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前摩尔神经科学。2017; 10: 346.
2017年10月30日在线发布。 数字对象标识：10.3389/fnmol.2017.00346
预防性维修识别码：PMC5670157型
PMID：29163025

BDNF/trkB通过钙诱导钙瞬变v（v）2.2运动神经元中的钙通道与β2-链层粘连蛋白上的F-actin组装和生长锥形成相对应（221）

本杰明·多姆伯特,斯蒂芬妮·巴尔克,帕特里克·吕宁施（Patrick Lüningschrör）,梅赫里·莫拉迪,拉杰夫·西瓦达桑,† 莱娜·萨尔·鲍尔恩舒伯特、和西比尔·贾布隆卡*
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关联数据

补充资料

摘要

自然钙2+初级运动神经元的瞬变和肌动蛋白动力学与细胞分化（如轴突伸长和生长锥形成）相对应。脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体trkB支持运动神经元存活和突触分化。然而，在运动神经元中，BDNF/trkB信号对自发钙的影响2+轴突生长锥的内流和肌动蛋白动力学尚未完全阐明。在我们的研究中，我们解决了神经营养因子信号如何与细胞自主兴奋性和生长锥形成相对应的问题。将小鼠胚胎的初级运动神经元培养在突触特异的、含有β2链的层粘连蛋白亚型（221）上，该亚型通过自发钙离子调节轴突伸长2+N型特异性电压门控钙离子的增强聚集所引发的瞬态2+通道（Cav（v）2.2）在轴突生长锥中。TrkB-缺乏(trk英国−/−)不表达全长trkB受体的小鼠运动神经元和未培养BDNF的野生型运动神经元的自发钙降低2+与轴突伸长改变和生长锥形态缺陷相对应的瞬态，伴随着局部肌动蛋白细胞骨架的改变。反之亦然急性应用BDNF导致自发Ca的诱导2+瞬态和Cav（v）2.2运动生长锥中的聚集，以及通过LIM激酶途径和Tyr129处profilin磷酸化促进β-actin稳定的trkB下游信号级联的激活。最后，我们确定了培养在层粘连蛋白221/211上的胚胎运动神经元的轴突生长锥中神经元兴奋性和肌动蛋白动力学的相互调节。兴奋性受损导致轴突伸展和局部肌动蛋白细胞骨架失调，而β-肌动蛋白击倒钙v（v）2.2聚类受到影响。我们从我们的数据中得出结论，在胚胎运动神经元中，BDNF/trkB信号通过改变局部肌动蛋白细胞骨架并伴随钙的增加，促进轴突伸长和生长锥的形成v（v）2.2聚集和局部钙瞬变。这些发现可能有助于探索胚胎运动神经元成熟过程中可能失调导致运动神经元疾病的细胞机制。

关键词：BDNF、trkB、Cav（v）2.2，F-actin，运动轴突，生长锥

介绍

人们普遍认为，神经营养因子信号传导有助于运动神经元存活（Arakawa等人。，1990; Sendtner等人。，1991,1992; Hughes等人。，1993; Henderson等人。，1994; Pennica等人。，1995,1996). 运动神经元的分化强烈依赖于以自发钙为特征的神经元兴奋性2+构成进化保守现象的瞬变（O’Donovan和Landmesser，1987; 顾和斯皮策，1995; 斯皮策等人。，2000; 汉森和兰德梅瑟，2004; 斯皮策，2006; Jablonka等人。，2007; Wang等人。，2009). 这些自发钙2+生长锥的升高是通过电压门控钙通道（VGCCs）的精确定位和积累以及层粘连蛋白等基质蛋白的调节作用来确定的（Nishimune等人。，2004; Jablonka等人。，2007). 层粘连蛋白由三条链组成，即α、β和γ（Patton等人。，1997; Aumailley等人。，2005). 有五种α链和三种γ链亚型（Aumailley等人。，2005). β链表示为β1、β2和β3（Aumailley等人。，2005). 在突触间隙中，包含β2链的亚型占主导地位。缺乏β2-链层粘连蛋白的小鼠在神经肌肉终板中表现出巨大的形态学异常（Noakes等人。，1995). 当层粘连蛋白111或-211的β1-或γ1-链耗尽时，基底膜无法形成（Colognato和Yurcenco，2000)并导致严重的周围神经病变，其特征是淀粉样变和增殖减少（Chen和Strickland，2003; Yang等人。，2005; Yu等人。，2005). 因此，β1-链层粘连蛋白被称为“雪旺细胞特异性”，而β2-链层粘着蛋白被指定为“突触特异性”v（v）)N型和P/Q型钙通道的亚单位（Nishimune等人。，2004). 在胚胎运动神经元中，这种相互作用导致Cav（v）2.2与自发钙增加相对应的累积2+轴突生长锥的内流调节轴突延伸，这在β1-链层粘连蛋白如层粘连素-111上未观察到（Jablonka等人。，2007). 反过来，轴突的生长也依赖于轴突生长锥上有组织的细胞骨架，肌动蛋白丝在这种情况下起着中心作用。一些研究表明，在前脑神经元中，BDNF或NGF等神经营养因子增加了β-肌动蛋白mRNA从细胞体向外围的转运（Zhang等人。，1999,2001; 威利斯等人。，2007). 此外，β-actin mRNA zipcode binding protein 1（ZBP1）的Src依赖性磷酸化可诱导局部翻译，从而导致生长锥转向与细胞Ca相对应的方向2+可用性（Zhang等人。，1999,2001; Hüttelmaier等人。，2005; Yao等人。，2006; Sasaki等人。，2010).

在运动神经元中，尚不清楚这些效应是否对BDNF具有特异性，或者其他生长因子如CNTF和GDNF是否同样重要。据报道，BDNF、CNTF和/或GDNF在分离的鸡、人、大鼠和小鼠初级运动神经元中的应用爪蟾促进生存（Sendtner等人。，1990,1992; 亨德森等人。，1994; Li等人。，1994)上调胆碱能表型（Wong等人。，1993)，刺激胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性（加藤和林赛，1994)并导致定量包中乙酰胆碱释放增加（Liou等人。，1997). BDNF作为神经营养素家族的成员，通过受体酪氨酸激酶的原肌球蛋白相关激酶（trkB）家族发挥作用（Klein等人。，1989,1991; Middlemas等人。，1991; Soppet等人。，1991). GDNF是GDNF配体家族（GFL）的创始成员，与GDNFRα1和2结合，介导c-ret（转染期间重排）酪氨酸激酶的激活（Jing等人。，1996; Treanor等人。，1996). CNTF属于IL-6家族，与与IL-6受体密切相关的CNTFRα结合（Davis等人。，1991). 信号转导由gp130和LIFRβ传递，与CNTFRα一起形成所谓的三重复合物（Taga等人。，1989; Hibi等人。，1990; Gearing等人。，1991; Davis等人。，1993; 斯塔尔和扬科普洛斯，1994).

这些神经营养因子对细胞分化的影响，如轴突伸长和生长锥形成，在胚胎运动神经元中尚未完全解决。β2-链层粘连蛋白等细胞外刺激在多大程度上补充神经营养因子信号，以便通过局部神经元兴奋性和肌动蛋白动力学的变化诱导轴突和生长锥的形成，这一点尚待研究。在本研究中，我们对p75进行了一系列形态和功能比较分析NTR公司-浓缩胚胎trk英国−/−以及培养在携带β2链的层粘连蛋白亚型（即层粘连素221/211）上的BDNF产生的运动神经元，包括对β1链层粘连蛋白质亚型，即层粘着素111的对照实验。我们的数据提供了证据，最显著的是BDNF/trkB信号似乎是必要的，足以通过钙激活和维持运动轴突伸长和生长锥的形成v（v）2.2自然钙积累2+与层粘连蛋白221的β2链协作，在轴突生长锥细胞内流和调节肌动蛋白动力学。

材料和方法

动物

CD-1、C57Bl/6和trk英国+/−（Klein等人。，1993)小鼠被安置在乌尔兹堡大学医院临床神经生物学研究所的中心动物饲养设施中，确保条件可控，即食物和水供应充足，温度为20–22°C，湿度为55–65%，光/暗周期为12:12小时。所有实验均严格按照德国联邦动物保护法规和实验动物护理评估和认证协会的规定进行，并得到当地兽医局（Veterinaeramt der Stadt Wuerzburg）的明确批准和动物实验伦理委员会（Regierung von Unterfranken），Wuerzburgtrk英国+/+,trk英国电信公司+/−和trk英国电信公司−/−用以下引物对小鼠胚胎进行检测：trkB sense-5′TCG CGT AAA GAC GGA ACA TGA TCC 3′；trkB野生型-5′AGA CCA TGA TGA GTG GGT CGC C 3′；trkB敲除-5′GAT GTG GAA TGT GTG CGA GGC C 3′。

