国际分子医学杂志。2016年5月；37（5）：1209-1220。
人扁桃体间充质干细胞的肌源性分化潜能及其促进骨骼肌再生的潜能
,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,4 ,2 ,5和1
SAEYOUNG公园
1韩国首尔Ewha Womans大学医学院生物化学系，邮编：07985
YOONYOUNG CHOI（周永英）
1韩国首尔Ewha Womans大学医学院生物化学系，邮编：07985
纳梅·郑
1韩国首尔Ewha Womans大学医学院生物化学系，邮编：07985
YEONSIL YU公司
2韩国首尔Ewha Womans大学医学院分子医学系，邮编：07985
京哈RYU
三韩国首尔Ewha Womans大学医学院儿科，邮编：07985
韩素金
4韩国首尔Ewha Womans大学医学院耳鼻咽喉头颈外科，邮编：07985
INHO JO公司
2韩国首尔Ewha Womans大学医学院分子医学系，邮编：07985
BYUNG-OK CHOI公司
5韩国首尔成均馆大学三星医学中心神经病学系，邮编：06351
孙卓荣
1梨花女子大学医学院生物化学系，韩国首尔07985
1韩国首尔Ewha Womans大学医学院生物化学系，邮编：07985
2韩国首尔Ewha Womans大学医学院分子医学系，邮编：07985
三韩国首尔Ewha Womans大学医学院儿科，邮编：07985
4韩国首尔Ewha Womans大学医学院耳鼻咽喉头颈外科，邮编07985
5韩国首尔成均馆大学三星医学中心神经病学系，邮编：06351
通信地址：韩国首尔07985，Yangcheon-gu，Anyangcheon-ro，1071，Ewha Womans大学医学院生物化学系Sung-Chul Jung博士，电子邮箱：rk.ca.ahwe@csgnuj 2015年11月7日收到；2016年3月11日接受。
摘要
干细胞被认为是一种重要的细胞来源，可用于促进因先天性疾病、创伤或肿瘤切除导致肌肉组织组织缺陷而受损的骨骼肌（SKM）的再生。尤其是间充质干细胞（MSCs），需要较少的侵袭性采集技术，是干细胞治疗的宝贵细胞来源。在本研究中，我们证明了人扁桃体来源的MSCs（T-MSCs）可以分化为肌源性细胞在体外移植人T-MSCs生成的成肌细胞和肌细胞可以调节肌肉功能的恢复体内为了诱导肌源性分化，将T-MSC衍生的球体培养在添加1 ng/ml转化生长因子-β的Dulbecco改良Eagle's培养基/营养混合物F-12（DMEM/F-12）中，非必需氨基酸和胰岛素-转铁蛋白-硒培养4天，然后在肌生成诱导培养基[含2%胎牛血清（FBS）和10 ng/ml胰岛素样生长因子1（IGF1）的低糖DMEM]中培养14天。T-MSCs依次分化为成肌细胞和骨骼肌细胞，骨骼肌生成相关标记物[包括α-肌动蛋白、肌钙蛋白I型1（TNNI1）和肌生成素]的表达增加以及肌管的形成证明了这一点在体外. The就地步态评估（足迹分析）表明，将T-MSCs移植到右侧腓肠肌部分切除的小鼠体内可以增强肌肉功能，并恢复SKM的形状，而不会形成畸胎瘤。因此，T-MSCs可以分化为肌源性细胞，并在损伤后有效再生SKM。这些结果证明了T-MSCs在促进创伤后SKM再生方面的治疗潜力。
关键词：人扁桃体衍生间充质干细胞、骨骼肌、分化、再生、干细胞治疗
介绍
利用干细胞进行了许多研究，以治疗肌肉相关疾病，其中肌肉组织的组织受到先天性遗传性肌肉缺陷、肌肉质量损失、创伤或肿瘤切除的不利影响(1–5). 先前的研究报道了在肌肉损伤模型中移植肌肉干细胞衍生的成肌细胞或肌原细胞(6–8). 然而，研究人员面临的主要问题是，由于产生肌肉干细胞所需的培养期，很难获得移植到损伤部位所需数量的细胞。一些研究小组已经报道了胚胎干细胞的分化，并将多能干细胞诱导为肌源性细胞(4,9,10). 然而，ES和iPS细胞的临床应用存在主要障碍，包括畸胎瘤的形成和免疫系统对移植细胞的排斥。与这些细胞相比，间充质干细胞（MSCs）具有调节免疫系统的能力，不会形成畸胎瘤，可以从各种来源分离出来，包括骨髓(11)，脂肪组织(12)、脐带血(13)，羊水(14)，胎盘(15)、牙髓(16)，扁桃体(17)和尿液(1). 由于这些原因，MSC已被认为是一种有价值的细胞来源，其可用于根据分化方案繁殖成肌细胞。一些研究已经报道了利用脂肪组织、骨髓、胎盘、羊水、脐血和尿液中的MSC来检测MSC向肌源性细胞的分化(1,2,11–14,18).
扁桃体是一种新发现的MSCs来源，可能具有潜在的治疗应用。扁桃体衍生MSCs（T-MSCs）容易分化为中胚层谱系细胞，包括脂肪、软骨和骨细胞，以及内胚层谱统细胞，包括肝细胞(19–21). T-MSCs也表现出与骨髓来源MSCs和脂肪组织来源MSCs相似的免疫抑制特性(22,23). 由于扁桃体组织在手术后被丢弃，从这些丢弃的组织中分离出干细胞也是回收人体组织用于干细胞治疗的一种有价值的方法(23,24).
骨骼肌（SKM）具有生长能力以应对增加的工作量或在受伤的情况下自我修复。肌肉纤维的出生后生长、修复和维持依赖于肌肉干细胞的数量(25)位于肌纤维基膜下方。然而，广泛的肌肉损伤可能会阻碍完全再生，尤其是在功能恢复方面。与健康肌肉组织的丧失和纤维瘢痕组织的发展相关的严重病变，以及长期外周神经损伤后不可逆的肌肉萎缩，都是再生受限的情况(5). 作为受损SKM再生的替代方法，被认为是某些创伤或退行性疾病的最佳治疗方法(26)移植T-MSC源性肌细胞是限制受累肌肉萎缩的合适方法，甚至可能导致肌细胞再生和减少运动障碍。
在本研究中，我们证明T-MSCs可以分化为肌源性细胞在体外移植人T-MSCs产生的成肌细胞和肌细胞可介导损伤后肌肉功能的恢复体内免疫细胞化学、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和western blot分析证实了T-MSC衍生肌源性细胞的发育在体外此外就地步态评估（足迹分析）表明，将T-MSCs移植到右侧腓肠肌部分切除的小鼠体内，可以增强肌肉功能。这些结果表明，人类扁桃体是一种有希望的干细胞来源，T-MSCs可用于促进创伤后SKM的再生。
材料和方法
道德声明
韩国首尔Mokdong医院Ewha Womans大学机构审查委员会批准了本研究中使用的所有实验程序（批准号ECT-11-53-02）。在获取组织样本之前，获得每位患者和/或其法律代表的知情书面同意。动物护理和实验程序由Ewha Womans大学医学院动物护理和使用委员会（ESM编号14-0285）批准，所有实验均按照批准的指南和法规，即韩国卫生和福利部的指南进行，《Ewha Womans大学医学院动物护理指南》和《美国国家研究委员会实验室动物护理和使用指南》(27).
