结果
Mir505–3p在体外调节轴突发育
调查米尔505在神经发育过程中，我们首先检测了Mir505之前，和2个成熟版本的米尔505,Mir505–3便士和Mir505–5便士，发育小鼠皮层。22我们发现了Mir505之前在胚胎期高表达，然后从出生后d 0开始逐渐减少（P0）（图S2A）。使用规范化Mir16–1–5p，一种稳定表达的miRNAMir505–3便士和Mir505–5便士从P0开始增加，然后在P7左右达到峰值，在P21左右减少（图S2B，C）。这些观察表明米尔505在早期大脑发育中，其表达模式与皮质发育和成熟阶段相关，从胚胎早期到出生后第三周结束。23
确定是否米尔505可能在神经发育中发挥功能性作用，我们设计了miRNA模拟物和补体siRNA抑制剂Mir505–3便士，以及Mir505–3便士表达式向量（包含处理序列的173个碱基对（bps））。确认基因调节对Mir505–3便士，我们首先检查了Mir505–3便士通过过度表达模拟物和抑制剂进行表达。我们发现过度表达后急剧增加Mir505–3便士抑制剂组的模拟和显著降低（图S2D）。此外，我们还发现Mir505–3便士转染后Mir505–3便士表达式向量（图S2E）。因此，我们证明了Mir505–3便士效率很高。
打乱的miRNAs电穿孔后，Mir505–3便士和Mir505–5便士通过使用AMAXA核转染器装置模拟培养的小鼠皮层神经元，我们在体外检测了转染神经元的形态学发育。在体外培养第3天（DIV），我们固定神经元培养物，并用抗SMI312抗体（轴突特异性标记物）进行免疫荧光染色，以区分轴突和包括树突在内的小轴突分支。有趣的是，我们发现只有Mir505–3便士特异性增强轴突分支()，对小突起分支没有显著影响（图S3A）。为了证实这一数据，我们用Lipofectamine 2000转染了相同的载体。与之前的观察一致，神经极性建立()和轴突总长度（TAL）()5DIV培养的神经元中Mir505–3便士表达，但不是总的小神经突长度（TMNL）（图S3B）。24
Mir505–3便士是体外轴突发育所必需的。（A） 用具有GFP的0 DIV AMAXA核转染剂转染的小鼠原代皮层神经元和具有所示构建体的扰乱siRNA或GFP的示例图片。将神经元固定并用抗SMI312和GFP抗体在3 DIV下进行免疫荧光染色，以测量轴突和小轴突的数量。比例尺：50μm。（B） 测量（A）中每种情况下的轴突数量。（C） 如图所示，小鼠初级皮层神经元在1 DIV转染脂质体2000和GFP，以及扰乱siRNA或GFP构建物的示例图片。将神经元固定在5DIV，测量神经元极性和轴突总长度。比例尺：90μm。（D） 测量（C）中每个条件的神经元极性。（E） 测量（C）中每种情况下的轴突总长度。（F） 如图所示，小鼠初级皮层神经元在1 DIV转染脂质体2000和GFP，以及扰乱siRNA或GFP构建物的示例图片。比例尺：45μm。（G）至I）分别测量每种情况下的轴突数量、神经元极性和轴突总长度。从每种情况中随机选择30到33个神经元并进行测量。误差条：SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（学生t吨测试）。
为了进一步验证Mir505–3便士在轴突发育过程中，我们接下来转染了干扰miRNAs，Mir505–3便士模仿，Mir505–3便士抑制剂或Mir505–3便士培养皮层神经元中的模拟物和抑制剂()。25我们发现了Mir505–3便士抑制剂，与Mir505–3便士mimics在轴突分支、神经极性建立和轴突延伸方面表现出强大的衰减作用，这是由Mir505–3便士共表达(和)。26,27然而，术后小突起分支和TMNL没有显著差异Mir505–3便士操作（图S3C，D）。这些结果表明Mir505–3便士是培养的小鼠皮层神经元中神经极性建立、轴突生长和分支的正调节因子。
为了进一步证实这些观察结果，我们应用抗MAPT/Tau（稳定轴突中微管组装的微管相关蛋白的标记物）来标记成熟的轴突。我们转染了干扰miRNAs，Mir505–3便士模仿，Mir505–3便士抑制剂或混合物Mir505–3便士模拟物和抑制剂，在培养的皮层神经元中使用Lipofectamine 2000（图S4A）。与SMI312标签一致，我们观察到Mir505–3便士抑制剂表现出神经极性建立（图S4B）、轴突延伸（图S4C）和轴突分支（图S4E）的衰减效应，这些效应通过共表达Mir505–3便士（图S4A、B、C和E）。此外，没有Mir505–3便士对TMNL（图S4D）和小突起分支（图S4F）观察到抑制剂。这些结果进一步表明Mir505–3便士在调节培养的小鼠皮层神经元的轴突生长和分支中起着关键作用。
Mir505–3p调节轴突分支和延伸体内
新生皮层神经元的轴突发育可分为3个步骤。首先，神经元向皮质板迁移，有一个前导和尾随过程，尾随过程演变为轴突（从E11到E18）。第二，轴突穿过胼胝体延伸至对侧（P3），到达靶区（P7）。第三，轴突经历了快速分支过程，以找到突触伙伴并形成功能性突触（从P8到P21）。28
探索是否Mir505–3便士调节体内轴突的发育，我们在子宫内进行电穿孔以过度表达Mir505–3便士E14.5小鼠皮层。在P3，测量GFP标记的轴突从同侧到对侧穿过胼胝体的投射()。29我们发现神经元过度表达Mir505–3便士，显示对侧突起轴突的长度显著增加(和)，表明通过Mir505–第3页有趣的是，突起轴突的长度显著增加Mir505–3便士-还观察到同侧神经元过度表达(和)。典型地，神经元具有单极性形态，长轴突投射到对侧，因此皮层同侧的异常轴突束可能由多极化皮层神经元产生，进一步支持了Mir505–3便士神经极化(和)。28