初级运动神经元培养

分离E13小鼠胚胎的腰脊髓腹外侧部分，并通过p75富集脊髓运动神经元NTR公司平移（Wiese等人。，1999,2010). 玻璃盖玻片或细胞培养皿分别涂有聚鸟氨酸（Sigma-Aldrich）和层粘连蛋白221/211（Chemicon，Millipore）或层粘连素111（Sigma-Aldrich）。由于制造商的过滤程序，层粘连蛋白-221/211由层粘连素-221和-211组成（见Millipore Chemicon）。层粘连蛋白221携带α2-、β2-和γ1-链，而层粘连蛋白211由α2-、β1-和γ1-链组成。层粘连蛋白-111包含α1-、β1-和γ1-链（Aumailley等人。，2005). 运动神经元培养5或7天在体外37°C，5%大气。5天后在体外分析（DIV5）生长锥，而7天后（DIV7）测定神经突起生长和胞体大小。运动神经元培养基包括神经基础培养基（Gibco）、2%的马血清（热灭活，Linearis）、500μM谷氨酸MAX™-I（Gibco-）和2%的B-27（Gibco/）。第1天更换了介质在体外然后每隔一天。确保细胞存活trk英国+/+和trk英国电信公司−/−运动神经元分别用10 ng/ml BDNF和CNTF培养（Wiese等人。，2007). 为了比较神经营养因子效力，将野生型运动神经元与1 ng/ml BDNF、CNTF或GDNF孵育。为了检测trkB和c-ret的亚细胞分布，向培养基中添加1 ng/ml BDNF、CNTF和GDNF。对于BDNF脉冲实验，细胞与1 ng/ml BDNF和CNTF培养4天在体外运动神经元用神经基础培养液清洗两次。然后，在急性应用10 ng/ml（ICC/IF分析）或20 ng/ml（生化分析）BDNF之前，将含有1 ng/ml CNTF的运动神经元培养基再应用16 h。随后，在室温（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞15分钟，或根据应用的实验设计制备蛋白质裂解物进行蛋白质印迹分析。可选地，在添加BDNF之前，运动神经元与药物抑制剂预孵育30分钟，即0.1μM Src激酶抑制剂混合物1（PP1，Calbiochem）或0.5μM细胞松弛素D（CytD，Sigma-Aldrich）。由于PP1溶解在1%二甲基亚砜中，我们测试了这种有毒物质是否就其本身而言可能会干扰BDNF对钙的观察效果v（v）2.2聚类，但事实并非如此。使用先前发表的用于β-肌动蛋白敲除和再表达的pSIH-H1构建体在接种前直接用慢病毒进行转导（Moradi等人。，2017). 简而言之，将富含p75和浓缩的运动神经元与靶向β-肌动蛋白3′UTR（shActβ）的shRNA寡核苷酸在RT中孵育8分钟。通过GFP表达监测成功的转导。荧光素酶pSIH-H1载体（shLUC）作为参考对照。Actβ救援结构“rescue”包括小鼠Actβ的编码序列和相应的3′UTR的shRNA-resistance版本，后者已克隆到泛素启动子下的表达载体中。切除该泛素-行动β-救援盒，并将其重新克隆到含有shActβ的pSIH-H1结构中。

胚胎运动神经元存活分析

通过在第1天和第7天测定每个分析的盖玻片的三个随机选择的区域的细胞数来评估分离的胚胎小鼠运动神经元的存活率在体外。第1天每个字段的平均单元格数在体外设置为100%。

胚胎运动神经元的免疫荧光染色

培养的运动神经元的免疫细胞化学和荧光（ICC/IF）染色如先前报道的那样进行，并进行了微小的修改（Dombert等人。，2014). 根据实验设计，运动神经元用冰镇丙酮处理2分钟或用0.3%TritonX-100处理20分钟，以使细胞渗透。用于检测trkB和Cav（v）染色过程中使用2.2 0.1%吐温-20。本研究中使用了以下一级和二级抗体：钙v（v）2.2（1:500，N-末端，来自Sigma-Aldrich的兔子（#C1478），来自Synaptic Systems的豚鼠（#152305）），trkB（1:1000，Millipore，#07-225），tau（1:750，Sigma-Aldrich，#T6402），APP（1:300，Acris Antibodies，#AM09000PU-N），Glu-α-微管蛋白（1:1000，Synaptic Systems，#3302011），Tyr-YL1/2微管蛋白（1:2000，Abcam，#ab6160），突触素（1:1000，Synaptic Systems，#101004），β-肌动蛋白（1:500，GeneTex AC-15，#GTX26276），辅酶（1:300，Abcam，#ab54532），磷酸辅酶（Ser3）（1:600，Abcan，#ab47281），磷酸丙酶（Tyr129）（1:300、ECM Biosciences，#PK6930），c-ret（1:200，Neuromics，#GT15002）和磷酸标记（1:500、Y705，Abcam#ab52191），驴抗羊-Cy2（1:200，Jackson Immunoresearch（JI））、驴抗兔-Cy2，驴抗豚鼠Cy2（1:500，JI）、驴抗豚鼠-Cy3和卵磷脂-Acti染色670（1:50，细胞骨架，#PHDN1-A）。盖玻片嵌入mowool（Sigma-Aldrich）中，并用共焦显微镜成像。通过慢病毒基因转移，通过trkB敲除，在培养的运动神经元中验证了从Millipore购买的抗rkB抗体的特异性（图5亿)使用先前发布的靶序列（5′-TTGGGATTCCGGCTTAAA-3′）（Bartkowska等人。，2007; Puehringer等人。，2013).

培养初级运动神经元的FISH

荧光就地杂交（FISH）是根据制造商的说明（GeneDetect，PerkinElmer）和以前的报告（Rossoll等人。，2003; Jablonka等人。，2007). 在37°C下添加针对肌动蛋白mRNA（100 ng/ml）的反义寡核苷酸（5′-GCCGATCACAGGAGACTTACTGCTCAGGAGAGATAT GATCAAT GATCTGAT-3′）和反义寡糖（5′-CGCGCTAGGTGCCCTCT CGTTACAGGACTA-3′）3′-生物素化寡核苷酸16 h。使用酪胺信号放大（TSA）系统（PerkinElmer）和TRITC-streptavidin（Zymed，1:100）进行目视检测，以进行荧光标记。

钙显像

对于Ca2+成像方法：将钙指示剂俄勒冈州绿488 BAPTA-1 AM（OGB，Invitrogen 06807）与8.9 ml 20%Pluronic F-27/DMSO在超声波超声发生器（Bandelin）中混合2分钟。将运动神经元与钙指示剂在37°C和5%CO下孵育13分钟2在含有135 mM NaCl、1 mM MgCl的钙成像缓冲液中稀释1:10002，10 mM HEPES，1 mM CaCl26 mM KCl和5.5 mM葡萄糖。然后，将含有运动神经元的盖玻片转移到充满2 ml钙成像缓冲液的加热室中。记录是在共焦显微镜（BX51 WI，奥林巴斯）、40倍物镜（LUMPlanFI/IR，0.8 W，奥林匹斯）和相机（Rolera-XR，Qimaging）的帮助下制作的，相机产生频率为2.5 Hz、曝光时间为400 ms的延时图像。图像由StreamPix（Norpix）软件实时显示。运动神经元用LED光源（Visitron Systems）连续照射，使用以下滤光片设置：激发（482±35 nm）、二色滤光片（506 nm）和发射滤光片。使用ImageJ插件“强度与时间监视器”和“时间序列分析仪V2.0”进行分析，通过测量特定感兴趣区域（即生长锥）的钙流入量，可以确定活动事件。每个时间段至少有一个尖峰的生长锥被指定为“活动生长锥”。尖峰被定义为至少超过背景噪声两倍并且没有向负值偏转的事件。在瞬态脉冲实验的背景下，在施用BDNF（10 ng/ml）之前和之后直接对胚胎运动神经元的相同轴突生长锥进行分析。用30 nMω-芋螺毒素（CTX，Sigma-Aldrich）治疗显著减少了三个独立实验中生长锥中测量到的活动事件数量，这三个实验验证了这些自发钙瞬变的身份（图第1部分).

图像采集、处理和分析

在本研究中，使用徕卡共焦系统SP2和SP5进行图像采集。采用相同的光电倍增管、激光强度、放大倍数、偏移量和物镜设置进行荧光强度测量。使用徕卡LAS AF LITE软件（徕卡），根据每个像素的量子水平（QL），从原始图像中测量信号强度，作为每个像素的平均灰度值。值分别以每区域或像素的任意单位表示。对每个图像确定并减去背景强度。具有明显周边区域（例如突出物）的生长锥被考虑用于形态学和统计分析。考虑到相应感兴趣区域的大小，通过计算外周生长锥区域与中心生长锥区域的比率来评估生长锥内trkB和c-ret的细胞内分布。使用ImageJ（MacBiophotonics）和Illustrator CS5（Adobe）对所有图像进行最终处理。对于定性呈现，在不影响图像信息的情况下，一致图像的亮度和对比度同样得到了增强。

数据分析和统计

如果没有其他说明，则对每个统计分析至少进行三次独立实验，数据用散点图表示，显示平均值±标准误差（SEM）。统计评估的生物和技术复制品数量用“n”表示。反过来，每个统计数字来自一个分析组的中位数，例如，每个技术/生物复制品测量16个生长锥。因此，“N”表示记分标本的总数，例如运动神经元躯体、生长锥、轴突或肌动蛋白运动。对于统计分析，“n”或“n”被视为文本和提供的统计文件中所述。两组数据通过未配对的方式相互比较t吨-检验或Mann-Whitney U检验，如果值不是正态分布，则采用后者。如果分析了两个以上的组，则应用单向方差分析，然后使用Tukey的事后检验或Kruskal-Wallis的事后Dunn的多重比较检验进行分析，当数值不显示高斯分布时，再次使用后者。使用GraphPad Prism 6进行统计分析。统计显著性定义为对< 0.05. 每个p值都在相应的图中描述。当一致的对照组的值彼此可比较时，将来自不同实验的数据汇集在一起。对照样品的信号强度标准化为“1”。western blot中的密度测定强度根据相应的对照蛋白进行标准化。只考虑一个轴突的运动神经元进行分析。只测量了最长的轴突分支的轴突长度，分析中不考虑轴突侧支。只有当指定的轴突长度至少是相应树突的三倍时，才能对运动神经元进行评分，以确保轴突和树突之间的明确区分。补充材料中以单独的pdf文件形式提供了一份包含所获得统计数据的详细数据的列表。

蛋白质印迹分析

用PBS清洗一次初级运动神经元，用2 x Laemmli缓冲液（125 mM Tris，pH 6.8，4%SDS，10%β-巯基乙醇，20%甘油和0.004%溴酚蓝）溶解，在99°C下煮沸5 min并超声。将裂解液进行SDS-PAGE，在硝化纤维素膜上进行印迹，并在室温下用5%奶粉在TBST中封闭1h。随后，将斑点与初级抗体孵育过夜。第二天，在室温下用适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体将印迹培养1h，并使用增强化学发光在X射线胶片（富士超级RX）上检测信号。使用ImageJ（美国国立卫生研究院）对X射线胶片进行扫描并通过密度分析进行量化。使用了以下主要抗体：抗LIM激酶（Acris#TA503012）、抗磷酸LIM蛋白激酶（Cell Signaling#3841）、抗磷脂酰胆碱（Abcam#AB12866）、抗磷酸盐-AKT（Cell信号传导，#9275）、抗AKT（Cell-Signaling#9272）、抗MAPK（Cell Signaling#4696，clone L34F12）、抗磷-MAPK（Cell-Signaling#E10，clone E10）、，pTrk（Y704/705代表pTrkB）（细胞信号#4621）、trkB（Millipore#07-225）、Calnexin（酶，ADI-SPA-860）、β-actin（GeneTex#GTX26276，克隆AC-15）。