动物
七周龄雄性C57BL/6小鼠（n=40；体重21–24 g；韩国Eumseong Dae-Han Biolink Co，Ltd），在21±2°C和55±5%湿度下，光/暗循环12小时，并提供食物和水随意用于所有实验。给小鼠喂食高压灭菌食物，并提供水随意所有小鼠均按照上述指南进行治疗。每组至少使用10只年龄匹配的小鼠。这些动物被一氧化碳杀死2吸入。
T-MSCs的分离
如前所述，从扁桃体组织中分离T-MSCs(17,28). 简单地说，扁桃体组织是在扁桃体切除术中从患者身上采集的，随后在含有210 U/ml I型胶原酶（均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英维特罗根）和DNA酶（10µg/ml，美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。细胞通过细胞过滤器（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）后，通过Ficoll-Paque（GE Healthcare，Chalfont St.Giles，UK）密度梯度离心获得单核细胞。细胞在37°C的低糖DMEM中培养48小时，DMEM含有10%的胎牛血清（FBS；Invitrogen）和1%的青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich），并在含有5%CO的湿化室中培养2然后去除非粘附细胞，并在新鲜培养基中培养T-MSCs。这些新鲜培养的细胞经过3-5代扩增，这一过程大约需要4周。
T-MSCs的成脂、成骨和成软骨分化
如前所述，诱导T-MSCs的中胚层分化(17)稍作修改。简言之，为了诱导成脂分化，将T-MSCs在市售成脂培养基（Invitrogen）中培养3周。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟，然后用PBS洗涤并在室温下使用2%油红O（Sigma-Aldrich）染色1小时。再次用PBS洗涤T-MSC。在显微镜下观察细胞内脂滴（IX2-SLP；Olympus，Tokyo，Japan）。为了量化脂质积累，用100%异丙醇洗脱细胞中沉积的油红O 10分钟，并使用ELISA微孔板阅读器（BN03269，VersaMax；Molecular Devices，San Jose，CA，USA）在540 nm波长下测量洗脱液的吸光度。
为了诱导成骨分化，将T-MSCs在商用成骨培养基（Invitrogen）中培养3周。此后，用PBS冲洗细胞两次，在室温下用4%PFA固定15分钟，用2%茜素红S（Sigma-Aldrich）染色1小时。用PBS再冲洗细胞2次后，在相控显微镜下观察细胞外基质钙化（IX2-SLP；Olympus）。为了量化钙沉积，将细胞与10%十六烷基氯化吡啶孵育10分钟，以提取茜素红S。收集洗脱液，并使用ELISA微孔板阅读器（BN03269，VersaMax；Molecular Devices）在570 nm波长下测量吸光度。
为了诱导软骨生成分化，在商用软骨生成诱导培养基（Invitrogen）中刺激T-MSCs 3周。随后，用PBS冲洗细胞，并在室温下将其固定在4%PFA中15分钟。清洗后，细胞在室温下用1%阿尔西安蓝（Sigma-Aldrich）染色1h，并去除多余的染料。随后，用0.1 N HCl再次冲洗细胞，并在相控显微镜下观察软骨生成细胞（IX2-SLP；奥林巴斯）。为了量化阿尔西安蓝染色的强度，用400溶解细胞µ1%十二烷基硫酸钠。在605nm的波长下读取吸光度。
肌源性分化
为了诱导T-MSCs的肌源性分化，3–4×106将细胞放置在15厘米的培养皿中，在低糖DMEM中加入10%的FBS。在1-3天时，细胞自发聚集形成50–100个球体µ直径为m。球体形成后，用补充有1 ng/ml转化生长因子-β（TGF-β；R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）、非必需氨基酸（NEAA；Invitrogen）和胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS；Gibco Life Technologies，美国纽约州格兰德岛）的DMEM/营养混合物F-12（DMEM/F-12；Invit罗gen）替换培养基再延长4天，以便分化为成肌细胞。当将T-MSCs转移到上述成肌细胞分化培养基中的胶原蛋白涂层培养皿中时，T-MSCs从球体中生长出来，并形成玫瑰花状扩散。为了诱导最终分化为心肌细胞，将成肌细胞培养在肌原诱导培养基中2周，该培养基由含有10 ng/ml胰岛素样生长因子1（IGF1；R&D Systems）和2%FBS的低糖DMEM组成().