Mir505–3便士足以在体内进行轴突延伸和分支。（A） 子宫内P3小鼠冠状脑切片的低放大率图像，用所示质粒在E 14.5电穿孔。比例尺：1000μm。（B） （A）中对侧脑切片的放大图像。（C） （A）中同侧脑切片的放大图像。（D） （B）中轴突长度的测量（从轴突束中线到末端，用黄线表示）。（E） （C）中轴突长度的测量（从轴突束的近端到末端，用黄线表示）。（F） 如图所示，在E 14.5处用质粒电穿孔的P8小鼠宫内冠状脑切片的低倍图像。比例尺：1000μm。（G） （F）中同侧脑切片的放大图像。比例尺：100μm。（H） （F）中对侧脑切片的放大图像。比例尺：100μm。（一） 测量（H）中每种情况下从第1层到白质的对侧皮质板中的轴突信号强度。（J） 测量（G）中每种情况下同侧皮质板第5层的轴突信号强度。（K） P8小鼠冠状脑切片示意图。带有指示区域的方框在（L）中作了进一步说明。（五十） 每种情况下IUE模型中轴突分支形态示意图。对每种情况下的至少4窝幼崽进行了测量。误差线：SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（学生t吨测试）。
为了进一步调查Mir505–第3页为了在体内调节轴突的发育，我们在P8处采集IUE小鼠，检测对侧初级体感皮层桶状野的终末轴突分支()。在P8，皮层神经元的轴突半放射至皮层深层(和)然后在对侧进一步延伸分支(和)。30我们发现神经元表达Mir505–3便士在同侧和对侧都有丰富的轴突分支(和)。我们测量了同侧第5层的轴突分支信号，并从第1层到对侧白质进行了连续测量。31我们证明了这一点Mir505–3便士显著促进对侧各层轴突分支(和)并促进同侧第5层轴突分支(和)。综合起来，这些数据表明Mir505–3便士在体内促进轴突延伸和分支方面起着关键作用。
Mir505-3p基因缺失抑制体内轴突发育
调查是否Mir505–3便士是轴突遗传发育所必需的，我们设计了2个小引导RNA（sgRNAs）靶向米尔505基因()并应用CRISPR/Cas9系统生成mir505型24-bp缺失敲除小鼠()。为了确保这2个sgRNAs不会对以下动物的后代产生非靶向效应mir505型敲除小鼠后，我们预测了潜在的脱靶基因，并设计了用于检测和测序的特异性引物。我们发现所有米尔505缺失创始小鼠没有偏离目标效应（图S5A、B和表S2，另见基于CRISPR/Cas9-based密尔505材料和方法中的敲除小鼠）。我们始终确认505年3月前,Mir505–3便士和Mir505–5便士KO小鼠与WT小鼠相比显著降低()。
的基因缺失Mir505–3便士损伤体内轴突的发育。（A） 2个sgRNAs靶向pre的示意图-米尔505（B）测序结果显示Mir505–3便士由CRISPR/Cas9系统诱导（上部）。DNA凝胶电泳显示WT、杂合子和KO窝友的基因分型结果（较低）。CRISPR/Cas9系统产生24 bp缺失突变。（C） mRNA水平检测505年3月前,Mir505–3便士和Mir505–5便士在里面mir505型通过Q-PCR比较KO小鼠和WT同窝小鼠。（D和E）苏木精-伊红染色（D）和甲苯胺蓝染色（E）的成年小鼠冠状脑切片。虚线表示轴突形态的改变。在KO小鼠中，胼胝体（cc）和扣带（cg）区域被放大以表示轴突束的丢失。比例尺：100μm。（F） 每个基因型指示区域的放大图像。用抗SMI312和RBFOX3抗体进行免疫染色。比例尺：50μm。Het，杂合子。（G至I）分别测量每个基因型小鼠cc（G）、fi（H）和cg（I）区域的轴突信号强度。（J） 每种基因型小鼠扣带回RBFOX3阳性细胞的测量。为了在脑切片上进行免疫染色，对每种情况下至少4胎婴儿进行了测量。误差线为SEM**P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001（t检验）。
接下来，我们进行了苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色，以检查WT和mir505型KO小鼠。32我们发现，与WT小鼠相比，KO小鼠在胼胝体（cc）和扣带回（cg）等轴突集中区域的轴突密度明显降低(和)。为了进一步证实这一观察结果，我们对SMI312进行了免疫荧光染色，以监测轴突束，并对RBFOX3/NeuN进行了标记，以标记成熟神经元。我们发现，与WT同窝小鼠相比，KO小鼠cc、cg和伞（fi）区域的轴突束密度显著降低，而杂合子小鼠和WT小鼠之间没有显著差异(和)。有趣的是，在RBFOX3阳性神经元的细胞数量上没有观察到差异，这表明轴突的衰减是由于轴突发育缺陷而非神经元增殖所致(和)。因此，这一证据表明Mir505–第3页对活体脑轴突密度有强烈影响。
Atg12是Mir505–3p的靶基因
识别Mir505–3便士在小鼠神经元中，我们首先进行了生物信息学筛选。我们在Targetscan 6.2数据库中发现了172个潜在的靶基因，该数据库根据3′非翻译区（UTR）种子匹配区的保守性和位置预测了靶基因，33,34并发现57个基因从其他7个数据库中出现了两次以上。然后，我们根据皮层神经元的RNA测序结果进行种子匹配预测，发现799个候选基因，这些基因在神经元中表达相对较高。35通过比较这些基因列表，我们筛选出了8个在神经元中具有潜在重要功能的候选靶基因。我们还选择了Srsf1系列之前曾有报道称其为小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的靶基因。这9个候选基因被挑选出来进行进一步研究(和表S1）。36