G-至F-肌动蛋白分离和蛋白质印迹

如最近所述，进行了G-到F-肌动蛋白的分离（Sivadasan等人。，2016; Moradi等人。，2017). 在使用肌动蛋白稳定缓冲液进行细胞裂解之前，用温热的PBS将非脉冲和BDNF脉冲初级运动神经元洗涤两次，该缓冲液由0.1 M管道、pH 6.9、30%甘油（体积/体积）、5%二甲基亚砜（体积/容积）、1 mM MgSO组成41 mM EGTA、1%Triton X-100（vol/vol）、1 mM ATP、完整蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。将裂解液在37°C下保存10分钟。将细胞提取物在100 000 g下在37°C下超速离心75分钟。回收含有G-actin的上清液，而含有F-actin的颗粒用RIPA缓冲液（50 mM Tris pH 8.0、1%NP40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、150 mM NaCl、2 mM EDTA和50 mM NaF）再次悬浮。使用BCA蛋白检测试剂盒（Pierce BCA蛋白分析试剂盒）测定的等量蛋白质，使用以下一级和二级抗体进行后续的western blot分析：小鼠单克隆抗Actβ（1:4000，GeneTex）、山羊多克隆抗calnexin（1:5000，Acris）、，驴抗鼠IgG（1:10000，Jackson ImmunoResearch），驴抗羊IgG。

活细胞成像

如前所述，为了测量肌动蛋白动力学，使用了GFP标记的细胞质肌动蛋白构建物，该构建物包含肌动蛋白结构（Fischer等人。，1998; Sivadasan等人。，2016). 将转导的运动神经元培养在层粘连蛋白221/211包被的35-mmμ-培养皿（Ibidi）上4天在体外含1 ng/ml BDNF和CNTF，密度为15000个细胞。用温热的苯酚无红神经基底培养基洗涤细胞三次，去除BDNF，并用含有1 ng/ml CNTF的苯酚无红色培养基进一步培养运动神经元16 h。在第5天，使用配备60 x平面Apochro NA 1.4浸没物镜的Eclipse TE2000显微镜（尼康）和37°C和5%CO的加热台室（TOKAI HIT CO.，LTD），在BDNF脉冲（10 ng/ml）前后对相同的生长锥进行活细胞成像2GFP由470 nm冷LED PE-100光源以2–4%的发光强度激发。发射通过493/574 nm双频分束器进行过滤，并使用Orca Flash 4.0 V2相机（12位，1024×1024，滨松光电）进行记录。通过每隔15秒进行20分钟的延时成像，评估来自相应中心点的轴突生长锥的肌动蛋白动力学。为了确定生长锥的中心点，产生了所有81个框架的最大投影，中心点位于轴突轴到远端突出物的一半。然后将选定的中心点恢复到延时电影中，并使用ImageJ Kymograph插件从所有81帧中生成并分析多个Kymogram。x轴提供有关时间（以秒为单位）的信息，y轴提供有关距离（以微米为单位）。因此，轴突末端肌动蛋白运动的速度计算为δ长度（μm）除以通过从x轴和y轴测量每个拾取的长度得出的每个拾取（15 s）的时间（秒）。在对BDNF脉冲的轴突生长锥成像后，运动神经元再次用无酚红神经基底培养基清洗三次，并用含有1 ng/ml CNTF的无酚红运动神经元培养基再培养24小时。第6天重复相同的程序，结果具有可比性和可重复性。利用第5天和第6天大鼠运动神经元的肌动蛋白运动数据进行统计分析。

结果

缺陷钙v（v）2.2局部自发钙的聚集和减少频率2+轴突生长锥的瞬变trk英国电信公司−/−层粘连蛋白221培养的运动神经元

为了研究受损的BDNF/trkB信号是否影响轴突伸长和生长锥的形成，我们开始培养胚胎trk英国电信公司−/−突触特异性层粘连蛋白221/211上的运动神经元持续5天（图​（图1）。1). 野生型运动神经元的轴突生长锥内trkB受体和Cav（v）2.2钙通道紧密聚集，尤其是在轴突尖端（图​（图1A，1安培，图S1B级).TrkBTK公司−/−运动神经元发育成钙缺乏的生长锥v（v）2.2通过显著减少的Ca确定的相应突起处的积累v（v）2.2免疫反应性（图​（图1B）。1B年). Tau蛋白水平没有改变（图​（图1B）。1B年). 此外，钙似乎没有差异v（v）2.2控制和trk英国电信公司−/−运动神经元在层粘连蛋白111上培养时（图S1C系列). 事实上，钙的富集v（v）2.2在层粘连蛋白221/211培养的对照运动神经元的轴突生长锥中观察到免疫荧光，并与层粘连素111进行比较（图S1C系列). 这种变化在trk英国克朗−/−生长锥（图S1C系列). 层粘连蛋白221/211的结构表型伴随着局部钙信号的功能异常（图​（图1C）。1个). 对照组和trkB突变体运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天，用俄勒冈州绿染料进行染色，并在200 s的时间内进行钙成像2+生长锥处的瞬变被确定为显著的尖峰（图​（图1C，1个，右侧面板）。在生长锥中trk英国电信公司−/−运动神经元自发钙瞬变的频率显著降低（图​（图1C，1个，左面板）强调了trkB信号受损时局部钙信号的结构和功能缺陷。

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钙的减少v（v）2.2累积和自发钙2+生长锥的瞬变trk英国电信公司−/−运动神经元对应于层粘连蛋白221上轴突生长的改变。（A）在层粘连蛋白221/211上培养5天的野生型运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外在BDNF和CNTF在场的情况下。TrkB受体（绿色）和钙v（v）2.2钙通道（洋红色）紧密定位于生长锥突起，以白色箭头突出显示（比例尺：5μm）。（B）在trk英国−/−生长锥Cav（v）2.2积累（品红色）在生长锥顶端受到影响，而tau水平（绿色）没有改变（比例尺：5μm）。钙的统计分析v（v）2.2免疫反应性trk英国−/−轴突生长锥（0.54±0.1，Q20.47,n个= 4,N个=66）与野生型对照（1.00±0.04，Q21.01,n个= 6,N个=78）显示出显著差异(对= 0.0015). 通过将Ca归一化，也得到了类似的结果v（v）2.2针对内部参考蛋白tau(trk英国克朗+/+1.00±0.08，Q20.95;trk英国−/−0.65±0.06，Q20.67;对=0.0118）（C）结构表型伴随着对照组和对照组之间自发钙瞬变频率的显著差异trk英国克朗−/−生长锥（对照0.92±0.13，Q20.60,N个= 72;trk英国−/−0.55±0.09，Q20.30,N个= 64;对= 0.0337). 控制的代表性记录（上轨迹、蓝色箭头）和trk英国电信公司−/−当trkB信号受损时，生长锥显示钙尖峰数量减少。（D）野生型和trk英国电信公司−/−运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养7天在体外在BDNF和CNTF的存在下，并对τ进行染色（比例尺：150μm）。TrkB突变细胞（316.4±12.65μm，Q2314.5微米，n个= 7,N个=298）比对照组轴突长（262.9±11.79μm，Q2278.8微米，n个＝7，N个= 283,对= 0.0093)（E）用30 nMω-芋螺毒素（CTX）处理后，野生型运动神经元的轴突伸长增加，但在trk英国−/−细胞。

我们从以前的研究中知道，轴突延伸是由钙的直接结合介导的v（v）当运动神经元培养在突触特异性层粘连蛋白221上时，具有层粘连素β2链的亚单位（Nishimune等人。，2004; Jablonka等人。，2007). 这个Cav（v）2.2-β2-链相互作用导致Cav（v）2.2积累和自发Ca2+内流反映生长锥中的分化信号，抑制轴突生长（Porter等人。，1995; Jablonka等人。，2007). 自Ca以来v（v）2.2当trkB/BDNF信号受损时，聚集和局部钙信号出现受损。我们在下一步研究轴突生长是否在trk英国克朗−/−运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养7天后（图​（图1D）。一维). 与野生型对照相比，trk英国电信公司−/−运动神经元长出较长的轴突，表明对层粘连蛋白β2链和钙的结合所提供的上述“生长停滞”信号的识别受损v（v）2.2轴突生长锥的钙通道（图​（图1D）。一维). 体细胞大小、一级树突数量、平均树突长度和树突总长度未受影响，强调了主要的轴突表型（图S2A公司). 特殊钙处理v（v）2.2通道阻滞剂ω-芋螺毒素（30 nM）直到DIV7（Jablonka等人。，2007)导致野生型轴突伸长增加，但在trk英国−/−运动神经元（图​（图1E）。1E级). 此外，在5天的培养期内，这种CTX浓度能够显著降低测得的自发Ca2+在层粘连蛋白221/211上培养的运动神经元的生长锥中的瞬变（图第1部分).

