一致，我们发现暴露于CM后Bax水平的增加在Nox4抑制后显著减少。本研究中，通过cDNA转染抑制Nox4过度表达后的ERK可使细胞免于凋亡。p38和JNK信号通路的持续激活已被证明可介导细胞凋亡，而ERK信号通路在细胞增殖、迁移和侵袭中起着关键作用[45]. 相反，ERK的持续激活诱导与死亡相关的基因产物的表达[46]. 本研究中，通过转染Nox4 cDNA在HK-2细胞中过度表达Nox4，可能导致ERK持续激活并增加细胞凋亡。然而，CM暴露后，ERK的磷酸化在1小时时短暂增加，然后逐渐降低，类似于JNK的磷酸化。因此，CM暴露后磷酸化-ERK的细胞内信号作用可能不同于通过转染Nox4 cDNA而诱导的Nox4过度表达。

本研究的另一个有趣之处是CIAKI中Nox2和Nox4之间的相互作用在体外和体内.否2和第4个碘海醇暴露后30分钟，信使核糖核酸水平显著升高在体外虽然碘海醇暴露24小时后Nox4表达降低在体外和体内，24小时内Nox2蛋白水平保持高水平体内GKT137831抑制Nox4后，Nox2蛋白水平显著降低。这些变化与CIAKI的改进同时发生。最近，有报道称Nox4-derived H2O（运行）2通过pSer36-p66Shc激活Nox2促进内皮细胞线粒体活性氧的产生[47]. Nox4/Nox2轴可能参与ROS产生和CKAKI进展的放大。

在GKT137831治疗的动物中，与碘海醇相关的肾小管病变和凋亡随着氧化应激的降低而减少。然而，GKT137831预处理后生化指标（BUN、肌酐和MDA）的改善尚不清楚。各组间肌酐和MDA水平无差异，GKT137831预处理组BUN水平低于碘海醇组，但改善不显著。就这些影响的可能原因而言，首先，8只小鼠的样本量可能不足以检测到生化标记物的差异。第二，与体外实验相比，体内实验因细胞间的相互作用以及肾血流量和肾小管中CM浓度的差异，个体之间的差异很大。第三，除Nox4外，CIAKI通常由多种机制促成。第四，注射碘海醇前，给予40 mg/kg GKT137831 5天。然而，很少有报告调查GTK137831预防AKI；因此，尚不清楚本研究中使用的剂量和持续时间是否足以保护CIAKI患者的肾脏。因此，需要进一步的研究来解决这些问题。尽管存在这些局限性，但据我们所知，这是首次研究Nox4的氧化作用以及Nox4抑制在CIAKI中的保护作用。

总之，根据我们当前实验的结果，我们认为CM上调了Nox4并导致ROS生成增加。增强的活性氧生成触发MAPK的诱导，尤其是p38。Nox4表达的沉默和Nox4活性的药理抑制进一步支持了CIAKI依赖Nox4激活的模型(图10). 这些结果表明，直接靶向Nox4可能有助于预防ROS介导的CIAKI，并可能为降低AKI相关死亡率提供新的潜在策略。

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通过激活HK-2细胞中的Nox4引起的氧化应激增强放射性对比剂诱导的急性肾损伤的模型。

放射性对比剂通过Nox4激活增加氧化应激诱导近端肾小管细胞凋亡。通过基因敲除Nox4或使用GKT137831（特异性Nox1/4抑制剂）治疗抑制Nox4，通过降低MAPK（尤其是p38 MAPK亚家族）磷酸化和Bax水平，减弱放射对比诱导的近端肾小管细胞凋亡。

支持信息

S1图

双Nox1/4抑制剂GKT137831的化学结构。

（畅通节能法）

S2图

Nox4 siRNA的剂量依赖性效应。

细胞通过实时PCR检测Nox4 mRNA水平。通过剂量依赖性实验确定Nox4沉默效率。数据表示为平均值±SD（n=4-5）**第页<0.01和***第页与对照组相比<0.001。

（畅通节能法）

S3图

Nox4击倒效率。

细胞通过实时PCR检测Nox4 mRNA水平。通过研究caspase 3/7活性、ATPlite分析和ROS检测，确认了Nox4的沉默功效(A类,B类和C类). 用western blotting检测Nox4敲除后GPx和SOD蛋白的水平(D类). 数据表示为平均值±SD（n=4-5）***第页与对照组相比<0.001。

（畅通节能法）

S4图

Western blot分析显示碘海醇诱导HK-2细胞凋亡中Nox4的胞内信号传导。

将HK-2细胞与碘海醇孵育指定时间（0、1、2或24小时）。(A类和B类)Nox4敲除和GKT137831预处理对碘海醇诱导的细胞凋亡的影响。

（畅通节能法）

S5图

经GKT137831预处理后，碘海醇引起的肾小管损伤减轻。

对照组、碘海醇组和碘海醇+GKT137831组呈现了周期性酸-希夫染色（PAS）染色肾切片的代表性显微照片。这些数字代表了每组八只老鼠。放大倍数：A到C的x 400；x 200英寸（D至F）；放大倍数，×400和×200；比例尺，100μm。