附件12是的直接靶基因Mir505–3便士小鼠皮层神经元。（A） 小鼠皮层神经元中Mir505–3p候选靶基因的生物信息筛选示意图。另见表S1。（B） 归一化荧光素酶(雷尼利亚：firefly）所有候选目标的值。将候选靶点3′UTR的种子匹配区克隆到psi-CHECK-2双荧光素酶载体中，并与Mir505–3便士HEK 293细胞系中的质粒。（C） 慢病毒感染过度表达的培养皮层神经元所有候选靶点mRNA水平的Q-PCR检测Mir505–3便士（D）准确位置示意图Mir505–3便士鼠标上的目标附件123英尺UTR。在定点突变实验中替换了种子匹配区。（E） 归一化荧光素酶(雷尼利亚：firefly）值。这个第12页如图所示，将3′UTR psi-CHECK-2载体与构建物共转染。Mir505–3便士表现出对附件12WT 3′UTR，救援人员Mir505–3便士抑制剂。（F） ATG12由Mir505–3便士在培养的皮层神经元中。使用AMAXA核转染载体的3DIV神经元的ATG12和GAPDH抗体进行免疫印迹。（G） 免疫印迹测量（F）。至少进行了3次独立分析。误差线：SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（学生t吨测试）。
验证的直接目标Mir505–3便士，我们首次在人类胚胎肾293细胞中使用双核糖核酸酶分析。我们共同感染了Mir505–第3页含有～200-bp序列的双核糖核酸酶载体，包括候选基因3′UTR的种子区域和检测到的两种信号雷尼利亚荧光素酶和萤火虫荧光素酶。在所有候选基因中，第12页显示归一化比率下降最快雷尼利亚：萤火虫信号()。为了进一步确认它们是否是神经元中的靶基因，我们转染了Mir505–3便士在E14.5慢病毒培养的皮层神经元中，进行q-PCR以监测候选基因的mRNA水平。与人类胚胎肾293细胞中的双核糖核酸酶测定一致，只有附件12mRNA水平明显下调()。因此，附件12可能是受Mir505–第3页。
此外，我们用一个在种子匹配区含有定点突变的载体进行了双重荧光素酶分析附件123英尺UTR()。定点突变实验表明Mir505–3便士和的3′UTR附件12(和)。此外，我们检测了电穿孔后ATG12蛋白的水平Mir505–3便士通过3DIV培养的皮层神经元中的AMAXA核转染体。我们发现ATG12的蛋白水平确实受Mir505–3便士在神经元中(和)。因此，我们表明附件12是的直接靶基因Mir505–第3页在小鼠皮层神经元中。
子宫和体内轴突发育需要ATG12
为了确定ATG12是否在调节轴突发育中起作用，我们构建了一个表达第12页无5′-或3′-UTR区的开放阅读框（ORF）。我们首先电穿孔编码附件12用AMAXA核转染剂将ORF注入皮层神经元，并在3DIV下进行免疫荧光染色()。我们发现附件12ORF显著减少轴突分支(和)。然而，未观察到对小轴突分支的显著影响（图S3E），表明ATG12对轴突发育至关重要。此外，我们发现第12页脂质体2000转染的ORF延迟了5DIV时神经极性的建立(和)。TAL持续下降附件12ORF公司(和)而TMNL无明显变化（图S3F）。此外，我们发现由ATG12表达引起的轴突延伸和分支被Mir505–3便士共表达，表明Mir505–3便士确实是ATG12的上游信号，用于建立神经元极性()。因此，我们表明ATG12是培养神经元轴突发育的关键调节器。
ATG12是轴突发育的负调控因子。（A） 转染AMAXA核转染GFP或所示结构的小鼠初级皮层神经元的示例图片。固定神经元并用SMI312和GFP抗体在3 DIV下进行免疫荧光染色，以测量轴突数量。比例尺：20μm。（B） 在1 DIV处用GFP或所示构造物转染Lipofectamine 2000的小鼠初级皮层神经元的示例图片。比例尺：20μm。（C） 测量（A）中每种情况的轴突数量。（D） （B）中每种情况下神经元极性的测量。（E） 测量（B）中每种情况下的轴突总长度。从每种情况中随机选择30到33个神经元并进行测量。误差线为SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（t检验）。（F） 在E14.5处电穿孔的P8小鼠的冠状脑切片图像显示了质粒。比例尺：1000μm。（G） （F）中同侧脑切片的放大图像。比例尺：100μm。（H） （F）中对侧脑切片的放大图像。比例尺：100μm。（一） 测量（G）中每种情况下同侧皮质板第5层的轴突信号强度。（J） 测量（H）中每种情况下对侧皮质板从第1层到白质的轴突信号强度。对每种情况下的至少4窝幼崽进行了测量。误差线为SEM***P（P）<0.001（学生t吨测试）。
为了进一步确定是否需要ATG12Mir505–3便士在体内调节轴突发育，我们通过IUE表达Mir505–3便士或混合Mir505–3便士使用附件12然后在胚胎小鼠的大脑中检测GFP标记的轴突在P8从同侧到对侧的投射。我们发现附件12ORF能够完全挽救因表达Mir505–3便士在对侧的每一层上，通过测量同侧和对侧轴突分支的信号强度()同侧第5层轴突分支()。综上所述，这些结果表明需要ATG12Mir505–3便士调节体内轴突发育。
Mir505-3p基因消融激活脑内自噬通量
为了研究自噬途径在大脑中的动态变化mir505型敲除小鼠，我们解剖皮层神经元并转染GFP-LC3B以追踪自噬流量。37-39我们进行了免疫染色，并在自噬囊泡膜上标记了亚细胞GFP-LC3B。然而，由于神经元自噬的快速转换，我们无法监测小鼠皮层中的局部GFP-LC3B。40