BDNF增强Cav（v）2.2层粘连蛋白-221上胚胎运动神经元生长锥的聚集和局部钙瞬变

观察到的胚胎兴奋性表型trk英国−/−运动神经元提出了BDNF是否有必要调节Ca的问题v（v）2.2轴突生长锥内的聚集和钙内流调节层粘连蛋白221/211上轴突的生长。为此，我们用层粘连蛋白221/211在BDNF、CNTF或GDNF存在下培养野生型运动神经元5天（图​（图2）。2). CNTF和GDNF处理的运动神经元发育成生长锥，Ca显著降低v（v）2.2与BDNF处理的细胞相比的免疫反应性，特别是在突起处（图​（图2A）。2安培). 将跨膜蛋白APP（淀粉样前体蛋白）用作参考对照（图​（图2A）。2安培). 钙的这些缺陷v（v）2.2在缺乏BDNF的情况下，局部自发钙瞬变的频率显著降低，反映了聚集性（图​（图2B）。2B型). 有趣的是，CNTF和GDNF在钙方面的细微差异v（v）2.2在确定的钙峰值频率中也发现了累积的表达（图​（图2B）。2B型). 在下一步中，我们将野生型运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养7天，在相同的实验条件下测定轴突的生长（图​（图2C）。2厘米). 只有在BDNF存在的情况下，运动神经元才能识别由β2-链层粘连蛋白提供的分化信号，与CNTF和GDNF处理的运动神经元相比，轴突生长速度最低（图​（图2C，2厘米，右侧面板）。每种神经营养因子之间的体细胞大小、树突复杂度和细胞存活率是可比较的，验证了它们的生物活性，并强调了主要的轴突表型（图S2B型–D类).

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BDNF对Ca是必需的v（v）2.2累积和局部Ca2+层粘连蛋白221上运动轴突生长锥的瞬态。（A）野生型运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天的轴突生长锥图像在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，对跨膜蛋白APP（绿色）和Ca进行染色v（v）2.2（品红色）（比例尺：5μm）。含CNTF或GDNF-Cav（v）与BDNF相比，2.2信号显著减少（BDNF 1.00±0.11，Q21.00,n个= 5,N个= 130; CNTF 0.65±0.05，Q20.65,n个= 6,N个= 133; GDNF 0.47±0.04，Q20.47,n个= 6,N个= 145; p（B-C）=0.0081，p（B-G）=0.0002），尤其是在轴突末端突起处，而APP免疫反应没有降低。通过对Ca进行归一化处理，获得了类似的结果v（v）2.2针对内部参考蛋白APP的强度。（B）与BDNF处理的运动神经元相比，CNTF和GDNF处理细胞显示自发Ca的频率降低2+相应生长锥的瞬态（BDNF 0.89±0.11，Q20.6,N个=75；CNTF 0.69±0.13，Q20.3,N个= 77; GDNF 0.50±0.08，Q20.3,N个= 73; p（B-C）=0.0306，p（B-G）=0.0078）。（右面板）与BDNF（蓝色）、CNTF（洋红色）或GDNF（绿色）培养的运动神经元轴突生长锥的代表性记录，显示钙尖峰。（C）运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养7天在体外在BDNF、CNTF或GDNF存在下，并针对tau染色（比例尺：150μm）。两种CNTF-（466.6±35.41μm，Q2465.6微米，n个= 6,N个=263）和GDNF处理（454.8±19.28μm，Q2440.9微米，n个= 6,N个与BDNF处理的细胞（356±22.16μm，Q2342微米，n个= 6,N个= 275).

瞬态BDNF脉冲足以增强Cav（v）2.2层粘连蛋白221培养的胚胎运动神经元生长锥的聚集和钙内流

迄今为止报告的所有数据都假设BDNF/trkB信号是培养在层粘连蛋白221/211上的胚胎小鼠运动神经元的轴突和生长锥细胞过程中轴突延伸和神经元兴奋性的核心。这些发现是通过将BDNF长期暴露于胚胎运动神经元5或7天而获得的在体外在下一步中，我们想研究BDNF的单次应用是否足以诱导上述结果，并讨论了BDNF在轴突生长锥中的作用。因此，我们在BDNF和CNTF存在下，在层粘连蛋白221/211上培养野生型运动神经元4天（图​（图3）。三). 然后，从培养基中去除BDNF，仅用CNTF将细胞培养16 h。最后，在固定前用BDNF刺激运动神经元5分钟。BDNF应用后Cav（v）2.2免疫反应性显著增强，尤其是在突起处，这与钙的增强相对应v（v）2.2聚类（图​（图3A）。3A级). 值得注意的是，在显示BDNF诱导Ca的染色过程中，当运动神经元用丙酮处理时，未检测到这种变化v（v）2.2由于丙酮溶解了大部分磷脂成分，因此聚集和表面表达（图S3A系列). 此外，这些观察伴随着自发钙瞬变频率的增加（图​（图3B）。3B公司). 在这个特定的实验中，同样的轴突生长锥在BDNF应用前和应用后2分钟被成像（图​（图3B，3B公司，右侧面板）。钙尖峰的总数增加了一倍，活性生长锥的百分比几乎增加了四倍（图​（图3B，3B公司，右侧面板）。根据这些结果trk英国−/−与对照组相比，急性BDNF治疗的生长锥明显减弱（图​（图3C）。3C公司). 在trkB突变体生长锥中，Ca含量没有差异v（v）两种条件之间的信号均为2.2，而野生型对照显示Ca增强v（v）2.2 BDNF脉冲聚集（图​（图3C）。3C公司). 参考蛋白突触素似乎不受基因型或BDNF刺激的调节（图​（图3C）。3C公司). 总之，这些数据支持以下工作假设：在胚胎小鼠运动神经元的轴突生长锥中，BDNF/trkB信号主要参与层粘连蛋白β2链介导的神经元兴奋性和轴突生长。

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BDNF信号足以诱导Cav（v）2.2聚类和局部Ca2+层粘连蛋白-221上胚胎运动神经元生长锥突起处的瞬变。（A）层粘连蛋白221/211对Ca染色的非脉冲和BDNF脉冲轴突生长锥的代表性图像v（v）2.2（洋红色）和APP（绿色）（比例尺：5μm）。BDNF脉冲Cav（v）2.2个通道聚集在生长锥尖端，如白色箭头所示。在非脉冲条件下钙的潜在积累v（v）如白色圆圈所示，在中央生长锥区域检测到2.2个通道。钙v（v）2.2水平显示BDNF脉冲显著增加（无脉冲1.00±0.04，Q21.00,n个= 9,N个= 221; 5′BDNF 1.93±0.24，Q21.75,n个= 9,N个= 245;对= 0.0014). 钙的比率v（v）2.2和APP免疫反应结果相似。（B）BDNF治疗后的这些结构变化与自发钙离子频率显著增加相匹配2+与非脉冲控制相比的瞬态（无脉冲0.16±0.08，Q20、IQR 0，N个= 32; 5′BDNF 0.30±0.08，Q20，IQR 2，N个= 32;对= 0.0104). （右面板）在BDNF脉冲之前和之后2分钟，对相同的生长锥进行成像。非脉冲和BDNF脉冲迹线的代表性记录显示Ca的数量增加2+响应BDNF的尖刺（洋红色箭头）。在BDNF后，钙尖峰的总数几乎翻了一番，并且每次记录至少显示一个尖峰的活性生长锥的百分比大大增加。（C）非脉冲和BDNF脉冲的代表性图像trk英国+/+和trk英国电信公司−/−钙染色生长锥v（v）2.2（品红色）和突触素（绿色）（标尺：5μm）。在野生型细胞中，BDNF的急性应用导致Ca增加v（v）2.2生长锥突起处的免疫反应（以白色箭头表示）。此效果在中不可见trk英国电信公司−/−轴突生长锥，其中Cav（v）2.2免疫反应主要发生在中央生长锥区，如白色圆圈所示。突触体素作为内部参考蛋白在每种情况下都具有可比性。（右面板）统计显著性由BDNF脉冲与非脉冲生长锥的比率决定trk英国+/+和trk英国−/−运动神经元与钙的关系v（v）仅2.2(trk英国+/+1.00±0.06，Q21.00,n个=7，N（无脉冲）=88，N（5′BDNF）=102；trk英国−/−0.75±0.07，Q20.79,n个=7，N（无脉冲）=100，N（5′BDNF）=106；对=0.0184）和Cav（v）2.2根据突触素标准化的信号强度强调了trk英国电信公司−/−生长锥对急性BDNF应用的反应。

自发钙的相互依赖性2+胚胎运动神经元生长锥的瞬变和局部肌动蛋白细胞骨架

钙v（v）2.2聚集和局部钙信号依赖于培养在层粘连蛋白221/211上的胚胎运动神经元轴突生长锥中的BDNF/trkB信号。有证据表明钙和肌动蛋白相互作用，形成调节反馈回路（Robinson等人。，2010; Saneyoshi和Hayashi，2012). 因此，我们想研究自发钙2+钙介导的内流v（v）2.2调节胚胎运动神经元生长锥中的肌动蛋白反之亦然肌动蛋白细胞骨架的调控如何影响钙v（v）2.2累积（图​（图4）。4). 胚胎运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天，用ω-芋螺毒素（30 nM）处理，并用β-肌动蛋白染色（图​（图4A），4A级)，是胚胎运动神经元轴突生长锥中最重要的肌动蛋白亚型，调节生长锥的大小和形态（Moradi等人。，2017). CTX治疗显著减小了轴突生长锥的大小（图​（图4A）。4A级). 此外，这些结构中的β-肌动蛋白免疫反应性受到影响，而tau水平似乎相当（图​（图4A）。4A级). 反过来，慢病毒shRNA在层粘连蛋白221/211培养5天的胚胎运动神经元中对β-肌动蛋白的敲除在体外导致较小的生长锥和β-肌动蛋白信号强度的耗竭（图​（图4B）。4B类). 这些发现是由β-肌动蛋白的丢失引起的，因为肌动蛋白亚型的重新表达能够挽救获得的表型（图​（图4B）。4B类). Tau水平没有改变，突出了肌动蛋白细胞骨架的具体操作（图​（图4B）。4B类). 有趣的是，β-肌动蛋白的敲除也损害了局部钙v（v）2.2在这些细胞中聚集，而突触素免疫反应在每种情况下都相似（图​（图4C）。4摄氏度). 再次，β-肌动蛋白的重新表达足以挽救观察到的缺陷（图​（图4C）4摄氏度)强调肌动蛋白对钙积累的贡献v（v）2.2在层粘连蛋白221/211培养的运动神经元轴突生长锥中。