（畅通节能法）

S6图

在CIAKI小鼠模型中的Nox同源表达。

我们进行免疫组织化学（IHC）检测体内Nox4和其他Noxs（Nox1和Nox2）的表达。对照组、碘海醇组和GKT预处理组大鼠的Nox4和Nox1表达无显著差异。碘海醇大鼠中Nox2的表达显著增加，而GKT预处理大鼠中则显著降低。数据为平均值±SD（n=5）*第页与对照组和###第页<0.001，仅与碘海醇治疗相比。

（畅通节能法）

S7图

Western印迹分析显示GKT-137831对碘海醇诱导的肾病小鼠的MAPKs、促凋亡蛋白和促存活蛋白的影响。

MAPK的蛋白水平（磷酸p38、p38、磷酸JNK、JNK，磷酸-ERK、ERK(A类)、Bax和Bcl-2(B类)对不同组的肾内裂解物进行了检测。数据表示为平均值±SD（n=4-5）*第页与对照组和#第页<0.05，仅与碘海醇治疗相比。

（畅通节能法）

致谢

我们要感谢提供GKT137831的Genkyotex（瑞士Plan-les-Oumeates），以及提供Nox4 cDNA和pcDNA3载体的Yun Soo Bae教授及其实验室成员。

资金筹措表

本研究得到了韩国国立大学明国研究基金（No.2014-5）对SHY的支持，以及韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部资助的韩国国立研究基金会对SHY、NRF-2016的基础科学研究计划的支持，该基金会支持未来基础科学计划的核心领导者/全球博士。裴勇俊奖学金项目。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