因此，我们使用透射电子显微镜（TEM）方法检测培养的皮层神经元或皮层中的亚细胞自噬体mir505型击倒老鼠。41令人惊讶的是，我们观察到自噬流量的显著增加与细胞凋亡的减少相关Mir505–3便士()。在3个DIV培养的神经元中，与WT小鼠相比，KO小鼠的胞体和轴突部分都积累了更多更大的自噬体()。为了证实这些观察结果，我们杀死了P0小鼠，并在TEM捕获后解剖了皮层。一致地，自噬体的形成在数量和大小上都大大增加mir505型KO小鼠()。
的基因缺失Mir505–3便士激活大脑中的自噬。（A） 每个基因型皮层神经元的示例图片和放大图片。（B） 每个基因型皮质的示例图片和放大图片。假彩色代表个体自噬体（绿色圆圈，由绿色大写字母“A”和白色箭头表示）和线粒体（蓝色圆圈，用蓝色大写字母“M”和黑色箭头表示）。（C和D）分别测量皮层神经元和皮层细胞质单位面积内的自噬体大小。（E和F）分别测量皮层神经元和皮层细胞质单位面积内的自噬体数量。（G和H）分别测量皮层神经元和皮层细胞质单位面积内的线粒体数量。每种情况下至少测量4窝幼崽。（一） ATG12、LC3B-II/-I增加，SQSTM1/p62减少mir505型KO小鼠。用所示抗体进行免疫印迹。（J至L）（I）中ATG12、SQSTM1/p62和LC3B-II/-I蛋白质水平的测量。误差条为SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（学生t吨测试）。
然后，我们检测了WT、杂合子和纯合子皮层组织中ATG12、LC3B和SQSTM1/p62的蛋白水平mir505型分别为KO小鼠()。我们发现删除了米尔505显著提高了ATG12的蛋白水平，表明ATG12从Mir505–3便士抑制()。此外，LC3B-II与LC3B-I的比值增加，而SQSTM1/p62降低()。此外，我们将补体siRNA电穿孔为Mir505–3便士在培养的神经元中使用AMAXA核转染体抑制剂，并用q-PCR检测mRNA水平。我们发现第12页并略微减少SQSTM1/p62在以下条件下Mir505–3便士下调（图S6）。因此，这些结果表明Mir505–3便士通过上调小鼠大脑中的ATG12激活自噬。
Mir505–3p通过ATG12调节自噬
从酵母到哺乳动物，自噬是保守的。因此，我们推断自噬的调节Mir505–3便士也可以在不同类型的细胞中广泛观察到。因此，我们分离MEF细胞用于亚细胞自噬观察。由于自噬体的积累可能是由自噬通量的激活或自溶体的堵塞引起的，我们开始确定哪条途径Mir505–3便士可能会直接干扰。我们应用雷帕霉素（RPMC）或氯喹（CQ）分别模拟自噬激活或阻断，并与细胞内的表达进行比较附件12仅ORF()。我们发现，ATG12导致了更多更大的早期自噬体形成，包括双层或多层膜()。这一过程更接近于RPMC的激活，而不是CQ的阻断，因为RPMC中自噬体的形态表现为早期-中期，而CQ中则表现为单膜自溶体的晚期()。我们观察到Mir505–3便士通过降低ATG12有效干预自噬体的形成。ATG12的减少可能导致支架组分的短缺，而支架组分是构建正常大小和质量的自噬体所必需的（如)。
Mir505–3便士通过靶向调节自噬附件12。（A） TEM策略中MEF细胞的示例图片和放大图片。如图所示，用构建物转染细胞。转染后两天，对MEF细胞进行不同的处理，如图所示，持续3小时，然后用2.5%戊二醛在PBS中固定。用伪色表示单个自噬体（绿色圆圈，由绿色大写字母“A”和白色箭头表示）线粒体（蓝色圆圈，用蓝色大写字母“M”和黑色箭头表示）。（B） 分别测量每种情况下细胞质单位面积内的自噬体大小。（C和D）分别测量每种情况下细胞质单位面积内的自噬体数量和线粒体数量。误差线为SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（学生t吨测试）。
Mir505–3便士通过抑制ATG12和自噬途径影响线粒体数量。（A至C）免疫印迹法检测附件12ORF、RPMC诱导和CQ诱导条件下的抗体如所示。（D至G）测量（A、B、C）中ATG12、SQSTM1/p62、LC3B-II/-I和MFN2的蛋白质水平。（H） 假设监管机制示意图Mir505–3便士-ATG12轴突发育途径。自噬体的形成包括3个主要步骤：成核、膨胀和成熟。ATG12参与构建自噬体支架所需的ATG12–ATG5-ATG16L1复合物。在发育中的轴突中，ATG12的下调Mir505–第3页结果自噬信号减少，导致局部轴突正调控成分大量储存，线粒体产生更多能量供应，从而促进轴突的规范化、延伸和分支。
在第三代原代培养的MEF中，我们转染GFP-LC3B以监测自噬通量。我们相互过度表达Mir505–第3页模仿或混合Mir505–3便士模拟物和抑制剂，通过RPMC或CQ刺激。一直以来Mir505–3便士模拟减少了ATG12点状结构（图S7A和B）。综上所述，这些结果表明Mir505–3便士通常通过靶向ATG12和损害自噬体的形成来下调自噬。
Mir505-3p增加线粒体数量，同时抑制自噬
在培养的皮层神经元或皮层的TEM图像中mir505型KO小鼠，我们发现线粒体明显减少()。我们进一步发现Mir505–3便士也导致原代培养MEF中线粒体数量的改变()。有趣的是，这种趋势与自噬体的趋势呈负相关(;)。我们通过western blot检测MEF中的ATG12、SQSTM1/p62、LC3B和MFN2（丝裂原融合蛋白2）蛋白，进一步证实了TEM观察结果()。以前有报道称，STK11/LKB1（丝氨酸/苏氨酸激酶11）-NUAK（NUAK家族，SNF1样激酶，1）固定线粒体以实现轴突分支。轴突的发育是一个高能量需求的过程，这需要线粒体遍布神经元，尤其是轴突，以提供大量ATP。31因此，我们假设局部Mir505–3便士在轴突中，抑制ATG12自噬信号，该信号消化底物蛋白和线粒体，然后维持线粒体以促进轴突的分化、延伸和分支()。