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层粘连蛋白-221对胚胎运动神经元轴突生长锥中神经元兴奋性和β-肌动蛋白存在的相互调节。（A）在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元生长锥的代表性图像在体外使用或不使用30 nM CTX，并对β-肌动蛋白（绿色）和τ（洋红色）进行染色（比例尺：5μm）。CTX处理的运动神经元发育出较小的生长锥（对照组26.14±1.13μm2、Q225.4微米2,n个= 13,N个= 226; 30 nM CTX 19.51±1.17μm2、Q219.96微米2,n个= 17,N个= 274;对=0.0005）具有β-肌动蛋白缺陷（对照组1.00±0.05，Q21.00; 30 nM CTX 0.71±0.07，Q20.68;对= 0.0037). Tau水平在这两种情况下具有可比性。（B）β-肌动蛋白缺失和对照运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天的轴突生长锥的典型图像在体外β-actin（洋红色）和tau（黄色）染色（比例尺：5μm）。通过GFP表达（绿色）选择细胞，表明慢病毒转导成功。与shLUC转导的对照运动神经元相比，β-actin shRNA-转导的细胞显示出明显更小的生长锥（shLUC 22.02±1.68μm2、Q216.89微米2，像质计13.07μm2,N个= 76; shActβ14.85±1.18μm2、Q211.70微米2，IQR 11.45μm2,N个=74）和高度降低的β-肌动蛋白信号（shLUC 1.00±0.09，Q20.90，IQR 0.92；shActβ0.38±0.05，Q20.27，IQR 0.53）。以τ为代表的微管细胞骨架似乎没有受到影响。β-actin的再表达（“拯救”）能够拯救生长锥的大小（23.54±2.44μm2、Q217.09微米2，IQR 13.15μm2,N个=62）和β-肌动蛋白免疫反应（0.98±0.09，Q20.96，IQR 0.82）验证获得的基于β-肌动蛋白的生长锥表型。（C）钙染色层粘连蛋白221/211上β-肌动蛋白缺失生长锥的代表性图像v（v）2.2（品红色）和突触素（黄色）（标尺：5μm）。β-肌动蛋白的敲除导致钙的减少v（v）2.2信号（shLUC 1.00±0.09，Q20.84，IQR 0.75，N个= 54; shActβ0.70±0.06，Q20.52，IQR 0.46，N个=63），而突触素水平没有改变。β-肌动蛋白重测能够挽救检测到的表型（rescue 1.04±0.07，Q21.05，IQR 0.90，N个= 64).

为了进一步加强我们关于运动神经元轴突生长锥内肌动蛋白和钙相互调节的工作假设，我们对BDNF介导的钙离子效应进行了药理学调控v（v）2.2分别用Src激酶抑制剂混合物PP1或细胞松弛素D（CytD）处理的聚类（图S3C、D). 霉毒素细胞松弛素D解聚海马神经元中的肌动蛋白在体外（布拉克和多蒂，1999)据报道Cav（v）2.2钙通道位于对CytD敏感的脂筏相关微域内（Robinson等人。，2010). 其他研究表明，神经营养因子信号不对称地激活Src激酶，进而促进肌动蛋白mRNA移位、局部翻译和钙2+-依赖生长锥成形（Hüttelmaer等人。，2005; Yao等人。，2006; Sasaki等人。，2010). 此外，Src激酶似乎在Tyr129磷酸化profilin，促进肌动蛋白聚合和Wnt/Ca2+信令（Fan等人。，2012; Frantzi等人。，2016). 与这些观察结果一致，BDNF不能增加Cav（v）2.2当在BDNF刺激前用PP1或CytD处理这些细胞30分钟时，胚胎运动神经元生长锥中的免疫反应性（图S3D系列). 总之，我们提供了实验证据，证明Cav（v）2.2和β-actin信号级联在层粘连蛋白221培养的运动神经元生长锥中相互作用。

轴索生长锥中的肌动蛋白细胞骨架缺陷trk英国−/−和培养在层粘连蛋白221上的BDNF衍生的胚胎运动神经元

到目前为止，我们已经证明了Cav（v）2.2钙的积累和自发钙2+当BDNF/trkB信号受损时，层粘连蛋白221会干扰通过VGCC的流入。此外，似乎局部Ca2+海拔升高对胚胎运动神经元轴突生长锥的局部肌动蛋白细胞骨架有影响。反过来，肌动蛋白似乎有助于钙的定位v（v）2.2钙通道，层粘连蛋白β2链诱导生长锥形成过程的先决条件。因此，我们想研究生长锥中的肌动蛋白细胞骨架trk英国电信公司−/−胚胎运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天，这是钙缺陷的时间点v（v）2.2积累和钙2+信号是可检测的（图​（图5A）。5A级).TrkBTK公司−/−与野生型对照组相比，运动神经元发育出的生长锥明显更小（图​（图5A）。5A级). 这一发现伴随着β-肌动蛋白和F-肌动蛋白强度的显著降低，而微管稳定tau蛋白似乎没有受到影响（图​（图5A）。5A级). 由于BDNF对层粘连蛋白221/211的轴突生长有强烈影响（图​（图2C）2厘米)我们还检测了BDNF、CNTF或GDNF存在下野生型运动神经元生长锥中的肌动蛋白细胞骨架（图​（图5B）。5亿). 与BDNF处理的运动神经元相比，CNTF-和GDNF处理的细胞发育出明显更小的生长锥，其中F-肌动蛋白缺乏，但tau蛋白水平没有（图​（图5B）。5亿). 在GDNF的情况下，β-肌动蛋白免疫反应也显著降低（图​（图5B）。5亿). BDNF/trkB信号对突触前室的影响，特别是对肌动蛋白细胞骨架的影响，提出了这样一个问题：该信号通路是否也可能控制肌动蛋白mRNA向这些特定位点的募集和移位。因此，我们进行了荧光就地用3′生物素化寡核苷酸与肌动蛋白mRNA的高度保守编码区杂交（Rossoll等人。，2003; Jablonka等人。，2007; 数字S4A–C系列). 通过BDNF脉冲，我们观察到与非脉冲对照组相比，在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元的生长锥中肌动蛋白mRNA信号强度增加（图S4A系列)这与之前的报告（Willis等人。，2007; Sasaki等人。，2010). 此外，我们检测到肌动蛋白mRNA免疫反应性在trk英国电信公司−/−生长锥（图S4B系列)以及仅与CNTF或GDNF培养的运动神经元的轴突生长锥（图S4C系列). 神经发育过程中轴突的延伸、轴突的引导和生长锥的形成需要肌动蛋白和微管的协同作用。为了进一步验证trk英国电信公司−/−我们测试了额外的微管标记物，即谷氨酰化和酪氨酸化微管蛋白，发现每个基因型和条件之间没有明显差异（图S4D、E). 尽管BDNF和GDNF都激活酪氨酸激酶，即trkB和c-ret，但似乎只有BDNF维持Cav（v）2.2生长锥中的聚集和F-actin组装。因此，我们想研究trkB和c-ret的细胞内分布是否彼此不同，尤其是在突触前结构中（图S1D系列).事实上trkB在突起处富集，而c-ret信号在相当中央的生长锥区最高（图S1D系列).

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生长锥细胞肌动蛋白细胞骨架缺陷trk英国−/−层粘连蛋白221上的BDNF衍生的胚胎运动神经元。（A）生长锥的代表性图像trk英国电信公司+/+和trk英国−/−运动神经元在层粘连蛋白221/211上培养5天在体外并对tau（洋红色）和β-actin或F-actin（绿色）进行染色（比例尺：5μm）。TrkBTK公司−/−运动神经元发育出明显较小的生长锥(trk英国电信公司+/+34.23±2.77微米2、Q229.45微米2,n个= 20,N个=308；trk英国−/−21.22±1.41微米2、Q222.81微米2,n个= 19,N个= 341;对=0.0002）与β-肌动蛋白(trk英国+/+1.00±0.10，Q21.00,n个＝8，N个= 154;trk英国−/−0.55±0.12，Q20.45,n个＝8，N个= 167;对=0.0140）和F-actin(trk英国+/+1.00±0.04，Q20.99，IQR 0.15，n个= 19,N个= 254;trk英国−/−0.76±0.11，Q20.64，IQR 0.44，n个= 18,N个= 298;对=0.0005）与野生型对照组相比的缺陷。Tau水平在两种基因型之间具有可比性。（B）在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，对β-肌动蛋白（绿色）、F-肌动蛋白和τ（蓝色）进行染色（比例尺：5μm）。CNTF和GDNF处理的运动神经元的生长锥的大小显著减小（BDNF 31.59±1.75μm2、Q231.05微米2,n个= 18,N个= 385; CNTF 23.01±2.12微米2、Q220.73微米2,n个＝17，N个= 425; GDNF 21.79±1.69微米2、Q218.27微米2,n个= 17,N个= 435; p（B-C）=0.0054，p（B-G）=0.0014）显示F-actin缺陷（BDNF 1.00±0.04，Q21.00，IQR 0.01，n个= 14,N个= 276; 碳纳米管系数0.76±0.10，Q20.79，IQR 0.33，n个= 13,N个= 308; GDNF 0.54±0.06，Q2分别为0.49和0.37，n个= 13,N个= 314; p（B-C）=0.0112，p（B-G）<0.0001）。GDNF处理的生长锥细胞显示β-肌动蛋白水平降低。Tau在每种分析条件下都具有可比性。

关于层粘连蛋白-111，BDNF的退出不会导致胚胎运动神经元的轴突表型

有不同的层粘连蛋白亚型发挥不同的功能。含有上述β2链的层粘连蛋白-221在神经肌肉接头的突触间隙中起着重要作用（Noakes等人。，1995)而β1-链层粘连蛋白对雪旺细胞分化很重要（Colognato和Yurcenco，2000). 到目前为止，轴突延伸的差异（图​（图1D）一维)和β-actin/F-actin的存在（图​（图5A，5A级，图S4F系列)在培养在层粘连蛋白221/211上的trkB缺陷运动神经元的轴突生长锥中观察到，不影响胞体大小和树突复杂性（图S2A公司). 为了进一步表征和强调BDNF/trkB信号和β2-链层粘连蛋白的协同作用，我们培养了trk英国电信公司−/−携带β1-链的层粘连蛋白111上的运动神经元（图6A–C级). 与之相比trk英国电信公司+/+缺乏trkB的运动神经元细胞生长出较短的轴突（图​（图6A）6A级)并形成较小的生长锥（图​（图6B）。6亿). 然而，这些较小的生长锥显示β-肌动蛋白和F-肌动蛋白水平没有变化（图6B、C，图S4F系列). 两种基因型之间的体细胞大小和树突形态具有可比性（图S2E公司). 与Ca的结果类似v（v）2.2（图S1C系列)与层粘连蛋白111相比，层粘连素221/211作为基质蛋白的使用似乎导致了对照运动神经元轴突生长锥中F-actin水平的增强，而这种差异在trk英国−/−生长锥（图第4页).