人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）肌源性分化示意图。（A） 未分化的T-MSCs被诱导形成约50–100的（B）球体µ培养皿上直径为m。（C） T-MSCs在移植介质中转移到胶原蛋白涂层培养皿时从球体中生长出来，形成玫瑰花状扩散。（D） 将被镀细胞在成肌诱导培养基中培养2周，并改变其形态；他们相互融合以产生新生的肌管。原始放大倍数，×40。lgDMEM，低血糖DMEM；NEAA，非必需氨基酸；ITS，胰岛素-转铁蛋白-硒。
逆转录聚合酶链反应
使用RNeasy Mini试剂盒从细胞中提取总RNA（美国马里兰州日耳曼镇齐根）。使用SuperScript II（Invitrogen）和oligo-（dT）20引物在42°C下合成互补DNA（cDNA），然后在72°C下孵育15分钟。使用预混合试剂盒（Bioneer，大田，韩国）扩增cDNA的靶序列在以下条件下：95°C下初始变性5分钟，然后在95°C条件下进行35个周期的变性30秒，在45–60°C下退火45秒，在72°C下延伸44秒。在1.5%琼脂糖凝胶上分离标准化量的产品，并通过溴化乙锭染色进行可视化。使用的正向和反向引物序列如下：Krüppel-like factor 4(Klf4型)正向，5′-CCCGAGCAGCATGCAGCCAGACACAGTC-3′，反向，5′-CTGGCTGCTCTCCTCATCG-3′；雷克斯1正向，5′-CAGATCCTAAACAGCTCCGCA-3′，反向，5′-GCGTAGCAAATTAAAGC-3′；激活素正向，5′-AGAGCGACCTCACAGCGTGCTGG-3′，反向，5′-CCGGAGGTAGCGTTGACCT-3′；配对框7(第7页)正向，5′-CACTGTGACCGAAGCATGT-3′，反向，5′-GTCAGGTCCAATCAT-3′；肌生成因子6(我的6)正向，5′-AGGAACCCACGAAAAGT-3′，反向，5′-TTGAAACAGCGCAAAAGA-3′；肌生成素正向，5′-GTCTCGCCGGGCATCCTTG-3′，反向，5′-GAGCTGGGCATACACGGGG-3′；肌营养不良蛋白正向，5′-ACCACCTCTGCTACG-3′，反向，5′-GCAATGTCCTCCAGCAA-3′；和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）正向，5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，反向，5′-CCTGCTTCACCCTTG-3′。
免疫细胞化学
将在盖玻片上生长的细胞在室温下固定在4%（v/v）PFA（Sigma-Aldrich）中15分钟或在4°C下过夜。在PBS中冲洗后，固定细胞被渗透，并使用2%牛血清白蛋白（Bovogen Biologicals，East Keilor，VIC，Australia）在0.1%吐温-20/PBS中阻断非特异性表位，然后在室温下在稀释的一抗中培养1小时或在4°C下过夜。在PBS中清洗3次后，样品在室温下与PBS中稀释的二级抗体孵育1小时。然后使用含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）的Vectashield安装介质安装制备的样品图像是在荧光显微镜下拍摄的（日本东京尼康公司）。所用抗体的制造商和目录号（分类号）如下：小鼠抗CD34（分类号SC-74499；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）、兔抗Pax7（分类号ab187339；Abcam，Cambridge，UK）、鼠抗结蛋白（分类号D1033；Sigma-Aldrich）、兔抗肌营养不良蛋白（分类编号ab15277；Abcam）、，小鼠抗肌球蛋白重链（MHC，分类号MAB4470；研发系统）、兔抗α-肌动蛋白（分类号PA5-17308；澳大利亚维多利亚州斯科尔斯比赛默飞世尔科学公司）、兔抗血清蛋白I型（TNNI1；分类号NBP1-90923；美国科罗拉多州利特尔顿诺夫斯生物制品公司）、小鼠抗肌生成素（分类号ab1835；抗体）（初级抗体），和四甲基罗丹明（TRITC）结合的Alexa-568山羊抗鼠IgG（目录号A-11031）、异硫氰酸荧光素（FITC）结合的Alexa-568羊抗鼠Ig G（目录编号A-11004）和TRITC结合的Alexa-568山羊抗兔IgG。
蛋白质印迹分析
在补充有磷酸酶抑制剂鸡尾酒溶液（韩国哈南Dawinbio）的Pro-Prep缓冲液（韩国Seongnam，iNtRON Biotechnology）中溶解细胞后，使用Bradford分析试剂（美国加利福尼亚州Hercules，Bio-Rad Laboratories）测定蛋白质浓度。用冰镇PBS清洗细胞，并将其暴露于补充有磷酸酶抑制剂鸡尾酒溶液的Pro-Prep缓冲液中30分钟。通过在4°C下以12000×g离心10分钟来去除不溶性材料。蛋白质（30-80µg） 通过7.5–13.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯或硝化纤维膜上（Millipore，Billerica，MA，USA）。在室温下，用5%脱脂牛奶在含有0.1%吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水中封闭膜2小时。然后在4°C下用一级抗体将斑点培养过夜。用于western blot分析的抗体为兔抗α-肌动蛋白（分类号PA5-17308）（均来自赛默飞世尔科技公司）、小鼠抗结蛋白（分类编号D1033）和小鼠抗α-SMA（分类编号A2547）（均来源于Sigma-Aldrich公司）、兔抗TNNI1（分类号NBP1-90923；Novus Biologicals）和鼠抗肌生成素（分类号ab1835；Abcam）。用TBST清洗印迹3次5分钟，然后在室温下与辣根过氧化物酶标记的二级抗体孵育1小时。山羊抗鼠IgG（1:2500，分类号SC-2005；Santa Cruz Biotechnology）和山羊抗兔IgG，分类号7074；Cell Signaling Technology，Beverley，MA，USA）用作二级抗体。在额外清洗后，使用WESTSAVE Gold western blot检测试剂盒（韩国首尔Young In Frontier有限公司）检测信号。通过将膜暴露于发光图像分析仪（LAS-3000；日本东京富士胶片公司），可以观察到蛋白质信号。每个蛋白的表达水平均归一化为GAPDH（Sigma-Aldrich）的表达水平。使用ImageJ软件对结果进行量化（1.48 V；Wayne Rasband，NIH，美国）。
骨髓间充质干细胞的小鼠移植
手术是在全身麻醉下进行的，使用Zoletil 50（Virbac，Carros，法国）和Rompun（Bayer Korea，首尔，韩国）的混合物，比例为3:1，腹腔注射1 ml/kg。如前所述，为了建立肌切除模型，我们从每只小鼠中取出0.5×1.0 cm的腓肠肌部分（40–60 mg），以形成缺损(5). 这是通过用9号手术刀撕裂右侧肌肉的外侧来完成的。诱导肌肉损伤48小时后，1×106PBS中的T-MSCs/T-MSC衍生心肌细胞（100µl个）或单独PBS（100µl、 肌肉注射到腓肠肌受损部分的中点。PBS处理小鼠作为载体处理组（载体）。一组正常（未受伤）小鼠也被用作对照。共有5组，每组8只小鼠：正常组、损伤组、车辆治疗组、T-MSC注射组和T-MSC-myocyte注射组。在移植后48小时、7天、4周和8周处死小鼠，获取组织进行免疫组织化学分析。
免疫组织化学
为了进行免疫组织化学，将小鼠腓肠肌固定在10%甲醛中。在4°C下固定约24小时后，在室温下用PBS清洗肌肉。清洗后的肌肉在分级乙醇系列中脱水，用二甲苯清除，并用石蜡包埋。这些块被分成5块-µm厚系列截面。将切片组织放在显微镜载玻片上。在0.1%Triton X-100/PBS中使用3%牛血清白蛋白阻断非特异性表位，然后在室温下与适当的一级抗体孵育1小时。在0.1%Triton X-100/PBS中清洗3次后，在室温或4°C下将样品与二级抗体孵育1小时过夜。使用含有DAPI（Vector Laboratories）的Vectashield贴装介质贴装组织，并在荧光显微镜（Nikon Corp.）下拍摄图像。所用抗体的制造商和目录号如下：兔抗肌营养不良蛋白（类别号ab15277；Abcam）、小鼠抗α-SMA（类别号A2547；Sigma-Aldrich）、兔抗TNNI1（类别号NBP1-90923；Novus Biologicals）（一级抗体）、Alexa-568山羊抗鼠IgG（类别号A-11031）、，和Alexa-568山羊抗兔IgG（目录号A-11057）（均来自Life Technologies）（二级抗体）。