讨论
神经元是二元细胞，在体树突状隔室和轴突之间具有结构和功能差异。在体外条件下，分离的皮层神经元延伸出几个突起，这些突起在不对称生长之前仍然是不分青红皂白的，然后一个新生的突起迅速生长，成为轴突。42在轴突分化和伴随的伸长过程中，轴突发生分支。这些过程的干扰被证明会导致神经发育障碍，如自闭症谱系障碍。2发育中的轴突经历细胞器定位，包括细胞骨架结构的剧烈变化，43,44和膜组成。45,46这些过程源于蛋白质合成之间的平衡，47,48和蛋白质降解。49,50
众所周知，轴突和神经末梢含有大量的microRNAs（miRNAs）。51miRNA是一种短的非编码RNA，作为翻译调节因子，影响mRNA降解和翻译抑制。最近的研究表明，miRNAs参与秀丽线虫轴突规范，X·莱维斯视网膜轴突寻路，小鼠轴突在发育过程中的延伸和分支。52,53然而，miRNAs调控轴突发育的详细机制尚待确定。
以前，Mir505–3便士已被确定为肿瘤发生和发展的指标。它被认为是宫颈癌发生的潜在早期诊断标志之一，54滑膜肉瘤局部复发或远处转移的生物标志物，55乳腺癌的预后生物标志物。56此外，米尔505/Mir505–第3页被证明是一种肿瘤阻遏物。它通过诱导耐药乳腺癌细胞MCF7-ADR的凋亡来抑制细胞增殖。57它调节癌基因PSMD10型降低胃癌风险的（蛋白酶体[前体，巨痛]26S亚单位，非ATP酶，10）功能变体58在MEF细胞株ZBTB7A/LRF（含锌指和BTB结构域7a）的控制下，通过靶向SRSF1部分影响衰老和凋亡。36此外，米尔505/Mir505–3便士通过靶向FGF18（成纤维细胞生长因子18）调节血管生成过程，表明米尔505/Mir505–3便士是高血压干预的潜在靶点。59然而，大多数关于米尔505/Mir505–3便士关注增殖和凋亡相关途径和肿瘤相关生理事件米尔505/Mir505–3便士调节潜在的靶基因以调节其他生理效应仍然是难以捉摸的。
首次报道的功能性靶蛋白米尔505/Mir505–3便士在原代培养的MEF细胞中是SRSF1。SRSF1是一种富含丝氨酸/精氨酸的原型蛋白，可调节前体mRNA的组成剪接和选择性剪接。60,61SRSF1也被称为一种癌蛋白，因为它在肿瘤中经常过表达。62,63据报道，SRSF1激活MTOR通路，磷酸化RPS6KB1/S6K1（核糖体蛋白S6激酶，多肽1）和EIF4EBP1（真核翻译起始因子4E结合蛋白1）。64由于MTOR通路负责轴突的生长和再生，因此不可避免地要了解SRSF1是否参与由以下因素引起的轴突生长的促进Mir505–3便士上调监管。因此，我们首先测试了Srsf1系列用qPCR和免疫印迹法检测过表达皮层神经元中SRSF1的蛋白水平Mir505–3便士然而，在mRNA中没有观察到差异()和蛋白质水平（数据未显示）。然后，我们使用一种MTOR抑制剂RPMC来阻断MTOR通路，以确定是否由Mir505–3便士依赖于这一途径。令人惊讶的是，RPMC损害MTOR信号并没有抑制由Mir505–3便士，表明MTOR并不直接参与信号通路（数据未显示）。
在之前的其他研究中，通过用siRNAs抑制ATG7干扰自噬导致轴突总长度增加，但对轴突分支没有影响。65相反，我们的观察表明，通过靶向性下调自噬附件12通过天然抑制分子，Mir505–3便士促进轴突的规范化、延伸和分支。为了说明这一区别，有两种可能。首先，自噬信号以及重要的组成成分，包括ATG12和ATG7，负责轴突的延伸，而其他可能Mir505–3便士尚未发现的靶基因可能会诱导分枝。否则，ATG12参与轴突发育的大部分方面，与ATG7相比，显示出完全不同的调节机制。
极性的建立和轴突分支的调节对神经元在大脑中形成神经回路至关重要。我们发现了Mir505–3便士ATG12为理解微RNA和自噬信号在神经发育中的作用提供了一个新的方向。
材料和方法
质粒和构建物
这个Mir505–第3页（或Mir505–5便士和打乱）siRNA序列被合成为寡核苷酸引物并手动退火。底漆如下：
Mir505–第3页寡头远期：
5′-TGCTGGCGTCAACACTTGCTGGTTCTGTTGGCACTGGACAAAAACCAGTGTACG-3′
Mir505–3便士低聚物反面：
5′-CCTGCGTCAACACTTGTTTCTGTCAGTCAGTGGCCAAAAAAACCAGCAGTTGACGC-3′
Mir505–5便士寡头远期：
5′-TGCTGGGGGAGCAGAGAGAGATAGTGTTTGGCACTGACTACACATCAACATTCCTGGCTCC-3′
Mir505–5便士寡核苷酸反向：
5′-CCTGGGGAGCCAGGAAGTTGATGTCAGTCAGTGGCCAAAAACAACACATCCTGGCTCCCC-3′
加扰siRNA寡核苷酸前向：
5′-tgctgaaatgtactgcgcgtggagacgttttggccactgactgactgactgactccacgcagtacatt-3′
加扰siRNA寡核苷酸反转：
5′-CCTGAAAATGTACTGGTGGAGACGTCAGTCAGTGCAAAACGTCTCCACGCGAGTCTC-3′