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在层粘连蛋白-111上，BDNF对轴突生长和生长锥内的F-actin组装是不可或缺的。（A）的代表性图像trk英国+/+和trk英国电信公司−/−运动神经元在层粘连蛋白-111上培养7天在体外并对tau进行染色（比例尺：150μm）。TrkB突变体运动神经元（357.2±29.33μm，Q2363微米，n个= 8,N个=579）轴突变短(对=0.0417），与野生型对照（468.8±39.31μm，Q2454.9微米，n个= 9,N个= 615).（B）轴突生长锥的代表性图像trk英国+/+和trk英国电信公司−/−运动神经元培养5天在体外在层粘连蛋白-111上，与β-actin（绿色）、F-actin（黄色）和tau（洋红色）进行染色（比例尺：5μm）。（C） TrkBTK公司−/−运动神经元（16.55±1.26μm2、Q217.12微米2,n个= 11,N个=178）发育出明显较小的生长锥(对=0.0132）比相应的控制（27.51±4.58μm2、Q225.06微米2,n个= 7,N个=113）。两种基因型之间的β-肌动蛋白、F-肌动蛋白和tau水平没有显著变化。（D）在层粘连蛋白111上培养7天的野生型运动神经元的代表性图像在体外用BDNF、CNTF或GDNF进行染色，并与τ进行对比（比例尺：150μm）。各神经营养因子（BDNF 425.3±14.93μm，Q2423.3微米，n个= 5,N个= 256; CNTF 439.0±18.37μm，Q2439.9微米，n个＝6，N个= 258; GDNF 388.6±24.47μm，Q2412.1微米，n个= 5,N个=273；p（B-C）=0.8710，p（B-G）=0.4295）。（E）层粘连蛋白-111培养5天的运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外在BDNF、CNTF或GDNF的存在下，用F-actin（洋红色）和tau（绿色）染色（比例尺：5μm）。（F）各条件下的生长锥大小无显著差异（BDNF 32.83±4.93μm2、Q229.04微米2,n个= 6,N个= 165; CNTF 33.01±4.41微米2、Q230.96微米2,n个= 6,N个= 175; GDNF 37.85±4.72微米2、Q238.52微米2,n个= 6,N个= 172; p（B-C）=0.9996，p（B-G）=0.7352）。此外，F-actin（BDNF 1.00±0.02，Q21.00，IQR 0.04，n个= 6,N个= 165; CNTF 1.14±0.22，Q20.95，IQR 0.97，n个＝6，N个= 175; GDNF 0.99±0.28，Q20.79，IQR 1.02，n个= 6,N个= 172; p（B-C）>0.9999，p（B-G）>0.999）和tau水平似乎没有改变。

由于trkB缺乏导致巨大的发育缺陷和出生后过早死亡（Klein等人。，1993)由于我们不能排除胚胎发育过程中可能影响在层粘连蛋白111上培养的trkB缺陷运动神经元在轴突生长和生长锥大小方面观察到的形态学异常的“非靶向”效应，因此我们继续在存在BDNF的层粘连素111上培养野生型运动神经元，CNTF或GDNF（图6D–F). 通过这种方式，可以确保胚胎运动神经元的正常发育，并且可以通过实验解决BDNF和层粘连蛋白信号传导对轴突延伸和生长锥形成的贡献。在培养7天后，我们观察到轴突生长没有显著差异（图​（图6D）。第6天). 在每种情况下，体细胞大小和枝晶复杂度也具有可比性（图S2F（平方英尺）). 在培养5天后，BDNF-、CNTF-和GDNF-处理的运动神经元发育出大小相当的生长锥（图6E、F). F-actin和tau信号强度也没有改变（图6E、F). 我们从这些数据中得出结论，BDNF/trkB和层粘连蛋白β2链信号的共同作用对胚胎运动神经元中Ca的生长锥形成至关重要v（v）2.2聚集和局部钙信号，以及肌动蛋白聚合或稳定。在层粘连蛋白-111上，BDNF似乎是可有可无的。

短暂的BDNF脉冲足以诱导LIM激酶和cofilin的磷酸化，从而在层粘连蛋白221培养的胚胎运动神经元的轴突生长锥中组装F-actin

到目前为止，我们已经收集到实验证据表明BDNF/trkB信号与β2-链层粘连蛋白一起促进自发Ca2+通过增强的F-actin组装形成生长锥的内流。为了验证短暂的BDNF脉冲是否足以诱导最终导致肌动蛋白稳定的信号通路，我们在固定或蛋白溶解之前用BDNF刺激BDNF产生的运动神经元（图​（图7，7，图第5章). 与非脉冲对照组相比，在BDNF刺激下，轴突生长锥中磷酸化标记免疫反应性显著增强，而突触素水平没有改变（图​（图7A）。第7页). 我们还检测到生长锥突起处trkB适度增加（图5安)这可能与上述钙的积累有关v（v）在相同结构上应用BDNF后的2.2通道（图​（图3，三，图第3章). 磷酸化标记上调还伴随着磷酸化辅酶丝蛋白（Ser 3）强度的增加（图​（图7B）7亿)导致cofilin失活。总cofilin和突触素用作内部参考蛋白（图​（图7B）。7亿). 通过用抗磷酸标记、磷酸-AKT、磷酸-MAPK和磷酸辅酶的抗体探测整个运动神经元细胞裂解物，这些结果在生化水平上是可重复的（图S5C系列). TrkB激活对应于AKT和MAPK以及cofilin的磷酸化（图S5C系列). 最近的报道已经证明trkB受体与LIM激酶1相互作用，并且BDNF/trkB信号传导诱导LIM激酶1磷酸化（Sarmiere和Bamburg，2004; Dong等人。，2012; Saito等人。，2013). 我们还检测到用BDNF短暂刺激后LIM激酶1和2的磷酸化增加（图S5C系列). 除了灭活cofilin外，酪氨酸129（Tyr 129）处profilin的磷酸化直接促进肌动蛋白聚合。BDNF脉冲后，与非脉冲对照组相比，轴突生长锥中磷酸丙氨酸（Tyr 129）的水平显著增加（图​（图7C）。7摄氏度). 磷酸丙氨酸的变化（图​（图7C）7摄氏度)和磷酸钙（图​（图7B）7亿)F-肌动蛋白染色的增加也反映并验证了这一点，而tau和β-肌动蛋白水平在这两种情况下是可比较的（图​（图7D）。第7天). 此外，急性应用BDNF导致在层粘连蛋白221/211培养的运动神经元的生长锥中肌动蛋白运动减少（图7E、F，电影S1（第一阶段）,S2系列)，对应于从球状（G-actin）到丝状β-actin（F-actin）的明显转变（图第5天). 在层粘连蛋白111上，短暂应用BDNF和适度trkB磷酸化（图S5E系列)轴突生长锥中的β-肌动蛋白免疫反应似乎增加，而F-肌动蛋白水平似乎没有改变（图S5F系列). 这些结果与层粘连蛋白221/211相反，β-肌动蛋白似乎不受BDNF脉冲的调节，而F-肌动蛋白显著增加（图​（图7D，第7天，图S5D系列). 这些数据加强了BDNF通过F-actin组装来稳定局部肌动蛋白细胞骨架的假设，特别是当运动神经元培养在层粘连蛋白221/211上时。

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短暂应用BDNF于层粘连蛋白221可激活运动轴突生长锥中的trkB信号通路，导致cofilin和profilin稳定肌动蛋白的磷酸化。（A）在层粘连蛋白221/211上培养5天的胚胎运动神经元轴突生长锥的代表性图像在体外并对磷酸标记（洋红色）和突触素（绿色）进行染色（比例尺：5μm）。BDNF后，脉冲磷酸标记免疫反应性显著增加（无脉冲1.00±0.08，Q21.00,n个= 10,N个= 136; 5′BDNF 1.72±0.25，Q21.63,n个= 10,N个= 137;对=0.0154），而突触素水平具有可比性。（B）BDNF刺激还增加了磷酸化辅因子（Ser 3，黄色）强度（pCof/cofilin–无脉冲1.00±0.03，Q21.00,n个= 11,N个= 174; 5′BDNF 1.73±0.17，Q21.69,n个= 11,N个= 176;对=0.0003），但未改变cofilin（绿色）和synaptophysin（洋红色）（比例尺：5μm）。（C）针对磷酸-脯氨酸（Tyr 129，绿色）和突触素（洋红色）染色的轴突生长锥的代表性图像（比例尺：5μm）。BDNF治疗后，磷酸化profilin水平升高（无脉冲1.00±0.04，Q21.00 IQR 0.09，n个= 13,N个= 200; 5′BDNF 1.59±0.12，Q2分别为1.67、IQR 0.57，N个= 14,n个= 226;对= 0.0012).（D）在BDNF脉冲生长锥中，F-actin（洋红色）显著增加（1.49±0.13，Q21.48,n个= 9,N个= 236;对=0.0088）与非脉冲对照组（1.00±0.06，Q21.00,n个= 7,N个=194），而总β-肌动蛋白（绿色）和τ（蓝色）似乎没有变化（比例尺：5μm）。（E）培养5或6天的胚胎运动神经元轴突生长锥的活细胞成像在体外并用表达肌动蛋白-GFP的慢病毒构建物转导。BDNF脉冲前后相同生长锥的时间序列（比例尺：5μm）。施用BDNF后，丝状体动力学降低，表明肌动蛋白稳定。（F）纤丝体动力学被评估为多个kymography图，显示BDNF脉冲后肌动蛋白运动显著减少（无脉冲0.25±0.02μm/s，Q20.27μm/s，IQR 0.20μm/s，N个= 49; 5′BDNF 0.18±0.02μm/s，Q20.14μm/s IQR 0.16μm/s，N个= 44;对= 0.0044).