通过足迹分析进行步态评估
每只老鼠每只后脚的底部都涂上了无毒墨水，老鼠可以在白纸上穿过一个小隧道。如前所述测量步幅长度（两个后爪印之间的距离）(29,30)移植后1、2、3、4和8周。然后使用非配对Duncan检验比较正常组、受伤组、车用治疗组和T-MSC-myocyte移植组小鼠的步长。
再生的形态学评估
使用相机（Galaxy Note 2 SHV-E250S相机；韩国首尔三星）从受伤组和移植组的小鼠上获取腓肠肌的照片，并存储为800万像素的背照传感器。形态再生的评估标准是任何损伤迹象消失，伤口充满肌肉。
统计分析
结果以平均值±平均值的标准误差（SEM）表示。使用Duncan检验和GraphPad Prism软件5.01（GraphPad software，Inc.，San Diego，CA，USA）进行统计比较，以确定各组之间的显著差异。P值<0.01–0.05被认为表明存在统计显著性差异。所有实验至少进行了3次。
结果
来源于T-MSCs的肌源性细胞
以前有报道称T-MSCs具有MSCs的特征(17,21). 在我们的研究中，发现T-MSCs分化为3种不同的细胞类型，即脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞(). 为了诱导肌源性分化，T-MSCs()允许形成约50–100的球体µ培养皿上直径为m(). 当将T-MSCs转移到置换培养基中的胶原蛋白涂层培养皿中时，T-MSCs从球体中生长出来，并形成玫瑰花状扩散(). 将电镀细胞培养2周，使其最终分化为心肌细胞(). 细胞的培养在体外在含有10 ng/ml IGF1和2%FBS的低血糖DMEM中持续2周后，成肌细胞的形态发生改变；他们相互融合以产生新生的肌管(). 在肌源性分化过程中的每一步对4片切片进行定量分析，分别计数Pax7和α-肌动蛋白阳性细胞。
扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）向中胚层谱系分化潜能的建立。通过油红O、茜素红S染色和阿尔西安蓝分别测定，T-MSCs容易分化为（A）脂肪细胞、（B）成骨细胞和（C）软骨细胞。
T-MSCs在诱导肌源性分化的条件下表达肌肉相关基因
我们进行RT-PCR以确定T-MSCs是否能够表达肌源性标记物并进行肌源性分化在体外肌发生伴随着肌生成标记物的诱导，包括肌生成素和肌营养不良蛋白，而牺牲了多能性耦合基因(31–33)表明T-MSCs已分化为肌源性细胞。特别是，我们发现第7页和我的6，通过调节肌肉前体细胞增殖在肌生成中发挥作用(34)，已经在未分化的T-MSCs中表达(). 这些结果表明，T-MSCs具有肌源性前体细胞的特征。多功能标记的mRNA表达水平，即Klf4、Rex1、和激活素在未分化的T-MSCs和成肌细胞中上调，其增殖能力高于肌原细胞。Western blot分析显示分化期结蛋白和α-SMA的表达水平较高(; 车道b和c）。α-肌动蛋白在分化的各个阶段的表达相似(). 骨骼肌生成标记物TNNI1和肌生成素在成肌细胞和肌细胞中的表达相似(; 车道b和c）。与这些结果一致，多核结构的免疫染色揭示了结蛋白、α-肌动蛋白、TNNI1和肌生成素的存在(). 这些结果表明，T-MSCs具有肌源性前体细胞的特征，并且具有较高的肌源性分化能力。
扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSC）衍生肌源性细胞中肌源性标记物的检测。（A） 测定多能性和肌源性标记的mRNA表达水平。从（a区）未分化的T-MSCs、（b区）以玫瑰花瓣样扩张球培养的T-MSC衍生成肌细胞和（c区）终末分化的T-MSC衍生肌细胞中分离出mRNA，并用RT-PCR检测细胞。（B） 肌源性诱导过程中T-MSCs中肌源性标记物的蛋白表达水平（通道a，T-MSCs；通道B，T-MSC-derived myoblasts；通道c，T-MSC-derived monocytes）。测量GAPDH水平作为负荷控制。使用ImageJ软件量化带强度。数据为一式三份实验的平均值±SEM。*P＜0.05；**P＜0.01。Klf4，类Krüppel因子4；Pax7，配对盒7；Myf6，肌生成因子6；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；TNNI1，肌钙蛋白I 1型；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。
肌源性标记物的免疫细胞化学检测。肌源性诱导过程中扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）中肌肉相关蛋白的表达通过使用肌源性卫星细胞抗体（a组，CD34；红色）、前体[b组，配对框7（Pax7）；绿色]、，分化成肌细胞[面板c，结蛋白（红色）；面板d，肌营养不良蛋白（绿色）；面板e，肌球蛋白重链（MHC；红色）]，骨骼肌原细胞[面板f，α-肌动蛋白（绿）；面板g，肌钙蛋白I型1（TNNI1；绿）；板h，肌原蛋白（红）]。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染。样品在荧光显微镜下使用适当的过滤器进行分析。（A） 未分化T-MSCs表达（A组）CD34和（b组）Pax7，但没有其他肌源性细胞标记物。（B） 分化成成肌细胞后，80-90%的细胞表达（c组）结蛋白、（d组）肌营养不良蛋白和（e组）MHC，20-50%的细胞表达骨骼肌（SKM）标记物，包括（f组）α-肌动蛋白、（g组）TNNI1和（h组）肌生成素。（a组）CD34和（b组）Pax7在T-MSC衍生成肌细胞向T-MSC派生肌细胞分化过程的任何阶段均未表达。（C） 与T-MSC来源的成肌细胞相比，T-MSC源性心肌细胞（C至h组）肌源性和SKM细胞标记物的表达增加，并形成多核肌管。异硫氰酸荧光素；TRITC，四甲基罗丹明异硫氰酸盐。原始放大倍数，×200。
肌源性标记物的体外免疫染色检测
为了确定球体内细胞和T-MSCs的表型，并测量MSCs分化为SKM细胞的先天能力，我们将球体重新放置在盖玻片上，以便分化为成肌细胞和骨骼肌细胞，并将其依次培养在肌细胞分化培养基中(). 然后将这些细胞固定，并用抗体标记肌源性卫星细胞（CD34）、前体细胞（Pax7）、分化肌源性细胞（结蛋白、肌营养不良蛋白和MHC）和骨骼肌源细胞（α-肌动蛋白、TNNI1和肌生成素）的标记物。尽管CD34（红色）和Pax7（绿色）在未分化的T-MSCs中表达(a、b组），肌源性细胞和骨骼肌细胞的标记物均不存在。这些结果表明T-MSCs具有预先存在的成肌特性。分化成成肌细胞后，80-90%的细胞表达结蛋白（红色）、肌营养不良蛋白（绿色）和MHC（红色）(、面板c至e和)20–50%的细胞表达SKM标记物[（α-肌动蛋白（绿色）、TNNI1（绿色）和肌生成素（红色）](、面板f至h和). 相比之下，在T-MSC衍生成肌细胞向T-MSC派生肌细胞分化的过程中，肌源性卫星细胞和前体细胞的标记CD34和Pax7没有表达(面板a和b）。此外，与T-MSC来源的成肌细胞或未分化的T-MSC相比，T-MSC源性心肌细胞的肌源性和SKM标记物的表达增加(，面板c至h）。
免疫荧光染色定量证实，在肌源性分化过程中，肌源性标记物的表达，表明T-MSCs形成成肌细胞的分化潜能。数据为平均值±SEM。对于每种条件，使用4张幻灯片进行定量。图表示3个独立实验的多次测试的平均值。
体外分化过程中肌原细胞群发生的变化
为了证明T-MSCs在骨骼肌分化中的潜力，Pax7的数量+和α-肌动蛋白+在分化过程的每个阶段对细胞进行计数(). Pax7的比例+分化前肌源性卫星细胞和前体细胞中的细胞占39.9%，而Pax7的比例+T-MSC衍生成肌细胞和肌细胞中的细胞<1%(). 此外，含有SKM结构蛋白α-肌动蛋白的细胞百分比+在成肌细胞和肌细胞中分别为5.2%和34.5%。然而，α-肌动蛋白的比例+未分化T-MSCs中的细胞<1%().