工具书类

1Pisani A、Riccio E、Andreucci M、Faga T、Ashour M、Di Nuzzi A等。活性氧在放射性对比剂肾病发病机制中的作用.生物识别Res Int. 2013;2013:86832110.1155/2013/868321. .[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
2Gruberg L、Mintz GS、Mehran R、Gangas G、Lansky AJ、Kent KM等。冠状动脉介入术后48小时内肾功能进一步恶化对既往慢性肾功能不全患者预后的影响.美国心脏病学会杂志. 2000;36(5):1542–8. . [公共医学][谷歌学者]
三。Manske CL、Sprafka JM、Strony JT、Wang Y。氮质血症糖尿病患者冠状动脉造影造影剂肾病.美国医学杂志. 1990;89(5):615–20. . [公共医学][谷歌学者]
4Goldenberg I，Matetzky S。造影剂肾病的发病机制、危险因素及预防策略.CMAJ公司. 2005;172(11):1461–71. 10.1503/cmaj.1040847。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
5Aspelin P、Aubry P、Fransson SG、Strasser R、Willenbrock R、Berg KJ。血管造影高危患者的肾毒性反应.N英格兰J医学. 2003;348(6):491–9. 10.1056/NEJMoa021833。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
6Barrett BJ、Parfrey PS。临床实践。对比剂肾病的预防.N英格兰J医学. 2006;354(4):379–86. 10.1056/NEJMcp050801。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
7纳什·K、哈菲兹·A、侯·S。医院获得性肾功能不全.美国肾脏病杂志. 2002;39(5):930–6. 10.1053/ajkd.2002.32766。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
8Heyman SN、Rosen S、Khamaisi M、Idee JM、Rosenberger C。活性氧与放射性对比剂肾病的发病机制.投资无线电. 2010;45(4):188–95. 10.1097/RLI.0b013e3181d2eed8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
9Yoshioka T、Fogo A、Beckman JK。抗氧化酶活性降低是造影剂在容量减少时引起肾损伤的基础.肾脏Int. 1992;41(4):1008–15. . [公共医学][谷歌学者]
10Sedeek M、Nasrallah R、Touyz RM、Hebert RL。NADPH氧化酶、活性氧与肾脏：朋友与敌人.美国肾脏病学会杂志：JASN. 2013;24(10):1512–8. 10.1681/ASN.2012111112。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
11Jha JC、Gray SP、Barit D、Okabe J、El Osta A、Namikoshi T等人。NADPH氧化酶nox4的基因靶向或药物抑制对长期糖尿病肾病的肾脏保护作用.美国肾脏病学会杂志：JASN. 2014;25(6):1237–54. 10.1681/ASN.2013070810。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
12Al Ghouleh I、Khoo NK、Knaus UG、Griendling KK、Touyz RM、Thannickal VJ等人。心血管和肺部疾病中的氧化酶和过氧化物酶：活性氧类信号的新概念.生物学和医学中的自由基. 2011;51(7):1271–88. 10.1016/j.freeradbiomed.2011.06.011。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
13Gorin Y、Wauquier F。NADPH氧化酶的上游调节器和下游效应器作为糖尿病肾病的新治疗靶点.分子细胞. 2015;38(4):285–96. 10.14348/摩尔.2015.0010。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
14戈林·Y。Nox4作为治疗慢性肾脏疾病相关尿毒症毒性的潜在治疗靶点.肾脏国际. 2013;83(4):541–3. 10.1038/ki.2012.434。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
15Green DE、Murphy TC、Kang BY、Kleinhenz JM、Szyndralewiez C、Page P等。Nox4抑制剂GKT137831减轻缺氧诱导的肺血管细胞增殖.Am J Respir细胞分子生物学. 2012;47(5):718–26. 10.1165/rcmb.2011-0418OC。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
16Kim JA、Neupane GP、Lee ES、Jeong BS、Park BC、Thapa P。NADPH氧化酶抑制剂：专利综述.专家操作疗法. 2011;21(8):1147–58. 10.1517/13543776.2011.584870. . [公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
17Erley CM、Heyne N、Burgert K、Langanke J、Risler T、Osswald H。腺苷拮抗剂对慢性一氧化氮缺乏大鼠造影剂肾病的预防作用.J Am Soc肾病. 1997;8(7):1125–32. . [公共医学][谷歌学者]
18Lee HT、Jan M、Bae SC、Joo JD、Goubaeva FR、Yang J等。A1腺苷受体敲除小鼠体内对急性放射性对比剂肾病具有保护作用.美国生理学杂志肾脏生理学. 2006;290(6)：F1367–75。10.1152/ajprenal.00347.2005。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
19Netti GS、Prattichizzo C、Montemurno E、Simone S、Cafeero C、Rascio F等人。在肾损伤的细胞模型中，暴露于低渗透造影剂与等渗透造影剂可减少NADPH依赖性活性氧的产生.自由基生物医学. 2014;68:35–42. 2016年10月10日/j.freeradbiomed.2013年11月16日。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
20Quintavale C、Brenca M、De Micco F、Fiore D、Romano S和Romano MF等人。对比剂诱导肾细胞凋亡途径的体内外评估.细胞死亡病. 2011;2：e15510.1038/cddis.2011.38。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
21Romano G、Briguori C、Quintavale C、Zanca C、Rivera NV、Colombo A等。造影剂与肾细胞凋亡.欧洲心脏杂志2008年；29(20):2569–76. 10.1093/eurheartj/ehn197。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
22焦Z，陈J，刘Y，刘T，陈K，李G。ERK1/2和JNK磷酸化在碘造影剂诱导糖尿病大鼠肾脏凋亡中的作用.任正非（Ren Fail）. 2015;37(8):1349–55. 10.3109/0886022X.2015.1068031。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
23Lee HC、Sheu SH、Yen HW、Lai WT、Chang JG。JNK/ATF2通路参与碘造影剂诱导的细胞凋亡.Am J Nephrol公司. 2010;31(2):125–33. 10.1159/000259899. . [公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
24Tepel M、van der Giet M、Schwarzfeld C、Laufer U、Liermann D、Zidek W。乙酰半胱氨酸预防造影剂引起的肾功能下降.N英格兰J医学. 2000;343(三):180–4. 10.1056/NEJM200007203430304。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
