国际放射肿瘤生物学杂志。2016年6月1日；95(2): 772–781.
缺氧增强奥拉帕利对人非小细胞肺癌异种移植瘤的辐射增敏作用
英国癌症研究院/英国牛津大学肿瘤系牛津放射肿瘤学研究所医学研究委员会
2015年9月29日收到；2015年12月22日修订；2016年1月18日接受。
这是一篇基于CC BY许可证的开放访问文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
- 补充资料
图E1
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图E2
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图E3
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图E4
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摘要
目的
聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂可在人类非小细胞肺癌（NSCLC）和其他类型癌症的临床前模型中增强放射治疗。然而，体内放射增敏的机制尚不完全清楚。在此，我们研究了缺氧对人非小细胞肺癌异种移植模型中PARP抑制剂olaparib放射增敏的影响。
方法和材料
非小细胞肺癌Calu-6和Calu-3细胞在常氧（21%O2)或缺氧（1%O2)条件。通过克隆存活试验和γH2AX焦点试验评估体外放射敏感性。对已建立的Calu-6和Calu-3皮下异种移植物进行奥拉帕林（50 mg/kg，每天持续3天）、放射治疗（10 Gy）或两者兼而有之的治疗。首次治疗24或72小时后收集肿瘤（n=3/组）。采用免疫组织化学方法评估缺氧（碳酸酐酶IX[CA9]）、血管（CD31）、DNA双链断裂（DSB）（γH2AX）和凋亡（裂解半胱天冬酶3[CC3]）。对剩余的异种移植物（n=6/组）进行肿瘤生长监测。
结果
在体外，在低氧条件下（1%O2). 在体内，Calu-3肿瘤氧合良好，而Calu-6肿瘤具有与同源重组蛋白RAD51下调相关的广泛缺氧区域。奥拉帕利治疗增加未修复DNA DSB(P（P）<.001）和凋亡(P（P）<.001），而对辐射诱导的Calu-6肿瘤非缺氧细胞或氧合良好的Calu-3肿瘤细胞的DNA损伤反应没有显著影响。因此，奥拉帕林显著增加了Calu-6肿瘤中辐射诱导的生长抑制(P（P）<.001），但不适用于Calu-3肿瘤。
结论
我们的数据表明，缺氧通过上下文合成杀伤增强了奥拉帕林的辐射增敏作用，肿瘤缺氧可能是一种潜在的生物标志物，可用于选择那些可能从奥拉帕布加入放射治疗中获得最大益处的患者。
总结
我们发现，PARP抑制剂olaparib可增强Calu-6异种移植物缺氧肿瘤细胞中辐射诱导的DNA损伤反应，但对Calu-6非缺氧肿瘤细胞或氧合良好的Calu-3异种移生物肿瘤细胞没有增强作用。因此，奥拉帕林增强了辐射对低氧肿瘤的抗肿瘤作用，但对氧合良好的肿瘤没有增强作用。这表明缺氧通过相关的合成致死性增强了奥拉帕布在人类非小细胞肺癌（NSCLC）异种移植中的辐射增敏作用。
介绍
非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的80%至85%，是全球癌症相关死亡的主要原因(1)三分之一的NSCLC患者被诊断为局部晚期，放射治疗是治疗这些患者的主要手段2,三尽管放射治疗技术取得了进步，但由于放射抗性，局部肿瘤控制仍不理想4,5由于DNA损伤的修复是放射抗性的主要原因，抑制DNA修复是提高放射治疗疗效的合理策略。
聚ADP-核糖聚合酶1（PARP-1）是一种DNA损伤敏感蛋白。PARP-1在与DNA单链断裂（SSB）结合时被激活，从而催化自身和其他邻近蛋白质的多聚（ADP-核糖）链的产生，以促进DNA修复(6)因此，这种酶被认为是一种很有希望的放射增敏靶点。事实上，抑制PARP已被证明可以增强各种细胞系和包括结肠癌在内的几种临床前肿瘤类型的放射治疗效果7,8，前列腺癌（9），乳腺癌(10)和非小细胞肺癌9,10,11PARP体外抑制放射增敏的机制已被很好地理解。PARP抑制剂阻止辐射损伤DNA释放PARP，因此DNA修复蛋白无法进入SSB。未配对的SSB在复制过程中转化为致命的DNA双链断裂（DSB），从而增强放射毒性(12).