这个Mir505–3便士（或Mir505–5便士并将加扰siRNA）序列插入FUGW（Addgene，14883）中，得到Mir505–3便士（或Mir505–5便士和干扰siRNA）质粒。毫米单位-Mir505–3便士模拟物或抑制剂购自GenePharma.com（定制设计）。Mir505–3便士抑制剂是2-甲基化修饰的RNA寡核苷酸，与mmu完全互补-Mir505–3便士并经高效液相色谱纯化。用NEST PCR引物扩增候选靶基因3′UTR的种子匹配区，然后将NEST PCR产物稀释至1:1000作为模板进行3′UTR-区扩增。底漆如下：
附件12嵌套前进：5′-TTGCTTATTCAGGGGACCTC-3′
附件12NEST反向：5′-TGTTCACTCTCTCGCTCA-3′
附件123′UTR正向：5′-TAGGCGATCAGTTGGCAAAGGCTTGAC-3′
附件123′UTR反向：5′-TTGCGCCAGCGGCCCGCAAGAACCAGAAATG-
-ACA-3′
地图2k4嵌套向前：5′-TGCTGGAGAGACCTCA-3′
地图2k4嵌套背面：5′-GTAGGAATTTTGGCTGAGCA-3′
地图2k43′UTR正向：5′-TAGGCGATCAATATTCATGACGCGTGA-3′
地图2k43′UTR反面：5′-TTGCGGCGCGGCGCGCTGCAGAAGCAATGTG-
-TCTC-3′
Srsf1系列嵌套前进：5′-ATCTCGATCGCGAGCCGTA-3′
Srsf1系列嵌套背面：5′-AAACATAAGAACTCCCCAAG-3′
Srsf1系列3′UTR正向：5′-TAGCGGATCGCTTACTCCCCAAGGAGAGCA-3′
Srsf1系列3′UTR背面：5′-TTGCGACAGCGCCCCAAAAGACATGAGGA
自动液位计-3′
机械2嵌套前进：5′-AGCACAGTCAGGTTGAAGACC-3′
机械2NEST反面：5′-TTTTCCTGCATCACACCTC-3′
机械23′UTR正向：5′-TAGGCGATCGCCAGAAGTACTTGCAC-3′
机械23′UTR反面：5′-GGCCGTGCGCAATCCTATTGGGAGT
GG-3′
Abl2公司嵌套前进：5′-GTGCAATCAGCAGATGAAGA-3′
Abl2公司嵌套背面：5′-TGAACAGGCATCACTAGCA-3′
Abl2公司3′UTR正向：5′-TAGGCGATCCTTGGT-3′
Abl2公司3′UTR反面：5′-GGCCGTGCGCAAGCCACTCACATGATTT
TT-3′
财务报告1NEST前锋：5′-AAAATGGCAAACTGCACA-3′
财务报告1NEST背面：5′-ACGGCTAACCTTTGACA-3′
财务报告13′UTR正向：5′-TAGGCGATCTCTTGTACACATCA-3′
财务报告13′UTR反面：5′-GGCCGTGCGCAATTGCAACATA
GCA-3′
拉萨3嵌套向前：5′-ACTACATCCGGCAGCAGTCT-3′
拉萨3NEST反面：5′-CTGCGAGAGAACAGGTTA-3′
拉萨33′UTR正向：5′-TAGGCGATCACTACATCCGGCAGCAGTCT-3′
拉萨33′UTR反面：5′-GGCCGCGCAATTGTAGGACCCGTGTG
AAC-3′
编号2嵌套向前：5′-GGGAGATGTGGAGAAAA-3′
编号2NEST反面：5′-GAATGTGCCATCTCAAGACT-3′
编号23′UTR正向：5′-TAGGCGACAAAAGGAGGAGGTGGCAACA-3′
编号23′UTR反向：5′-GGCCGTGCGCAAGTAGCTCCCTCCCAAG
AG-3′
Bcl11b类嵌套前进：5′-TGGCAAGATGTCTCTTT-3′
Bcl11b类嵌套背面：5′-GTTTCAAGGCACAT-3′
Bcl11b类3′UTR正向：5′-TAGGCGATCGCAAGGAATCTCCGCGTTC-3′
Bcl11b类3′UTR反面：5′-TTGCGCCAGCGCCCTCTGTGCGCAAAAGACAAGA-
-AT-3′
这个附件12将ORF序列插入FUGW以获得附件12ORF质粒。这个附件12ORF序列从第12页从OriGene.com购买的全长cDNA质粒({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“MG200886”，“term_id”：“1270252277”，“term_text”：“MG200886”}}MG200886型)。底漆如下：Atg公司12 ORF正向，5′-GGATCACATGTCTCGGAGAG-3′；和反向，5′-GAATTCTCTCATT
TCTGGCTCATCC-3′。
抗体
本研究使用的抗体如下：山羊抗GFP抗体（1:1000；Abcam，ab5450）、兔抗GFP（1:1000）；泛肾上腺神经丝SMI312（Abcam，ab24574；1:1000）；MAPT/Tau（细胞信号技术，4019；免疫荧光1:1000）；ATG12（细胞信号技术，2011；1:500用于免疫印迹，1:50用于免疫荧光）；LC3（Novusbio，NB100–2220；1:3000）；SQSTM1/p62（Abcam，ab56416；1:1000）；MFN2/Mitousin-2（细胞信号技术，11925；1:1000）；RBFOX3/NeuN（Abcam，ab104225；1:400）；ACTB/β-Actin（细胞信号技术，8457；1:3000）和GAPDH（Abcam，ab8245；1:10000）。与Alexa荧光染料偶联的抗体（Thermo Fisher，山羊抗兔，Alexa Fluor 488，A-11034，1:1000；兔抗羊，Alexa-Fluor 4808，A-21222,1:1000；山羊抗鼠Alexa-Fluor 555，A32727,1:1000，山羊抗兔子Alexa-Fuor 555,1-2143,1:1000）用作二级抗体。