从人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）衍生成肌细胞。（A） 通过使用针对配对盒蛋白7（Pax7；绿色）或α-肌动蛋白（绿色）的一级抗体进行免疫染色，评估T-MSCs在肌生成诱导过程中肌生成蛋白的表达。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染。样品在荧光显微镜下使用适当的过滤器进行分析。（B） 免疫荧光定量证实，在肌源性分化过程中，Pax7和α-肌动蛋白的表达分别减少或增加，表明T-MSCs分化为心肌细胞的潜能。数据为平均值±SEM。对于每种情况，使用4张载玻片进行量化。图表示三个独立实验的多次测试的平均值，*P<0.05。异硫氰酸荧光素。原始放大倍数，×200。
T-MSCs参与体内SKM再生
我们分析了T-MSC移植的效果，以评估移植后2天、1周、4周和8周小鼠受损肌肉的再生情况。受伤小鼠和PBS注射（车用治疗）对照小鼠的肌肉在第2天到第4周未显示α-SMA（绿色）的表达(); 然而，α-SMA在8周时表达水平较低()移植后。在注射T-MSC源性心肌细胞的小鼠肌肉中，1-8周时观察到α-SMA的高表达()而T-MSC注射肌肉中α-SMA的表达在4-8周时较低()移植后。在受伤小鼠和车辆治疗小鼠的肌肉中，肌营养不良蛋白（红色）的表达很少()而在移植后2天，注射T-MSCs和T-MSC衍生心肌细胞的小鼠肌肉中检测到肌营养不良蛋白的表达(). 肌营养不良蛋白是一种位于肌膜之间的蛋白质，支持肌肉纤维的强度，而肌营养不良素的缺乏可降低肌肉僵硬(35). 这些结果表明，T-MSC衍生的心肌细胞促进了新形成的肌纤维的生成，这些肌纤维在移植后1周表达α-SMA和肌营养不良蛋白。此外，随着再生过程的进行，移植后人类SKM肌钙蛋白基因TNNI1（红色）的表达增加(). 特别是，与T-MSCs相比，T-MSCs衍生的心肌细胞移植后观察到TNNI1的染色更强烈(). 与α-SMA和肌营养不良蛋白类似，TNNI1在受伤小鼠和车辆治疗小鼠的肌肉中的表达最低().
人类扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）移植到切除了骨髓的C57BL/6小鼠体内的再生潜能。肌肉损伤48小时后，将T-MSCs或T-MSC衍生肌源细胞肌肉注射到腓肠肌损伤部位的中点。DAPI染色（蓝色），α平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色）、肌营养不良蛋白（红色）的免疫染色；对于α平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色），肌营养不良蛋白（红色）；黄色表示α-SMA和肌营养不良蛋白的合并图像。原始放大倍数，×400。
将人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）移植到切除骨髓的C57BL/6小鼠体内的骨骼肌（SKM）再生。肌肉损伤后，肌肉注射T-MSCs或T-MSC衍生肌源细胞，并在移植后2天、1周、4周和8周获取活检标本。SKM再生的代表性图像显示，在受伤、车用治疗（车用）和T-MSC-和T-MSC肌细胞注射组小鼠的组织横切面上，肌钙蛋白I 1型（TNNI1；红色）和DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数，×400。
腓肠肌部分切除小鼠移植T-MSC衍生心肌细胞后运动障碍的减轻
为了确定T-MSC衍生成肌细胞或肌细胞的植入是否改善损伤后的肌肉功能，我们测量了右侧腓肠肌部分切除和T-MSC派生成肌细胞植入后小鼠的步长。如材料和方法所述，在移植后1、2、3、4和8周通过足迹分析进行步态评估(). 在脊髓切除术后1周，受伤和注射PBS（载体处理）的小鼠的步幅显著减少。移植后2、3、4和8周，注射T-MSC衍生心肌细胞的小鼠的步长显著增加（P<0.01–0.05）。在受伤/接受车辆治疗的动物中，没有观察到这种步幅距离的改善。这些结果表明，移植T-MSC衍生肌源性细胞可提高右侧腓肠肌部分切除小鼠的功能能力。
通过足迹分析评估步态。（A） 图中显示了足迹分析中测量的参数，虚线表示进展方向。在移植后1周、2周、3周、4周和8周对正常（n=8）和受伤（n=八）、假手术（n=八月）和肌细胞注射小鼠（n=八十）的足迹进行评估，以测量步长（厘米）。（B） 直方图表示正常小鼠、受伤小鼠、车辆治疗小鼠以及注射T-MSC衍生心肌细胞的小鼠之间的步长差异。图表示三个独立实验的多次测试的平均值，*P<0.05，**P＜0.01。TP，移植。
T-MSC衍生肌源性细胞移植修复SKM
我们分析了T-MSC在小鼠体内的植入效果，以确定其是否在移植后10周诱导受损右侧肌肉的形态再生。受伤小鼠和车辆治疗小鼠的肌肉()在10周时表现出损伤迹象，而在1周时损伤的小鼠严重(). 相比之下，植入小鼠没有明显的损伤迹象()移植后10周。独特的是，T-MSC注射小鼠腓肠肌群的形状得以恢复(); 由于免疫染色未增强再生，因此未测量T-MSC注射小鼠的步长。腓肠肌形状的这些变化证实了免疫染色和步态评估分析的结果，表明T-MSC衍生的肌源细胞促进了SKM的再生。
小鼠腓肠肌的形态学。植入后肌肉的形状发生了变化。照片显示了移植后（A）1周和（B）10周受伤小鼠的肌肉。照片显示了移植后10周时，（C）车辆处理小鼠、（D）扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSC）注射小鼠、（E）T-MSC衍生成肌细胞注射小鼠和（F）T-MSC-衍生肌细胞注射鼠的肌肉。
讨论
与来自年轻人的干细胞相比，来自老年人的成人干细胞增殖、迁移和分泌细胞因子或生长因子的能力降低(18,36). 因此，有必要从其他来源获得细胞，例如从年轻人身上摘除的扁桃体，然后丢弃。最近的研究还表明，T-MSCs不仅容易分化为中胚层组织细胞，包括脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞(17,21)也能进入肝细胞(20)、内皮细胞(24)和皮肤成纤维细胞(37). T-MSCs可以分化为所有3个胚层的细胞，即内胚层、中胚层和外胚层。在本研究中，我们证明未分化的T-MSCs具有肌卫星细胞预先存在的特征，并且具有高分化为骨骼肌细胞的能力。基于这些原因，我们认为T-MSCs比其他类型的MSCs更适合作为肌生成和SKM再生的细胞来源。
TGF-β对包括前脂肪细胞在内的多种间充质来源细胞的分化产生深远影响(38,39)，成骨细胞(40)和成肌细胞(41). 在以前对培养的成肌细胞的研究中，TGF-β被证明可以抑制肌肉特异性基因的表达以及肌管的形成，而不会影响细胞增殖(42,43). 由于这些发现，在我们的研究中，仅在培养基中添加1 ng/ml TGF-β，以诱导细胞分化为成肌细胞(). 在脊椎动物胚胎发生过程中，中胚层祖细胞产生不同的间充质谱系，包括骨骼肌细胞、骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。MSC向特定谱系的承诺和随后的分化受多种细胞外信号的协调作用调节，其中一些信号，例如IGF1，由脂肪细胞和心肌细胞共享，并可能促进一种或另一种细胞类型的产生(44). 胰岛素也可能与IGF1受体结合，IGF1可能与胰岛素受体结合；此外，IGF1/胰岛素杂交受体存在于SKM中。然而，胰岛素在葡萄糖稳态中特别重要，而IGF1主要参与肌肉生长(45). 全身注射IGF1可增加肌肉蛋白质含量并减少蛋白质降解(46). IGF1对肌成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积的刺激作用可能会干扰这种生长因子的能力，即使在高浓度下，也可能会影响其促进损伤后肌肉愈合的能力(47). 在本研究中，在成肌诱导培养基中使用10 ng/ml IGF1以诱导最终成肌分化().