然而，体内PARP抑制放射增敏的潜在机制仍不完全清楚。迄今为止，很少有研究关注肿瘤微环境在PARP抑制放射增敏中的作用，尽管对血管系统有影响，如肿瘤血管密度降低(13)或肿瘤血管灌注(11)在肺癌异种移植物中通过抑制PARP增强放射治疗。
肿瘤缺氧是一个主要的微环境因素，通过减少氧介导的自由基损伤限制放射治疗的疗效(14)慢性缺氧抑制肿瘤细胞中同源重组（HR）蛋白的表达和功能15,16由于修复PARP抑制导致的DSB需要HR17,18，受损的HR可导致未修复的DSB，并随后导致细胞死亡。因此，低氧诱导的HR缺陷被认为是PARP抑制的综合致死性19,20这种微环境介导的合成杀伤被称为“上下文合成杀伤”(19)这种上下文合成杀伤力可能与辐射协同作用。尽管几项体外研究表明，PARP抑制可使慢性缺氧条件下的细胞放射增敏9,20,21在体内实体肿瘤中，缺氧尚未与PARP抑制的放射增敏直接相关。
在本研究中，我们试图通过抑制PARP来研究缺氧对裸鼠体内生长的人非小细胞肺癌异种移植瘤放射增敏的影响。我们评估了2种非小细胞肺癌异种移植模型的DNA损伤反应和肿瘤生长抑制：Calu-6异种移植（低氧）和Calu-3异种移植物（氧合良好），放疗和PARP1/2抑制剂奥拉帕林治疗后。
方法和材料
细胞培养
人肺癌细胞Calu-3、Calu-6和A549购自美国类型培养物收藏。细胞在添加有5%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和50μg/mL青霉素/链霉素的高级Dulbecco改良Eagle培养基/F12培养基中培养，在7.5%CO的湿润环境中培养2.
体外γH2AX病灶检测
如前所述进行γH2AX病灶分析(22)简单地说，将细胞接种到96周板中，在照射前1小时（0或10 Gy）用5μmol/L olaparib或0.05%二甲基亚砜（DMSO）处理，然后在固定前返回培养箱24小时。用3%多聚甲醛固定细胞，用1%山羊血清/1%牛血清白蛋白/0.1%Triton X-100封闭细胞，然后用γH2AX抗体孵育（1:1500稀释；Millipore）。然后用Alexa 488标记的山羊抗鼠抗体（1:1200稀释；Invitrogen）和Hoechst（5μg/mL；Sigma-Aldrich）清洗细胞并培养。使用细胞内分析仪1000（GE Healthcare）从每孔400个核量化每个核的γH2AX病灶数量。
克隆原性存活试验
将指数生长的细胞接种到6孔板中，并暴露于21%O2（常氧）或1%O2（缺氧）在Whitley H35缺氧站（Don Whitley Scientific Ltd）中持续16小时。在常氧或缺氧条件下，用铯-137源以1.69 Gy/min（GSR D1辐照器；Gamma服务有限公司）照射（0-6 Gy）前1小时，向培养基中添加5μmol/L olaparib（Selleck）或0.05%DMSO。照射后24小时，清洗细胞，并添加新鲜培养基。培养板培养6至13天以形成菌落。然后固定菌落并用0.5%结晶紫在5%乙酸和75%甲醇中染色。计数菌落（≥50个细胞）。克隆存活曲线和50%时的增敏率（SER50)使用OriginPro 8.5.1版软件（OriginLab Corp）生成。
皮下异种移植
根据英国内政部的项目许可证，所有动物实验均在当地伦理审查后进行。研究对象为6-8周龄雌性BALB/c裸鼠（哈伦实验室），用2%异氟烷麻醉。Calu-6细胞（2×106)，Calu-3细胞（5×106)，或A549电池（2×106)将50%Matrigel（BD Biosciences）皮下注射到小鼠背部的单个部位。每周测量小鼠体重和肿瘤体积3次（体积=1/2×长×宽×深）。
肿瘤照射和治疗计划
当异种移植达到100毫米时三，小鼠被随机分为4组中的1组（n=12/组）：(1)赋形剂组（通过腹膜内注射，每天10%DMSO/10%字幕溶胶/PBS，持续3天）；(2)olaparib组（olaparib50mg/kg/d，连续3d腹腔注射）；(三)如前所述的照射组（肿瘤局部照射，单剂量10 Gy[RS320照射系统；1.82 Gy/min；Gulmay Medical Ltd）（23）; 和(4)联合组（olaparib每日50mg/kg，连续3d，肿瘤照射[10Gy]，第一次给药后30min）。