原代细胞培养和转染
在解剖下获得E14.5 C57BL/6小鼠的皮层组织。将组织切碎并用0.125%胰蛋白酶消化（Thermo Fisher，15090046），以生成分离的神经元。66分离的神经元在悬浮状态下用AMAXA Nucleofector（AAD-1001S，德国）在6孔板中电穿孔，或在12孔板中用Lipofectamine 2000脂质感染。对于AMAXA Nucleo-fector电穿孔，我们使用带有Nucleo-ofector Solution缓冲液的AMAXA Mouse Neuron Nucleo-Fector试剂盒来重新悬浮神经元，并在AMAXA nucleo-fector II设备上使用“Mouse，Neuron，0-005”程序，其中神经元存活率超过80%。最佳条件为3×106每个电穿孔细胞含有3μg质粒。对于脂质体2000介导的转染，我们使用了相当少量的质粒和脂质体2000（0.1μg质粒和0.1μl脂质体2000，2×10512孔板中的一个孔中的细胞），以避免脂质内酰胺2000引起的毒性作用。因此，神经元的存活率与未转染的神经元一样高。细胞喂食添加2%B27（Life Technology，17504044）的Neurobastic培养基，并固定在3-5 DIV处进行免疫荧光染色，或在3 DIV处收获用于免疫印迹，或在慢病毒感染后在5或6 DIV处采集用于定量实时PCR分析。本研究中使用的慢病毒是用108或109Obio Technology（上海）的病毒基因组/ml。原代MEF细胞如前所述生成。67分离的MEF细胞在培养皿中培养2代（1代/天）以清除星形胶质细胞，然后接种在低密度的8孔室中（104细胞/孔）。用添加有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基喂养MEF细胞（生命技术，15140122）。MEF细胞在3DIV转染，喂食刺激药物，固定在5DIV进行免疫荧光染色。
定量实时PCR
用酚氯仿法从小鼠皮层神经元提取总RNA。我们使用DNaseI（Sigma，AMPD1）消化提取的总RNA中剩余的基因组DNA，以避免基因组DNA干扰cDNA扩增步骤。通过iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，1708890EDU）从1μg纯化的RNA中通过poly-dT引物合成cDNA。使用SYBR Premix ExTaq（Takara，RR001B）和Rotor-Gene Q仪器（QIAGEN，9001685，德国）进行定量实时PCR。Gapdh公司用于规范化，以提供内部控制。对于成熟的miRNA测试，Mir16–1–5p用于归一化。在特定逆转录之前Mir16–1–5p与其中之一混合Mir505–3便士或Mir505–5便士并经历梯度退火，形成稳定的干环结构。数据分析采用QIAGEN软件中的比较CT方法。如前所述，测量前体和成熟miRNA水平。35
定量实时PCR分析中使用的引物如下：
附件12正向：5′-AGTTGCAAAAAGGTGTGAC-3′
附件12背面：5′-CGCAGAACAAAAATGACA-3′
地图2k4正向：5′-ACATATTCATGACGCGTGGA-3′
地图2k4背面：5′-TGCAGAAGGCAATGTCTC-3′
Srsf1系列正向：5′-TTACTCCCCAAGGAAGCA-3′
Srsf1系列反面：5′-CCAAAGACATGAGGGGAATG-3′
Bcl11b类正向：5′-CAAAGGAATCTCACCCGTTC-3′
Bcl11b类背面：5′-TCTGGGCAAAAGACAGAAT-3′
拉萨3正向：5′-ACTACATCCGGCAGCAGTCT-3′
拉萨3背面：5′-TTGGTAGGACCGCGTGAACC-3′
编号2正向：5′-AAAAAGAGGAAGGAGGTGGCAACA-3′
编号2背面：5′-GTAGCTCCCCTTCCCAAGAG-3′
消融2正向：5′-CTACATGCTCGGCTTTTGGT-3′
Abl2公司背面：5′-GCCACTCACACATGATTTT-3′
财务报告1正向：5′-TTGGTACCTTGCACACATCA-3′
财务报告1背面：5′-TTGCATCAACATCAATTAGCA-3′
机械2正向：5′-GGCAGAGTAGCTTTGCAC-3′
机械2背面：5′-TCCTTCAGATTGGGAGTTGG-3′
505年3月前正向：5′-CGCGGAGCAGAGAGAGATAT-3′
505年3月前背面：5′-TGGCGGAAAAACCAGAAG-3′
Mir505–3便士RT:5′-GCGTCCAACTGGTGTGGAGTCGGCAATTCAGTTG-
-AGACGCAGAAAACCAGC-3′
Mir505–第3页正向：5′-GCGACCGTCAACACACT-3′
Mir505–3便士背面：5′-TGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′
Mir505–5便士RT:5′-GTCGATCGAGTGCAGGGTCGGAGTATTCGCACT