讨论

神经营养因子对运动神经元存活的影响已被广泛接受。然而，来自不同家族的不同神经营养因子，如BDNF（神经营养因子）、CNTF（白细胞介素）和GDNF（GFL）在胚胎运动神经元轴突延伸和生长锥形成方面的特殊和差异作用仍未得到解决。特别是F-actin组装的协调以及受体和离子通道（如Ca）的精确定位v（v）2.2 at生长锥需要更好的理解。在这里，我们表明BDNF，而不是CNTF或GDNF，通过诱导钙内流和肌动蛋白稳定与β2-链层粘连蛋白信号协同调节轴突生长锥的形成。除了生物学上更相关的钙成像方法外，轴突长度测量是一种间接但可靠的神经元兴奋性读数，尤其是当运动神经元培养在β2-链层粘连蛋白上时。尤其是运动轴突的这种再生潜能也可以用来表征肌动蛋白细胞骨架的变化。

一些报告表明，神经营养因子在促进个体神经元种群存活和/或分化的发育过程中发挥独特的亚细胞功能，尽管激活了类似的信号级联。在发育过程中几乎无法检测到CNTF的表达，这表明CNTF最显著地促进了出生后和成年期运动神经元的存活和维持（Masu等人。，1993; Sendtner等人。，1994). 然而，可溶性受体细胞因子样因子1（CLF）和心肌营养素样细胞因子（CLC）代表CNTFR的另一个配体，特别是在发育过程中，也通过gp130、LIFR和STAT-3信号通路传递运动神经元存活（Elson等人。，2000; Forger等人。，2003). 在皮质脊髓运动神经元中，BDNF介导轴突树枝化和分支，而IGF-1和CNTF诱导轴突生长（Ozdinler和Macklis，2006; Richter和Roskams，2009). 与这些观察结果一致，应用CNTF或IGF-1可改善ALS患者项目经理表型（Sendtner等人。，1992; Bommel等人。，2002; Jablonka等人。，2011; Selvaraj等人。，2012). 与CNTF和GDNF相比，NT-4和BDNF对运动神经元的ChAT活性表现出最显著的反应（加藤和林赛，1994; Zurn等人。，1996). 将GDNF注射到患有ALS的小鼠的脊髓中可防止运动神经元变性，而将GDNF注射到肌肉中可保护运动神经元功能，表明GDNF的局部责任（Suzuki等人。，2007,2008). 出生后运动神经元中c-ret的表达似乎稳定，而GDNFRα1和2在出生后下调（Zhang和Huang，2006). 相反，在胚胎发育期间，全长trkB与截短trkB的比例为2:1，而在出生后的生活中，通过蛋白质切割和RNA剪接过程，这一比例则相反（Zhang和Huang，2006).

因此，GDNF和BDNF在胚胎发育过程中似乎存在时空差异。GDNF和BDNF都部分通过MAP激酶途径发挥作用，包括Erk1/2作为神经元分化的积极调节器，但只有BDNF在中脑神经元中传递MAPK的持续磷酸化，而GDNF引起相当短暂的MAPK磷酸化（Feng等人。，1999年a,b条). 有趣的是，MAPK的持续激活导致分化，而短暂的MAPK信号有助于细胞存活和增殖（York等人。，1998; Kao等人。，2001). 在这种情况下，据报道，依赖激酶活性的trkB再循环对持续ERK1/2信号传导至关重要（Huang等人。，2009)内体或质膜中的trk受体分别诱导ERK1/2持续或短暂活化（York等人。，1998; Mochizuki等人。，2001; Wu等人。，2001). 尤其是，trk英国电信公司−/−小鼠缺乏这种激酶结构域（Klein等人。，1993). 根据这些观察结果，我们发现GDNF受体c-ret和BDNF受体trkB在层粘连蛋白221/211培养的胚胎运动神经元的神经末梢有明显的分布（图S1D系列). TrkB位于靠近Ca的生长锥突起处v（v）2.2钙通道，而c-ret在相当中心的生长锥区转位。虽然两种神经营养因子都激活酪氨酸激酶信号通路，但很容易推测这种空间差异可能解释了BDNF-衍生运动神经元的轴突表型。

BDNF/trkB诱导自发性钙2+初级运动神经元的瞬变

在外周和中枢神经系统中，BDNF调节细胞存活，但最重要的是调节突触功能和神经元形态（Blum和Konnerth，2005; 米尼奇埃罗，2009; Rauskolb等人。，2010; 公园和游泳池，2013; Sasi等人。，2017). 在胚胎运动神经元中，BDNF/trkB信号促进存活。然而，BDNF/trkB是否对诸如轴突伸长和生长锥成熟等细胞分化也是必要的还不完全清楚。体内，运动神经元的生长锥最终成熟到神经肌肉接头（NMJ）的突触前室。β2-链缺陷的小鼠产生NMJ表型（Noakes等人。，1995)而β1-链层粘连蛋白亚型似乎在雪旺细胞分化中起着关键作用（Chen和Strickland，2003; Yang等人。，2005; Yu等人。，2005). 由于β1-和β2-链在不同发育阶段的不同细胞类型中的特殊功能，在细胞水平上直接比较它们的功能似乎受到限制，而且难以实现。因此，我们想研究携带β2链的层粘连蛋白亚型存在时运动神经元的分化，以详细研究哪种神经营养因子在这一特定背景下促进轴突生长锥的形成。在这项研究中，我们使用了β2-链层粘连蛋白亚型221，因为它在突触前成熟和维持中的作用（Noakes等人。，1995; Jablonka等人。，2007). 我们的数据发现，在这种突触特异性层粘连蛋白亚型上培养的胚胎运动神经元中，BDNF的应用和通过其高亲和力受体trkB的信号转导导致自发Ca的诱导2+轴突生长锥中的瞬变，反过来对应于轴突伸长的调节。这些增强了自发钙2+瞬变源于局部钙v（v）2.2生长锥突出处的集群（见图​图11–三; Jablonka等人。，2007)是通过孔形成亚单位（Ca）的相互作用介导的v（v）)钙的v（v）2.2和层粘连蛋白-221的β2-链（Nishimune等人。，2004). 最后，由此产生的钙内流被认为是轴突信号，导致层粘连蛋白221上轴突生长受限（Jablonka等人。，2007). 那些增强的钙2+在携带β1-链样层粘连蛋白-111的层粘连素上，无法检测到定位于轴突生长锥的瞬态（Jablonka等人。，2007). 事实上，我们观察到钙减少v（v）2.2在层粘连蛋白111上培养的对照运动神经元轴突生长锥中的聚集，与层粘连素221/211直接比较（见图S1C系列). 因此，我们建议用β2-链层粘连蛋白亚型（如层粘连素-221）来研究与钙通道积累和局部兴奋性相关的细胞机制，尤其是在原代培养运动神经元的生长锥中，很可能与β1-链层粘着蛋白亚型，如层粘着素-111进行比较。

在小鼠运动神经末梢，P/Q型（Cav（v）2.1）电压门控钙通道是发育后NMJ释放位点参与胞吐的主要通道（Katz等人。，1997; Rosato Siri和Uchitel，1999; Santafe等人。，2001). 我们从钙的研究中得知v（v）2.1敲除小鼠，这些小鼠在出生三周后遭受神经肌肉终板变性（Nishimune等人。，2004). 因此，基于我们的研究，很容易推测BDNF/trkB信号可能在运动神经元的分化、维持和功能中发挥作用。在这种情况下，trkB信号的重要性已经在trk英国电信公司−/−敲除小鼠（Klein等人。，1993). 这些小鼠携带截短的trkB受体（gp95trkB型)激酶活性受损（Klein等人。，1993).TrkBTK公司−/−小鼠出生后死亡，表现出感觉和运动缺陷（Klein等人。，1993). 此外，腺病毒介导的体细胞基因转移的实验可以证明，当trkB信号传导受到截短trkB过表达的影响时，运动终板处的突触后AChR区域被分解（Gonzalez等人。，1999). 此外，爪蟾神经肌肉共培养的实验清楚地表明，trkB通过将前BDNF转化为成熟BDNF来调节神经肌肉连接处的突触消除（Je等人。，2012). Ca的类似症状v（v）2.2在脊髓性肌萎缩小鼠模型中观察到神经肌肉突触的聚集、生长锥形成和神经递质缺陷（Kong等人。，2009; Park等人。，2010; Ruiz等人。，2010; Tejero等人。，2016; Jablonka和Sendtner，2017). 关于减少的自发钙2+瞬态，受影响的Cav（v）2.2层粘连蛋白221/211和层粘连素111的积累和轴突生长失调，trk英国−/−运动神经元类似于在体外Smn-缺陷胚胎运动神经元的表型（Rossoll等人。，2003; Jablonka等人。，2007,2014). 最近关于电压门控钠通道Na的报道加强了细胞兴奋性对运动神经元存活和功能的重要性v（v）1.9显著促进层粘连蛋白-111上运动神经元轴突的生长（Subramanian等人。，2012; Wetzel等人。，2013)钾通道K的丢失v（v）2.1对应于SMA小鼠模型中的运动神经元退化（Fletcher等人。，2017). 此外，神经营养因子如NGF和NT-3对钠的调节也不同v（v）1.9和Nav（v）1.8表达（Wilson-Gerwing等人。，2008)BDNF信号似乎与Na一致v（v）1.9执行去极化（Blum等人。，2002). 因此，BDNF/trkB信号可能导致细胞兴奋性失调，从而导致运动神经元疾病。