分别在第一次治疗后24小时或72小时处死每组三只动物，并对肿瘤进行免疫组织化学（IHC）处理。对其余动物（n=6/组）进行肿瘤生长监测，直至肿瘤大小达到500mm三或开始治疗后42天，以先发生者为准。
免疫组织化学分析
根据制造商的说明，使用EnVision G2双染色系统（Dako）对含有副甲醛和石蜡的肿瘤切片进行染色。用于免疫组织化学的抗体包括碳酸酐酶IX（CA9；1:800稀释；产物AB1001；BioScience）、CD31（1:50稀释；产物ab28364；Abcam）、GLUT1（1:200稀释；产物ab14683；Abcam）、RAD51（1:200稀度；产物GTX70230；GeneTex Inc）、γH2AX（1:1000稀释；产物05-636；Millipore）和裂解半胱天冬酶3（CC3；1:600稀释；产品9661；细胞信号技术）。使用Aperio CS扫描仪和ImageScope分析软件（Aperio Technologies）分析整个肿瘤切片（不包括坏死区域）中CC3、γH2AX、RAD51（3,3′-二氨基联苯胺）和CA9（永久红）的染色。每组使用三个肿瘤样本。对于γH2AX病灶定量，从每个肿瘤样本中评估200个细胞核。使用Cy3缀合的抗体ELK3-51（75mM；宾夕法尼亚大学）检测EF5结合，如前所述(24).
统计分析
数据以平均值±SEM表示。使用Student进行统计分析吨使用SPSS软件（IBM）进行测试（两组比较）或单向方差分析（两组以上比较）。统计显著性定义为P（P）<.05.
结果
奥拉帕布增强辐射对体外培养的人非小细胞肺癌细胞的细胞毒性作用
以前曾报道过奥拉帕林对体外正常毒性非小细胞肺癌细胞株的辐射增敏作用(11)为了评估olaparib是否影响辐射后的DNA修复，使用γH2AX免疫荧光法定量Calu-6和Calu-3细胞中残留的DNA DSB(25)在有olaparib或载药的情况下照射24小时后(图E1; 可在线访问网址：www.redjournal.org). 正如预期的那样，单独辐射显著增加了两种细胞系中残留的DNA DSB。单独使用奥拉帕利也会导致残余γH2AX病灶的形成增加(P（P）<.01). 与单独辐射相比，联合治疗显著增加了残留DNA DSB(P（P）<.01），表明olaparib损害辐射诱导DNA损伤的修复。
为了进一步研究氧对非小细胞肺癌细胞系中奥拉帕林辐射增敏潜能的影响，在21%氧浓度下，对照射过的Calu-6和Calu-3细胞进行克隆形成存活试验2（常压）或1%O2（缺氧）条件。我们观察到，在常氧和缺氧细胞系中，存活率均呈剂量依赖性下降。尽管慢性低氧Calu-3和Calu-6细胞的放射抗性略高于正常氧细胞，但在慢性低氧条件下，olaparib的辐射增敏作用（Calu-3的SER:2.87±0.28，Calu-6的SER:2.44±0.34）比在正常氧条件下（Calu-3:1.18±0.18，Calu-6的SER:1.95±0.31）更大(A、 B），表明缺氧可通过体外PARP抑制诱导相关合成致死。
Olaparib在体外对NSCLC细胞系放射增敏。Calu-6和Calu-3细胞暴露于常氧（21%O2)或缺氧（1%O2). 在辐射前1小时将奥拉帕立布或载药加入培养基中。辐射后24小时，细胞在无药物培养基中培养，以进行克隆存活分析。（A） 常压下克隆存活曲线。（B） 低氧条件下克隆存活曲线。缩写：SER=增敏率。
Calu-6异种移植物有广泛的缺氧区域
为了研究体内缺氧对奥拉帕林放射增敏的影响，建立皮下Calu-6和Calu-3异种移植物，并通过IHC染色CA9（一种广泛使用的肿瘤缺氧内在标志物）评估肿瘤缺氧(26)在连续的Calu-6肿瘤切片中，使用另一种内源性低氧标记物GLUT1和外源性低氧标志物EF5证实了CA9作为低氧标记的实用性。在Calu-6异种移植瘤中，CA9、GLUT1和EF5染色之间存在良好的空间相关性(图E2; 可在线访问网址：www.redjournal.org).