GGATACGACACACATC-3′
Mir505–5便士正向：5′-GCCCGGGGAGCCAGGAAGTAT-3′
Mir505–5便士背面：5′-CAGGGTCCGAGGTATTCGCAC-3′
Mir16–1–5pRT（右）：
五′-GTCGTATCGAGTGCAGGGTCGAGGTATTCACTGGATAC
GACCGCCAA-3′
Mir16–1–5p正向：5′-CGCGCTAGACGTAAAAT-3′
Mir16–1–5p背面：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′
轴突和小神经突分析
我们将长度超过神经元胞体平均直径5倍的SMI312和MAPT阳性过程定义为轴突。其余的突起被定义为小突起（图S8F）。测量轴突或小轴突形态的实验是在读者不知情的情况下进行的，样品鉴定如下：简言之，有3人参与了这项分析。转染后，样本由人A随机标记和记录（图S8A）。然后，B人用显微镜（日本MBA75020，尼康80i）捕获随机选择的目标神经元（图S8B）（图S3C）。为了进行图像采集，使用20×或40×物镜以适当的曝光时间对整个神经元进行成像。轴突或小轴突形态分析由人员C进行（图S8D）。最后，来自每个程序的数据相互匹配，以生成最终数据（图S8E）。使用斐济软件分析所有过程的总长度或分支数。所有量化指标均由一名学生测试t吨测试并用SEM表示。如果P（P）< 0.05. 至少进行了3项独立实验。
宫内电穿孔
E14.5 C57BL/6小鼠根据先前报告的方法用于宫内节育器。68用0.7%戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉怀孕小鼠。使用无菌技术暴露子宫。FUGW空质粒，Mir505–3便士-FUGW质粒和第12页ORF质粒Mir505–3便士-将FUGW质粒（2μg/μl）通过显微注射注入胚胎侧脑室，以Fast Green（2 mg/ml；Sigma，F7252）表示。电脉冲由T830电穿孔器（BTX Molecular Delivery Systems，Holliston，MA，USA）产生，并对每个胚胎重复5次30 V，持续50 ms，间隔1秒。灌注后，69在荧光解剖显微镜（日本MBA75020，Nikon 80i）下选择大脑，仅保留那些EGFP表达的大脑进行进一步免疫荧光染色。
荧光素酶检测
将包含候选靶基因种子匹配区的～200-bp序列插入雷尼利亚双核糖核酸酶载体psi-CHECK-2的荧光素酶报告基因，带有重组反应试剂盒（Novoprotein.com，NR001）。psi-CHECK-2双酶试剂盒购自Promega.com（E1910）。这种结构（0.3μg）和Mir505–3便士-将含载体（0.7μg）在12孔板上共转染人胚肾293细胞。转染后20小时，用裂解缓冲液在低温条件下收集细胞。使用Berthold检测系统Sirius（德国）检测荧光素酶活性。
透射电镜分析
MEF细胞在磷酸盐缓冲液（PBS；Corning，R21–040-CV）中用2.5%戊二醛固定后刮除并收集。细胞离心至试管底部，然后用琼脂包埋细胞。琼脂切成1毫米三在PBS中用1%的锇酸对样品进行进一步处理，并用酒精梯度脱水。样品用环氧丙烷（国药集团化学试剂，80059118）和树脂（电子显微镜科学，14900）的混合物处理，然后用纯树脂包埋。然后用金刚石钻头将样品切片。对于皮层组织样品，用1%戊二醛和4%多聚甲醛在PBS中灌注P0小鼠。然后解剖皮层，并用与MEF细胞相同的策略处理样品。对于培养的神经元，将神经元接种在预先涂有聚-D-赖氨酸的玻璃上。注意确保神经元不被刮伤，以保持单个神经元的自然形态。用锋利的眼钳将生长神经元的玻璃取出，放入12孔板中进行进一步治疗。用透射电子显微镜（Nippon Tekno，JEOL-1230，Japan）捕获随机选择的靶细胞。
CRISPR/Cas9-based mir505敲除小鼠
根据小鼠的编码序列设计了两个sgRNAs（sgRNA1:ccagttagtgcaacacttgct，sgRNA2:acacttgttttctctgg）米尔505基因()。用引物（Genotyping-F:ACAAACAGAATCCACGAACTG，Genotyping-R:CGGTAGTAAATTGATGCACCA CCA）扩增sgRNAs定向位点等区域，以区分Mir505–3便士-从异基因缺失小鼠和野生型同窝小鼠中分离出缺失小鼠，并用引物（Seq-F:TAGGAGCA TGGGAGAGATGC，Seq-R:GGCTTCTACCCTGGTGATCTACGG）进行扩增以进行测序。将两种sgRNAs注射到小鼠受精卵中。我们排除了mir505型来自CRISPR/Cas9系统的KO小鼠。首先，我们使用Off-Spotter系统进行生物信息学分析70并将潜在的非靶基因分为3类（见表S2），包括内含子、外显子UTR和外显子编码区的潜在非靶位点。然后，我们重点研究了编码区中包含非靶点的基因。我们设计了引物来扩增非靶点的近端区域，然后进行测序（见表S2和图S5A和B）。我们使用WT小鼠作为对照，在所有3只创始人小鼠（编号为#12、#17和#19）中检测了这些位点。事实上，在所有创始人中都没有观察到这些位点的序列改变。因此，在mir505型KO小鼠。预测的非靶基因和特异扩增引物如表S2所示。
统计方法
学生t吨如图图例所示，本研究中使用了测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001.