为了诱导T-MSCs向肌源性分化，在不同的培养基中分别采用分化成成肌细胞和肌细胞两个步骤。肌源性标记物的表达，如肌生成素、肌营养不良蛋白、α-肌动蛋白和TNNI1，表明培养物中的大部分T-MSCs致力于肌源性分化途径。T-MSC衍生成肌细胞融合形成部分肌管在体外由于T-MSC衍生物在其并入肌管之前（作为成肌细胞）和之后均表达肌源性标记，我们假设诱导信号存在于肌管内外。此外，当移植这些细胞时，它们支持了一个完整的肌生成过程，允许肌纤维再生。移植后，只有一小部分T-MSC衍生物表达人类特异性标记物，如人类细胞核（HN；数据未显示）。大多数T-MSC衍生物缺乏HN表达的原因尚不清楚。
为了以可控和可复制的方式检查肌肉再生过程，有必要建立肌肉损伤的实验模型(26). 许多研究使用了各种损伤实验模型，包括注射肌毒性药物(9)，挤压伤(48)，缺血(12)，去神经支配(49)和肌营养不良(13)，已证明SKM具有独特的再生能力，而不考虑诱导初始损伤的精确方法(50). 在本研究中，我们进行了一次手术切除，以建立一种新的SKM损伤小鼠模型，以模拟严重的肌肉质量损失。
本研究证明，T-MSC衍生的肌源性细胞能够修复受损的SKM组织并再生肌肉。缺损要么得到修复，要么发生逐渐重塑，以至于移植后10周难以确定原始缺损区域。然而，移植T-MSC衍生细胞的小鼠损伤修复明显()移植后10周。在另一项使用MyoD转导的人羊水干细胞移植到小鼠受伤的胫骨前肌的研究中，发现肌肉组织面积大于受伤的未治疗小鼠或注射PBS的对照小鼠(14). 此外，Merritt等(51)证明了肌肉细胞外基质支持肌肉和血管再生的能力；然而，42天后功能没有完全恢复(51). 在我们的研究中，我们证明了移植T-MSC衍生的肌源性细胞可以促进受损SKM的再生。然而，需要进一步研究以确定是否也发生了功能恢复，还需要测量肌纤维的数量和大小，以完全确定功能结果。
许多研究利用ES/iPS细胞和肌肉干细胞治疗促进SKM再生(4,6,7,9,10). 尽管ES/iPS细胞有潜力，但它们与固有的局限性有关，包括组织相容性和伦理问题。此外，虽然肌肉干细胞可以从成人和产前组织中分离出来，但可以获得的细胞数量有限。因此，成人干细胞，如MSCs，是干细胞治疗的合适细胞来源，可用于促进受损SKM的再生。在许多研究中，来自骨髓、脂肪组织、胎盘、羊水、脐血和尿液的干细胞显示出促进SKM再生的潜力(1,11–14,18). 然而，当损伤或损坏严重时，使用这些细胞获得的再生程度可能不够(1,11–14,18). 因此，T-MSCs可能是一个很好的选择，因为它们的可用性和肌源性分化能力。我们的数据表明，正如步态评估测试所证明的那样，T-MSC在移植后8周具有显著的SKM高效再生能力。
总之，在本研究中，我们证明成肌细胞可能来源于人类T-MSCs并能分化为心肌细胞在体外步态评估测试显示，这种肌源性分化伴随着诱导SKM受损小鼠步长的改善。T-MSCs具有成肌潜能，因此可以通过以下两种直接途径促进肌肉再生从头开始肌肉分化或旁分泌机制。T-MSC衍生的肌源性细胞提供的功能改善有可能用于治疗人类SKM损伤和其他退行性疾病引起的损伤，包括先天性缺陷、创伤或肿瘤切除。
致谢
这项研究得到了大韩民国卫生福利部韩国卫生技术研发项目的HI12C0135号赠款和梨花女子大学2014年RP赠款的支持。
工具书类
1Chen W，Xie M，Yang B，Bharadwaj S，Song L，Liu G，Yi S，Ye G，Atala A，Zhang Y.人尿液来源细胞的骨骼肌成肌分化是骨骼肌再生的潜在来源。组织工程与再生医学杂志。2014年6月19日；doi:10.1002/term.1914。Epub提前打印[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Desai VD，Hsia HC，Schwarzbauer JE。脂肪来源间充质干细胞中肌成纤维细胞分化的可逆调节。公共科学图书馆一号。2014;9：e86865.doi:10.1371/journal.pone.0086865。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Gunetti M、Tomasi S、GiammóA、Boido M、Rustichelli D、Mareschi K、Errichiello E、Parola M、Ferrero I、Fagioli F等。全骨髓间充质干细胞在体内外用于尿失禁的成肌潜能。公共科学图书馆一号。2012;7：e45538.doi:10.1371/journal.pone.0045538。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Hosoyama T、McGivern JV、Van Dyke JM、Ebert AD、Suzuki M.使用基于球体的培养直接从人类多能干细胞衍生肌原性祖细胞。干细胞移植医学。2014;三:564–574. doi:10.5966/sctm.2013-0143。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Pereira T、Gärtner A、Amorim I、Armada-da-Silva P、Gomes R、Pereira C、Franca ML、Morais DM、Rodrigues MA、Lopes MA等。生物材料和干细胞治疗与骨骼肌组织相关的损伤。作者：Pignatello R，编辑。生物材料科学和生物医学应用进展。InTech；里耶卡：2013年。第329-355页。[谷歌学者] 6Kang JS，Krauss RS。肌干细胞在发育和再生肌发生中的作用。当前临床营养代谢护理。2010;13:243–248. doi:10.1097/MCO.0b013e328336ea98。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Motohashi N，Asakura Y，Asakura A.肌肉卫星细胞的分离、培养和移植。J签证费用。2014;86：e50846。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8施X，加里·DJ。肌肉干细胞在发育、再生和疾病中的作用。基因发育。2006年；20:1692–1708. doi:10.1101/gad.1419406。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Darabi R、Gehlbach K、Bachoo RM、Kamath S、Osawa M、Kamm KE、Kyba M、Perlingero RC。分化胚胎干细胞的功能性骨骼肌再生。自然医学。2008;14：134–143。doi:10.1038/nm1705。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Mizuno Y、Chang H、Umeda K、Niwa A、Iwasa T、Awaya T、Fukada S、Yamamoto H、Yamanaka S、Nakahata T、Heike T。从小鼠诱导的多能干细胞生成骨骼肌干/祖细胞。美国财务会计准则委员会J。2010;24:2245–2253. doi:10.1096/fj.09-137174。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Dezawa M、Ishikawa H、Itokazu Y、Yoshihara T、Hoshino M、Takeda S、Ide C、Nabeshima Y。骨髓基质细胞生成肌肉细胞并修复肌肉退化。科学。2005;309:314–317. doi:10.1126/science.1110364。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Di Rocco G、Iachininoto MG、Tritarelli A、Striano S、Zacheo A、Germani A、Crea F、Capogrossi MC。