Calu-6肿瘤在邻近坏死区域的肿瘤细胞中显示CA9的广泛质膜染色(A） CA9阳性的Calu-6肿瘤细胞占12.1%±0.9%(E） 表明Calu-6肿瘤包含明显的缺氧区域。相反，CA9染色在Calu-3异种移植瘤细胞中很少见到(B） 仅在偶尔分离的细胞中可见染色。Calu-3肿瘤中1.7%±0.6%的肿瘤细胞CA9阳性染色(E） 表明Calu-3异种移植瘤氧合良好。我们之前已经证明，Calu-6异种移植比Calu-3异种移植灌注更差（23）与此相一致的是，Calu-6异种移植物中的血管稀少，嵌于肿瘤细胞团内，周围是缺氧区域(C） 而非缺氧Calu-3异种移植物的基质内有高密度的血管(D） ●●●●。
非小细胞肺癌的缺氧和血管系统。（A） Calu-6肿瘤中典型的CA9染色。（B） Calu-3肿瘤中典型的CA9染色。（C） Calu-6肿瘤中具有代表性的CA9（棕色）/CD31（红色）共染色。（D） Calu-3肿瘤中具有代表性的CA9（棕色）/CD31（红色）联合染色。（E） 定量分析Calu-6和Calu-3肿瘤中缺氧细胞的百分比。缩写：棒材=50μm；n=3/组。（此图的彩色版本可在网址：www.redjournal.org.)
RAD51在Calu-6异种移植物缺氧区表达下调
缺氧可降低HR蛋白的表达。为了探讨低氧诱导的HR蛋白表达下调在Calu-6肿瘤中是否明显，对治疗24小时后切除的肿瘤进行RAD51和CA9染色(A） ●●●●。CA9阳性区域（缺氧）的RAD51阳性细胞百分比显著低于CA9阴性区域（非缺氧）(P（P）<.001），不考虑治疗(B） ●●●●。
缺氧肿瘤细胞中RAD51蛋白表达降低。在辐射（0或10 Gy）前30分钟，用奥拉帕林（50 mg/kg腹腔注射）或载药治疗携带Calu-6异种移植物的小鼠。放射后24小时收集肿瘤进行IHC。（A） 载体治疗的Calu-6肿瘤中的代表性RAD51（棕色）/CA9（红色）染色。棒材=50μm。（B） CA9-阳性（缺氧）和CA9-阴性（非缺氧）肿瘤区域中RAD51阳性细胞的百分比（平均值±SEM）***P（P）<.001. n=3/组。缩写：IHC=免疫组织化学。（此图的彩色版本可在网址：www.redjournal.org.)
Olaparib治疗增加辐射后Calu-6异种移植瘤缺氧肿瘤细胞中未修复的DNA DSB和凋亡
接下来，我们讨论了奥拉帕林是否对体内缺氧和非缺氧Calu-6细胞的辐射反应产生不同影响的问题。γH2AX病灶水平被用作残留（未修复）DNA DSB的替代物(27)治疗后24小时由IHC进行评估(A） ●●●●。正如预期的那样，单独辐射可显著增加CA9-阴性（非缺氧）细胞中的γH2AX病灶(P（P）<.001），但在CA9-阳性（缺氧）细胞中诱导的病灶更少(B） ●●●●。奥拉帕利单独导致CA9-阳性（缺氧）细胞中γH2AX病灶水平升高(P（P）<.05），但不在CA9-阴性细胞中(B） ●●●●。令人惊讶的是，当与辐射结合时，CA9阳性患者的γH2AX病灶显著增加(P（P）<.001），但与单独辐射相比，在CA9阴性细胞中没有。这些数据表明，olaparib选择性地影响缺氧癌细胞中辐射诱导的DNA损伤反应。我们还将这些数据扩展到另一个低氧非小细胞肺癌异种移植模型（A549）中，并表明奥拉帕林选择性地增加了照射24小时后CA9阳性肿瘤细胞中残留的γH2AX病灶(图E3; 可在线访问网址：www.redjournal.org).