BDNF/trkB支持生长锥的形成

我们的研究阐明了生长锥突起处存在的β-肌动蛋白控制生长锥大小和钙v（v）2.2积累。反之亦然局部钙瞬变调节β-actin水平和生长锥形态。这种相互依赖性对于突触前结构的分化似乎很重要。我们从几份报告中得知，BDNF/trkB信号传导促进LIM激酶1和cofilin的磷酸化，从而导致海马神经元肌动蛋白聚合和轴突生长（Sarmiere和Bamburg，2004; Dong等人。，2012; Saito等人。，2013). 我们还观察到BDNF诱导的胚胎运动神经元中LIM激酶和cofilin磷酸化，这对应于生长锥突起处肌动蛋白运动的减少，表明F-actin的组装和稳定（图​（图7F，第7页，图S5D系列). LIM激酶磷酸化丝氨酸3处的cofilin蛋白，使其在肌动蛋白解聚和肌动蛋白丝快速周转中的功能失活（Moriyama等人。，1996; 瑞穗，2013; 大林，2015). 有趣的是，这种肌动蛋白与钙结合的稳定作用v（v）在BDNF存在的情况下，2.2β2链激活的轴突分化信号导致层粘连蛋白221上轴突生长受限。与BDNF处理细胞相比，CNTF和GDNF处理的运动神经元在层粘连蛋白221上形成较小的生长锥并生长较长的轴突。在层粘连蛋白-111上，BDNF似乎对轴突延伸和生长锥的形成没有必要（图6D–F). 此外，TrkBTK公司−/−运动神经元在层粘连蛋白111上没有表现出明显的肌动蛋白表型，尽管发育的生长锥较小（图6B、C). 这进一步加强了BDNF/trkB信号在LIM激酶/cofilin介导的F-actin组装和局部Ca生成中的重要作用2+通过Ca的瞬态v（v）2.2运动神经元在β2-链层粘连蛋白221上培养时的积累。这些观察结果与中枢神经系统（CNS）的观察结果相类似。中枢神经系统中cofilin的失活导致F-actin倒钩末端，进而导致与AMPA受体插入增强相关的脊椎增大（Gu等人。，2010). 我们还检测到，BDNF刺激后生长锥中Tyr 129处的profilin磷酸化增加，导致G-actin组装成F-actin（Kang等人。，1999; 图​图7）。7). Profilin通过调节细胞骨架完整性和肌动蛋白动力学，并通过与短笛霉素、卟啉和苦艾素等结合，促进神经元发育和突触可塑性（Wang等人。，1999; Fenster等人。，2000,2003; Kim等人。，2003; Pilo Boyl等人。，2007; Waites等人。，2011; Görlich等人。，2012; Kullmann等人。，2012; Michaelsen-Preuse等人。，2016). Wnt/Ca中也含有profilin2+信令（Frantzi等人。，2016)指出了上述Ca的相互依赖性2+轴突生长锥的瞬态和肌动蛋白动力学。据报道，VEGF（血管内皮生长因子）和Src激酶在Tyr 129诱导profilin磷酸化，特别是在外周结构增强肌动蛋白聚合（Fan等人。，2012; Pronto-Labinho等人。，2014). 与这些观察结果一致，BDNF不能增强Cav（v）2.2 Src激酶抑制后运动神经元生长锥中的聚集（图S3C、D)强调肌动蛋白和钙信号的相互依赖性。Src激酶是神经营养因子信号转导的重要下游介质，向周围招募β-肌动蛋白转录物，刺激局部蛋白质合成，并以钙依赖的方式调节生长锥的转动（Zhang等人。，1999,2001; Hüttelmaier等人。，2005; Yao等人。，2006; Willis等人。，2007; Sasaki等人。，2010). 最近，在散发性和家族性ALS病例中发现了profilin突变，可能影响肌动蛋白结合域和肌动蛋白聚合失调，使该蛋白具有临床相关性（Wu等人。，2012; Chen等人。，2013; Ingre等人。，2013; Del Poggetto等人。，2015,2016; Freischmidt等人。，2015; Smith等人。，2015). 有趣的是，突变型profilin定位于也包含TDP43、泛素和p62的细胞质聚集体中（Wu等人。，2012; 田中等人。，2016).

综上所述，BDNF/trkB信号转导如何在机制上导致钙v（v）2.2积累。到目前为止，这两个分子之间的直接相互作用尚不清楚，尽管近距离的潜在定位，特别是在胚胎运动神经元的生长锥突起处，引起了猜测（图​（图1A，1安培，图S1B级). 另一方面，可以考虑一种更间接的机制。我们从先前的研究中得知，β-亚基（Cav（v）β） L型钙通道（Cav（v）1.2）与肌动蛋白细胞骨架直接相关（Stölting等人。，2015)，促进通道复合体沿肌动蛋白丝的前向运输。Ca也有类似的机制v（v）2.2可能通过BDNF诱导的F-actin组装将其转运到细胞表面，并在那里积累。这一问题需要在进一步的研究中加以解决。事实上，有几项研究讨论了增强释放概率的N型和P/Q型钙通道的辅助亚单位（海豚、，2012; Hoppa等人。，2012)并调节背根神经节的轴突再生（Tedeschi等人。，2016). 很容易推测BDNF/trkB信号可能以某种方式调节这种亚单位在细胞膜上的存在和定位，从而间接导致钙v（v）2.2钙的积累和自发钙2+大量涌入。反过来，细胞内钙增加2+浓度可能增强trkB向细胞表面的易位（Du等人。，2000)而F-actin也可能参与了这一过程。在我们的实验范式中，目前尚不清楚β2-链层粘连蛋白是否与肌动蛋白直接相互作用。

据报道，在层粘连蛋白111培养的运动神经元轴突生长锥中，β-肌动蛋白mRNA的局部翻译比在层粘着蛋白221/211培养的细胞中更显著（Rathod等人。，2012). 与这一发现一致，我们观察到在层粘连蛋白111上的BDNF脉冲作用下，轴突生长锥中的β-肌动蛋白免疫反应增强（图S5F系列)而层粘连蛋白221/211的β-肌动蛋白水平没有明显变化（图​（图7D）。第7天). 然而，在层粘连蛋白221/211上，短暂应用BDNF导致F-actin组装增强（图​（图7D，第7天，图S5D系列). 此外，轴突生长锥中的F-actin水平似乎不同就其本身而言层粘连蛋白221/211和层粘连素111之间（图S4F系列). 在层粘连蛋白-111上，BDNF可能刺激胚胎运动神经元轴突生长锥中β-肌动蛋白的局部翻译，如皮层神经元所示（Sasaki等人。，2010)而在层粘连蛋白221上，BDNF通过F-actin组装和稳定介导生长锥的形成。由就地杂交我们在层粘连蛋白221/211的BDNF脉冲上检测到肌动蛋白mRNA信号强度升高（图S4A系列)，但这并不一定反映出表达和翻译的增强。此外，我们没有区分α-、β-和γ-肌动蛋白亚型（Moradi等人。，2017)，因此无法明确指定效果。还需要解决整合素信号在多大程度上参与β2-链层粘连蛋白介导的肌动蛋白聚合（Park和Goda，2016)调节生长锥的形成。

在运动神经元疾病的背景下，突触前室及其神经传递机制似乎极易受到肌动蛋白和微管动力学缺陷的影响。在Smn-缺乏运动神经元的生长锥中，β-肌动蛋白mRNA水平降低（Rossoll等人。，2003; Jablonka等人。，2007; Rathod等人。，2012; Moradi等人。，2017). SMA小鼠运动终板存在F-actin和微管蛋白缺陷（Torres-Benito等人。，2011; Ackermann等人。，2013). 此外，轴突室中的这种肌动蛋白表型伴随着孤立的Smn-缺乏运动神经元的异常兴奋性（Jablonka等人。，2007)SMA小鼠神经肌肉接头中的神经递质缺陷（Ruiz等人。，2010; 托雷斯-贝尼托等人。，2011). 有趣的是，SMN与profilin相互作用，促进RNA处理和神经元转录（Giesemann等人。，1999; 伯巴赫，2008; Bowerman等人。，2009). 在Smn-缺乏细胞中，丝氨酸137/138处profilin亚型2a的过度磷酸化和磷酸-丝氨酸水平的降低改变了肌动蛋白的动力学和稳定性（Nölle等人。，2011). 与这些发现一致，IGF-1下调导致Rho/ROCK水平增加，对应于丝氨酸137/138处轮廓蛋白亚型1的磷酸化增加，这反过来象征着失活状态（Shao等人。，2008; Nölle等人。，2011; 蒙塔尼和佩特里诺维奇，2014). 在这项研究中，我们发现受损的BDNF/trkB信号传导在胚胎运动神经元的生长锥中导致肌动蛋白和钙相关表型，SMA运动神经元中也发现了这一表型（Jablonka等人。，2007). 因此，研究SMA小鼠模型中的trkB和BDNF，尤其是突触前结构，可能是值得的。trkB、β2-链层粘连蛋白和电压门控钙通道对神经肌肉突触功能的重要性，与神经递质和功能性乙酰胆碱受体有关，也在先天性肌无力综合征、Lambert-Eaton肌无力综合症（LEMS）或重症肌无力（MG）（Punga和Ruegg，2012; Shi等人。，2012).

总之，我们认为最重要的BDNF和β2-链层粘连蛋白在胚胎运动神经元的生长锥形成和局部兴奋性中发挥特殊作用，这在神经肌肉疾病导致神经传递缺陷的病理机制的科学讨论中应予以考虑。

作者贡献

构思并设计了实验：BD和SJ。进行了实验：B1、SB、PL和RS。分析了数据：BD、SB，PL、RS和MM。贡献的试剂/材料/分析工具：LSB、MM、RS和SJ，帮助撰写了手稿：SJ和BD。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

鸣谢

我们感谢Nicole Rachor和Hildegard Troll的技术支持。我们要感谢Michael Sendtner和Robert Blum对该项目的有益讨论。这项工作由德国生殖科学研究所（DFG）（JA1823/3-1）、1048“器官发生”研究培训小组、维尔茨堡大学生命科学研究生院和巴伐利亚诱导多能干细胞研究网络（ForIPS）资助。本出版物由德国研究基金会（DFG）和乌尔兹堡大学在开放获取出版资助项目中资助。

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