脂肪组织衍生细胞的成肌潜能。细胞科学杂志。2006年；119:2945–2952. doi:10.1242/jcs.03029。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Nunes VA、Cavaçana N、Canovas M、Strauss BE、Zatz M。脐血干细胞只有在暴露于体内肌肉环境后才能在体外分化为肌管并表达肌营养不良蛋白。生物细胞。2007;99:185–196. doi:10.1042/BC20060075。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Kim JA、Shon YH、Lim JO、Yoo JJ、Shin HI、Park EK。MYOD介导人羊水干细胞的骨骼肌分化和肌肉损伤的再生。干细胞研究与治疗。2013;4：147.数字对象标识代码：10.1186/scrt358。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Park S、Kim E、Koh SE、Maeng S、Lee WD、Lim J、Shim I、Lee YJ。帕金森病模型大鼠脑内胎盘间充质干细胞衍生神经祖细胞的多巴胺能分化和不对称旋转行为的缓解。大脑研究。2012;1466:158–166. doi:10.1016/j.braines.2012.05.032。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Kerkis I、Kerkis A、Dozortsev D、Stukart Parsons GC、Gomes Massironi SM、Pereira LV、Caplan AI、Cerruti HF。表达OCT-4和其他胚胎干细胞标志物的未成熟牙髓干细胞群体的分离和表征。细胞组织器官。2006年；184:105–116. doi:10.1159/000099617。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Ryu KH、Cho KA、Park HS、Kim JY、Woo SY、Jo I、Choi YH、Park YM、Jung SC、Chung SM等。扁桃体衍生间充质基质细胞：成功银行的生物、免疫和遗传因素评估。细胞治疗。2012;14:1193–1202. doi:10.3109/14653249.2012.706708。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Ting CH，Ho PJ，Yen BL。人类间充质干细胞中血清反应因子水平的年龄相关降低与骨骼肌分化和植入能力有关。干细胞开发。2014;23:1206–1216. doi:10.1089/scd.2013.0231。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Djouad F、Jackson WM、Bobick BE、Janjanin S、Song Y、Huang GT、Tuan RS。激活素A的表达调节间充质祖细胞的多潜能。干细胞研究与治疗。2010;1：11.doi:10.1186/scrt11。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Park M、Kim YH、Woo SY、Lee HJ、Yu Y、Kim HS、Park YS、Jo I、Park JW、Jung SC等。扁桃体衍生间充质干细胞通过自噬激活改善CCI4诱导的小鼠肝纤维化。科学代表。2015;5：8616.doi:10.1038/srep08616。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Yu Y，Park YS，Kim HS，Kin HY，Jin YM，Jung SC，Ryu KH，Jo I.人类扁桃体衍生间充质干细胞长期体外培养相关改变的表征：CCN1在复制性衰老相关骨分化增加中的作用。J Anat杂志。2014;225:510–518. doi:10.1111/joa.12229。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Park M，Kim YH，Ryu JH，Woo SY，Ryu-KH。扁桃体衍生间充质干细胞对小鼠骨髓衍生树突状细胞的免疫抑制作用。干细胞国际。2015;2015：106540.doi:10.1155/2015/106540。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Ryu KH、Kim SY、Kim YR、Woo SY、Sung SH、Kin HS、Jung SC、Jo I、Park JW。扁桃体衍生间充质干细胞减轻刀豆球蛋白A诱导的急性肝损伤。实验细胞研究。2014;326:143–154. doi:10.1016/j.yexcr.2014.06.007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Park YS，Hwang S，Jin YM，Yu Y，Jung SA，Jung SC，Ryu KH，Kim HS，Jo I.扁桃体衍生间充质干细胞分泌的CCN1通过整合素α促进内皮细胞血管生成v（v）β三和AMPK。细胞生理学杂志。2015;230:140–149. doi:10.1002/jcp.24690。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Mauro A.骨骼肌纤维的卫星细胞。生物物理与生物化学细胞杂志。1961;9:493–495. doi:10.1083/jcb.9.2.493。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26ChargéSBP，Rudnicki MA。肌肉再生的细胞和分子调控。生理学评论。2004;84:209–238. doi:10.1152/physrev.00019.2003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27实验动物护理和使用指南。第8版。国家研究委员会。国家学院出版社；华盛顿特区：2011年。[谷歌学者] 28Cho KA，Kim JY，Kim HS，Ryu KH，Woo SY。扁桃体来源的间充质祖细胞在细胞因子刺激下获得滤泡树突状细胞表型。细胞因子。2012;59:211–214. doi:10.1016/j.cyto.2012.04.016。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29D’Hooge R，Hartmann D，Manil J，Colin F，Gieselmann V，De Deyn PP。老年芳基硫酸酯酶A缺陷转基因小鼠的神经运动改变和小脑缺陷。神经科学快报。1999;273:93–96. doi:10.1016/S0304-3940（99）00647-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Fernagut PO，Diguet E，Labattu B，Tison F.测量步长作为小鼠黑质纹状体功能障碍指标的简单方法。神经科学方法杂志。2002;113:123–130. doi:10.1016/S0165-0270（01）00485-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Beattie GM、Lopez AD、Bucay N、Hinton A、Firpo MT、King CC、Hayek A。Activin A在没有饲养层的情况下保持人类胚胎干细胞的多能性。