Olaparib增加辐射后Calu-6异种移植瘤缺氧肿瘤细胞中未修复的DNA DSB和凋亡。携带Calu-6异种移植物的小鼠在0-或10-Gy辐射前30分钟用奥拉帕林（50 mg/kg）或载体治疗。在放射治疗24或72小时后收集肿瘤进行IHC。（A） 24小时代表性γH2AX（棕色）/CA9（红色）染色。棒材=20μm。（B） 定量分析CA9阳性和阴性肿瘤亚区每个核的γH2AX病灶数（平均值±SEM）。（C） 72小时时典型的CC3（棕色）/CA9（红色）染色。棒材=50μm。（D） 定量分析CA9-阳性和阴性肿瘤亚区中CC3-阳性细胞的百分比（平均值±SEM）*P（P）<.05, ***P（P）<.001。n=3/组。缩写：DSB=双绞线断裂；IHC=免疫组织化学；ns=不显著。（此图的彩色版本可在网址：www.redjournal.org.)
对Calu-6肿瘤进行CC3染色，CC3是一种参与程序性细胞死亡的蛋白酶和一种细胞凋亡标记物(28)(C） ●●●●。与γH2AX病灶数据一致，单独辐射可显著增加CA9阴性细胞的凋亡率(P（P）<.001），但不在CA9-阳性细胞中。奥拉帕利单独增加CA9阳性细胞的凋亡率(P（P）<.05），当与辐射结合时，CA9阳性细胞的凋亡显著增强(P（P）<.001），但与单独辐射相比，CA9-阴性癌细胞中没有(D） ●●●●。这些数据表明，olaparib通过诱导缺氧癌细胞凋亡来增强辐射诱导的细胞杀伤。
Olaparib不会增强Calu-3异种移植物对辐射的DNA损伤反应
在Calu-3异种移植物中，还评估了奥拉帕林对DNA损伤反应的影响。由于CA9在Calu-3肿瘤中几乎未检测到，因此γH2AX病灶和凋亡细胞仅在CA9阴性细胞中定量。治疗后24小时，与经车辆治疗的对照组相比，奥拉帕林对γH2AX病灶水平没有影响，辐射治疗组和联合治疗组之间的γH2AX灶和CC3阳性细胞数量没有显著差异(图E4; 可在线访问网址：www.redjournal.org). 这一发现以及上述Calu-6异种移植物的数据表明，olaparib对体内非缺氧癌细胞的DNA损伤反应没有显著影响。
Olaparib治疗增加Calu-6中辐射诱导的生长抑制，但不增加Calu-3异种移植物中的生长抑制
鉴于olaparib增强了体内缺氧Calu-6肿瘤细胞中辐射诱导的DNA损伤反应，我们接下来研究了olaparip如何影响辐射对NSCLC肿瘤的抗肿瘤作用。与Calu-3肿瘤相比，Calu-6肿瘤更具侵袭性，可能与肿瘤持续缺氧有关。对于Calu-6异种移植物，与车用治疗对照组相比，单独使用奥拉帕林对肿瘤生长的影响较小但不显著(P（P）=.35,A） ●●●●。与单独辐射相比，联合辐射显著增强了肿瘤生长抑制(P（P）<.001,A） ●●●●。在Calu-3异种移植物中，单独使用olaparib对肿瘤生长没有明显影响(P（P）=39），联合治疗没有产生比单独辐射更大的抗肿瘤作用(P（P）=.53) (B） ●●●●。因此，奥拉帕尼作为单一疗法并不有效，即使在具有显著比例缺氧细胞的Calu-6肿瘤中也是如此。然而，我们的研究结果表明，奥拉帕尼可以通过选择性地增加肿瘤缺氧区域辐射的抗肿瘤作用。
辐射与olaparib联合使用可显著抑制Calu-6异种移植物的生长，但不影响Calu-3异种移生物的生长。将荷瘤小鼠随机（n=6/组）接受载体、olaparib（50 mg/kg）、10-Gy辐射或olaparib+辐射。绘制了Calu-6和Calu-3异种移植物的生长曲线（平均值±SEM）***P（P）<.001. n=3/组。缩写：ns=不显著。
讨论
尽管PARP抑制已显示出辐射增敏效应，但体内缺氧的潜在机制尚未报道。在这里，我们表明，在体外，无论是Calu-3还是Calu-6 NSCLC细胞系，在缺氧条件下，奥拉帕布的辐射增敏作用都大于常压。在体内，olaparib增加了Calu-6异种移植瘤缺氧肿瘤细胞中辐射诱导的残留DNA DSB和凋亡，但不增加Calu-6移植瘤非缺氧肿瘤细胞或氧化良好的Calu-3移植瘤细胞中的DNA DSB。因此，olaparib增强Calu-6异种移植物的放射抗肿瘤作用，但不增强Calu-3异种移生物的放射抗瘤作用。这些发现表明，体内奥拉帕林的放射增敏可能是由于低氧诱导的上下文合成杀伤所致。