25Kongkham S、Sriwong S、Tasanarong A。α-生育酚对大鼠对比剂肾病的保护作用.内弗罗吉亚. 2013;33(1):116–23. 10.3265/Nefrologia.pre2012.11736年11月。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
26Rollins K、Noorani A、Janeckova L、Jones T、Griffiths M、Baker MP等。抗坏血酸改善对比剂肾病小鼠模型的肾损伤.BMC肾病. 2017;18(1):10110.1186/s12882-017-0498-5。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
27何X，杨杰，李力，谭H，吴毅，冉P，等。阿托伐他汀通过上调体内外Hsp27的凋亡抑制对比剂诱导的肾病.分子医学代表. 2017;15(4):1963–72. 10.3892/mmr.2017.6251。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
28Wong GT、Irwin MG。造影剂诱导的肾病.英国麻醉杂志. 2007;99(4):474–83. 10.1093/bja/aem237。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
29Stacul F、Adam A、Becker CR、Davidson C、Lameire N、McCullough PA等。降低对比剂肾病风险的策略.美国心脏病杂志. 2006;98(6A级)：59K–77K。2016年10月10日/j.amjcard.2006.01.024。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
30Pannu N、Wiebe N、Tonelli M。对比剂肾病的预防策略.日本汽车制造商协会. 2006;295(23):2765–79. 10.1001/jama.295.23.2765。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
31乙酰半胱氨酸预防冠状动脉和外周血管血管造影患者的肾脏结局：乙酰半胱胱氨酸用于对比剂诱导肾病试验（ACT）的随机试验的主要结果.循环. 2011;124(11):1250–9. 10.1161/循环AHA.111.038943。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
32Ahmad A、Mondello S、Di Paola R、Mazzon E、Esposito E、Catania MA等人。NADPH-氧化酶抑制剂apocynin对糖尿病大鼠对比剂肾病的保护作用：与n-乙酰半胱氨酸的比较.欧洲药理学杂志. 2012;674(2–3):397–406. 2016年10月10日/j.ejphar.2011.10.041。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
33Johnson DK、Schillinger KJ、Kwait DM、Hughes CV、McNamara EJ、Ishmael F等人。邻甲氧基取代邻苯二酚对内皮细胞NADPH氧化酶激活的抑制作用.内皮. 2002;9(三):191–203. . [公共医学][谷歌学者]
34Stolk J、Hiltermann TJ、Dijkman JH、Verhoeven AJ。甲氧基取代邻苯二酚-罗布青素抑制中性粒细胞NADPH氧化酶活性的特性.Am J Respir细胞分子生物学. 1994;11(1)：95–102。10.1165/ajrcmb.11.1.8018341。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
35Chen F、Haigh S、Barman S、Fulton DJ。从形式到功能：Nox4在心血管系统中的作用.前生理学. 2012;三:41210.3389/fphys.2012.00412。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
36刘天清，罗文林，谭X，方Y，陈杰，张华，等。基于5/6肾切除大鼠的新型对比诱导急性肾损伤模型及碘海醇和碘xanol的体内肾毒性评价.氧化介质细胞Longev. 2014;2014:42756010.1155/2014/427560. .[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
37Nlandu-Khodo S、Dissard R、Hasler U、Schafer M、Pircher H、Jansen-Durr P等人。NADPH氧化酶4缺乏增加急性缺血再灌注损伤时肾小管细胞死亡.科学代表. 2016;6:3859810.1038/srep38598。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
38Brandes RP、Takac I、Schroder K。无超氧物-无应激？：Nox4，良好的NADPH氧化酶！ 动脉硬化血栓血管生物. 2011;31(6):1255–7. 10.1161/ATVBAHA.11.226894。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
39闫峰，王毅，吴旭，白沙瓦里亚HM，达斯汀GJ，张明，等。Nox4和氧化还原信号介导TGF-β诱导的内皮细胞凋亡和表型转换.细胞死亡病. 2014;5：e101010.1038/cddis.2013.551。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
40Son Y、Cheong YK、Kim NH、Chung HT、Kang DG、Pae HO。有丝分裂原活化蛋白激酶和活性氧物种：活性氧如何激活MAPK通路？ 信号转导杂志. 2011;2011:79263910.1155/2011/792639. .[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
41Kyriakis JM、Avruch J。应激和炎症激活的哺乳动物有丝分裂原活化蛋白激酶信号转导通路.生理学评论. 2001;81(2):807–69. 10.1152/physrev.2001.81.2807。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
42Andreucci M、Faga T、Russo D、Bertucci B、Tamburini O、Pisani A等人。低渗和等渗放射造影剂对人肾小管细胞信号通路的差异激活.细胞生物学杂志. 2014;115(2):281–9. 10.1002/jcb.24662。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
43龚X、Celsi G、Carlsson K、Norgren S、Chen M。N-乙酰半胱氨酸酰胺通过阻断p38 MAPK和iNOS信号通路保护肾近端小管上皮细胞对抗碘海醇诱导的凋亡.Am J Nephrol公司. 2010;31(2):178–88. 10.1159/000268161. . [公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
44Andreucci M、Lucisano G、Faga T、Bertucci B、Tamburini O、Pisani A等。人肾近端小管细胞中放射性对比剂对参与细胞死亡、存活和炎症的信号通路的差异激活.毒物科学. 2011;119(2):408–16. 10.1093/toxsci/kfq332。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
45Kim EK和Choi EJ。MAPK信号通路在人类疾病中的病理作用.Biochim生物物理学报. 2010;1802(4):396–405. 10.1016/j.bbadis.2009.12.009。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
46Cagnol S，Chambard JC公司。ERK与细胞死亡：ERK诱导细胞死亡、凋亡、自噬和衰老的机制.FEBS J公司。2010;277(1):2–21. 10.1111/j.1742-4658.2009.07366.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
47Kim YM、Kim SJ、Tatsunami R、Yamamura H、Fukai T、Ushio-Fukai M。ROS诱导的ROS释放由Nox4、Nox2和线粒体在VEGF信号和血管生成中协调.美国生理学杂志. 2017;312(6)：C749–C64。10.1152/ajpcell.00346.2016。[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
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