干细胞。2005;23:489–495. doi:10.1634/stemcells.2004-0279。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Carpenter MK、Rosler ES、Fisk GJ、Brandenberger R、Ares X、Miura T、Lucero M、Rao MS。在无饲料培养系统中保持的四种人类胚胎干细胞系的特性。开发动态。2004;229:243–258. doi:10.1002/dvdy.10431。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Nakatake Y、Fukui N、Iwamatsu Y、Masui S、Takahashi K、八木R、八木K、宫崎骏J、Matoba R、Ko MS、Niwa H.Klf4与Oct3/4和Sox2合作激活胚胎干细胞中的Lefty1核心启动子。分子细胞生物学。2006年；26:7772–7782. doi:10.1128/MCB.00468-06。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Ropka-Molik K，Eckert R，Piórkowska K。生后猪骨骼肌中肌源性调节因子MyoD、Myf6和Pax7的表达模式。基因表达模式。2011;11：79–83。doi:10.1016/j.gep.2010.09.005。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35García-Pelagio KP、Bloch RJ、Ortega a、González-Serratos H。正常和肌营养不良蛋白缺失小鼠单个骨骼肌纤维中肌膜和共基质的生物力学。肌肉研究细胞模型杂志。2011;31:323–336. doi:10.1007/s10974-011-9238-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Hass R，Kasper C，Böhm S，Jacobs R.人类间充质干细胞（MSC）的不同群体和来源：成人和新生儿组织源性MSC的比较。细胞通讯信号。2011;9：12.doi:10.1186/1478-811X-9-12。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Böttcher-Haberzeth S、Biedermann T、Klar AS、Pontiggia L、Rac J、Nadal D、Schiestl C、Reichmann E、Meuli M。皮肤组织工程：人扁桃体衍生的间充质细胞可以作为皮肤成纤维细胞发挥作用。儿科外科国际。2014;30:213–222. doi:10.1007/s00383-013-3454-x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Choy L，Skillington J，Derynck R.自分泌TGF-β受体和Smad信号在脂肪细胞分化中的作用。细胞生物学杂志。2000;149:667–682. doi:10.1083/jcb.149.3667。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Ignotz RA，Massague J.β型转化生长因子控制3T3成纤维细胞的脂肪分化。美国国家科学院程序。1985;82:8530–8534. doi:10.1073/pnas.82.24.8530。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Centrella M、Horowitz MC、Wozney JM、McCarthy TL。转化生长因子-β基因家族成员和骨骼。Endocr版本。1994;15:27–39.[公共医学][谷歌学者] 41奥尔森英语。肌发生调节回路中的原癌基因。精液细胞生物学。1992;三:127–136. doi:10.1016/S1043-4682（10）80022-4。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Massague J、Cheifetz S、Endo T、Nadal-Ginard B。β型转化生长因子是肌源性分化的抑制剂。美国国家科学院程序。1986;83:8206–8210. doi:10.1073/pnas.83.21.8206。 [PMC免费文章][公共医学][交叉参考][谷歌学者] 43Olson EN，Sternberg E，Hu JS，Spizz G，Wilcox C.通过β型转化生长因子调节肌源性分化。细胞生物学杂志。1986;103:1799–1805. doi:10.1083/jcb.103.5.1799。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Sordella R，Jiang W，Chen GC，Curto M，Settleman J.调节Rho GTPase信号调节脂肪生成和肌肉生成之间的转换。单元格。2003;113:147–158. doi:10.1016/S0092-8674（03）00271-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 45Schiaffino S，Mammucari C.通过IGF1-Akt/PKB途径调节骨骼肌生长：来自遗传模型的见解。骨骼肌。2011;1：4.网址：10.1186/2044-504-1-4。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 46Zdanowicz MM，Moyse J，Wingertzahn MA，O’Connor M，Teichberg S，Slonim AE.胰岛素样生长因子I在小鼠肌营养不良中的作用。内分泌学。1995;136:4880–4886.[公共医学][谷歌学者] 47Jones JI，Clemmons DR。胰岛素样生长因子及其结合蛋白：生物作用。Endocr版本。1995;16:3–34.[公共医学][谷歌学者] 48Bassaglia Y，Gautron J.大鼠快速和慢速肌肉在整体挤压损伤后退化和再生不同。肌肉研究细胞模型杂志。1995;16:420–429. doi:10.1007/BF00114507。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 49Dedkov EI、Kostrominova TY、Borisov AB、Carlson BM。成年大鼠长期失神经骨骼肌的修复性肌发生导致卫星细胞数量减少。Anat记录。2001;263:139–154. doi:10.1002/ar.1087。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 50Politi PK、Havaki S、Manta P、Lyritis G.Bupivacaine诱导的大鼠比目鱼肌再生：超微结构和免疫组织化学方面。超微病理学。2006年；30:461–469. doi:10.1080/01913120600854434。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 51Merritt EK、Hammers DW、Tierney M、Suggs LJ、Walters TJ、Farrar RP。利用同源细胞外基质作为支架的骨骼肌再生功能评估。组织工程A部分。2010;16:1395–1405. doi:10.1089/ten.tea.2009.0226。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