据报道，PARP抑制剂与放射治疗联合应用于人类非小细胞肺癌异种移植，包括Calu-6、A549和H460异种移植的协同效应10,11,13根据我们自己的发现和其他小组的研究29,30据报道，这些异种移植模型包含大量缺氧区域，而此前没有研究联合治疗对非缺氧NSCLC肿瘤模型体内的影响。Barreto-Andrade等人(31)已经注意到，ABT-888对PARP的抑制增强了PC-3前列腺肿瘤中辐射的抗肿瘤作用，但在DU-145前列腺肿瘤中没有增强，尽管两种细胞系的体外辐射敏感性相似。另一项研究表明，PC-3异种移植物的平均缺氧分数（52%）高于DU-145异种移生物的平均缺氧率（7%）(32)，但Barreto-Andrade等人(31)在他们的研究中。综上所述，已发表的文献支持我们的发现，奥拉帕林对辐射的敏化作用主要局限于肿瘤的缺氧区域。
RAD51在HR中起着核心作用。在本研究中，我们观察到RAD51对体内缺氧Calu-6肿瘤细胞的下调作用。我们的结果与其他报告一致，这些报告显示慢性缺氧降低HR蛋白表达，导致DNA DSB修复的HR通路功能受损15,16,33此外，研究表明，PARP抑制的放射增敏作用对DNA DSB修复缺陷肿瘤细胞更有效（34）因此，低氧诱导的“上下文合成致死”可以与辐射协同作用。
我们的观察表明，奥拉帕林在体外缺氧条件下比在常氧条件下表现出更大的辐射增敏作用，这与其他人的发现一致（35）然而，没有证据表明体内非缺氧肿瘤细胞具有放射增敏作用。这种差异可能是由于肿瘤微环境因素导致的，这些因素可能会改变细胞对奥拉帕林联合辐射的敏感性。此外，其他组的体外数据表明，细胞周期的阶段影响PARP抑制诱导的放射增敏。S/G中的单元格2相对PARP抑制和辐射的敏感性最高，而非循环细胞的敏感性最低36,37与体外生长的肿瘤细胞相比，局部肿瘤微环境可能改变了增殖与非增殖肿瘤细胞的比例，导致辐射增敏效应的改变。然而，潜在的机制可能更复杂，需要进一步研究。
Chan等人(19)先前的研究表明，单独抑制PARP可选择性地杀死缺氧小鼠胚胎成纤维细胞，因此，PARP抑制剂可能被用作缺氧肿瘤的单一疗法。然而，在我们的研究中，尽管单独使用奥拉帕林可以适度增强缺氧Calu-6肿瘤细胞的DNA损伤反应，但它并没有显著抑制肿瘤生长，这表明肿瘤的缺氧部分不足以通过奥拉帕布单药实现显著的抗肿瘤效果。
缺氧有助于肿瘤的侵袭性生长38,39，缺氧细胞对辐射有抵抗力(40)我们的数据表明，通过抑制PARP结合放射治疗，可以靶向耐治疗缺氧细胞。此外，肿瘤缺氧可能是联合治疗抗肿瘤效果的预测因素。这在肺癌治疗中尤其有用，因为肺癌中的氧合作用各不相同41,4225%的非小细胞肺癌可定义为高度缺氧(43)有趣的是，在鳞癌中发现了较高水平的缺氧，这表明这种NSCLC亚型可能对联合治疗反应良好。
有趣的是，Calu-3肿瘤放射治疗后残留γH2AX病灶和凋亡水平低于Calu-6肿瘤。我们和其他人之前已经证明Calu-3和Calu-6异种移植模型显示不同的基质表型23,44这可能导致Calu-3和Calu-6异种移植物对辐射的不同DNA损伤反应。
在本研究中，我们使用CA9免疫染色作为低氧标记物，这与EF5染色相关。使用低氧特异性PET放射性示踪剂，如[18F] FMISO、[18F] FAZA和[18F] EF5（EF5）(45)，是潜在的患者选择模式。此外，最近开发的体内缺氧后基因标记可能提供另一种鉴定缺氧肿瘤的方法46,47.
结论
总之，我们的研究表明，缺氧通过相关的合成致死性增强了PARP抑制剂奥拉帕布的辐射增敏作用。肿瘤缺氧可能是一种潜在的预测性生物标志物，可以确定哪些患者将从奥拉帕林和放射治疗的联合治疗中受益最大。
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