医学（巴尔的摩）。2016年1月；95（2）：e2493。
肝细胞癌患者肝切除后组蛋白甲基转移酶G9a与总生存率的相关性（中位观察40个月）
监测编辑：Maria Kapritsou。
来自中国福建省福州市福建医科大学福宗临床学院肝胆外科。
2015年11月12日收到；2015年12月15日修订；2015年12月17日验收。
版权©2016 Wolters Kluwer Health，Inc.版权所有。 摘要
大约50%的肝细胞癌患者居住在中国。与其他癌症相比，肝癌的死亡率很高。尽管许多因素影响肝切除术后HCC患者的生存率，但肿瘤生物标志物组蛋白甲基转移酶（G9a）的作用尚不清楚。
我们纳入了350名接受肝切除术的肝癌患者，并对他们进行了40个月的随访。患者的临床病理特征从病历中获得，并使用多种方法确定总体生存率。我们对肝癌组织中研究G9a的表达进行了免疫组织化学分析。我们使用χ2用于评估G9a与其他因素之间关系的显著性的测试，以及用于估计危险比和95%置信区间的Cox比例危险回归。
G9a阳性肿瘤患者的α-fetoprotein水平显著升高。TNM分期、α-fetoprotein水平升高和G9a过度表达与较差的预后相关。
G9a的高表达与较差的预后相关，表明G9a可能是接受手术切除的HCC患者的预后生物标志物。由于其在细胞增殖中的作用，G9a是一个潜在的治疗靶点。
引言
与其他恶性肿瘤相比，肝细胞癌（HCC）的死亡率非常高，是全球第三大癌症死亡原因。1肝癌的发病率在东亚、东南亚和北非的男性和居民中明显较高，在大洋洲和欧洲的公民中相对较低。肝癌的高发病率部分归因于乙型和丙型肝炎患者的高感染率，以及食用含有黄曲霉毒素的食物。2大约50%的HCC患者生活在中国，这归因于普通人群7%的HBV感染率以及过度饮酒。因此，肝癌是一个紧迫的公共卫生问题，给国家医疗系统和患者家属带来沉重负担。
许多因素可能会改变肝癌患者的生存率，包括残余肝功能、肿瘤大小、疾病分期和治疗效果。三此外，肝切除和经导管动脉化疗栓塞等治疗，尤其是后者，为无法切除肿瘤的患者提供了选择。4肝切除被认为是可切除肝癌患者的一线治疗，是一线治疗。5然而，对于肝硬化和大肿瘤并存的患者，肝切除术会带来不良结果的高风险。
某些生物标记物可以促进不同肿瘤患者的管理。例如，常染色组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（EHMT2）（也称为组蛋白甲基转移酶G9a，此处称为G9a）与乳腺癌的风险和进展有关，6肺，7和卵巢。8然而，很少有报道关注G9a在疾病进展或肝癌患者生存中的作用。9因此，为了研究肝切除术后肝癌患者中G9a表达的意义，我们对G9a的表达与患者生存之间的关系进行了免疫组织化学和临床病理学研究。此外，据我们所知，这是第一项对这群患者进行长达40个月的跟踪研究。
方法
患者
我们纳入了福州总医院（三级甲等医院）350名经病理证实的原发性肝癌患者，他们接受了肝切除术。由于医院位于省会，患者代表了福建省所有9个城市。第一位和最后一位患者分别于2004年1月和2012年12月接受了肝脏切除术。受试者的临床病理特征，包括年龄、性别、肿瘤组织学分级、肿瘤大小、TNM分期和术前血清α-脂肪蛋白（AFP）水平，均来自医院数据库。从病历、电话访谈和社会保障死亡指数系统中获得了有关存活率的信息。从肝脏切除之日到随访结束之日（2015年5月）计算生存期。随访时间为93至3038天（中位数为1278天）。根据TNM恶性肿瘤分类和世界卫生组织肿瘤分类分别确定TNM和组织学分级分期。本研究符合《赫尔辛基宣言》中的伦理原则和福州总医院伦理委员会的政策。
免疫组织化学法测定G9a的表达
采用免疫组织化学（IHC）方法评估350名受试者原发性肝癌组织中G9a的表达。用标准方法将样品固定在4%多聚甲醛和石蜡包埋中。使用柠檬酸缓冲液（10 mM柠檬酸-0.05%吐温20，pH 6.0）进行抗原提取，并使用标准免疫组织化学技术对切片进行染色，使用指示的抗体和1 g/L苏木精溶液进行复染。使用的主要抗体是兔单克隆G9a抗体（1:100稀释；ab133482，Abcam，Cambridge，MA，USA），所有山羊抗兔生物素化IgG，在含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中室温培养30分钟，然后与ABC试剂孵育30分钟使用3,30-二氨基联苯胺进行免疫染色。将载玻片通过分级酒精脱水至二甲苯，并安装盖玻片。血红素用于核复染。
G9a的表达由2名病理学家在不了解受试者信息的情况下测定。阳性G9a表达细胞的细胞核内有褐色颗粒。G9a表达根据以下标准进行分级：未染色或染色<10%的癌细胞被分类为阴性，染色≥10%的肿瘤细胞被识别为阳性。
统计分析
我们分析了患者生存率与人口统计学和临床特征的关系，如年龄和性别、G9a表达、肿瘤大小、AFP水平和TNM分期。这些变量包括在生存分析中，我们使用Cox比例风险回归模型计算风险比和95%置信区间。确定为具有统计意义的因素(P（P） < 0.05）进一步进行多元分析。所有统计分析均为双面分析，使用SPSS 19.0版（伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）进行。
结果
患者的人口统计学和临床特征
在350例接受肝切除术的肝癌患者中，年龄≤55岁或≥55岁的患者分别占53.7%和46.3%；男性和女性分别占87.7%和12.3%；56.6%和43.4%的患者分为Ⅰ-Ⅱ期或Ⅲ-Ⅳ期疾病；肿瘤≥5cm或≤5cm者分别约占50.9%和49.1%。肝脏手术后，66.0%和34.0%的患者AFP水平分别<4000或>4000 ng/mL。免疫组织化学分析显示，G9a在大约50.3%的肝脏样本中表达，49.7%的肝脏样本未检测到G9a（图). 当AFP水平>4000 ng/mL时，G9a阳性肿瘤的发生率显著高于其他变量。随访结束时，303名受试者因肿瘤死亡（表).
G9a表达的免疫组织化学分析。A、 G9a阳性。B、 G9a-阴性。×100倍放大。
表1
根据生存状态和G9a结果分析研究对象的人口统计学和临床特征
TNM分期、AFP和G9a水平与生存期缩短的关系
单变量分析显示，TNM III–IV期、肿瘤>5cm、AFP水平>4000 ng/mL和G9a阳性的受试者总体生存率相对较差。此外，年龄和性别与生存率没有显著相关性。多变量分析确定TNM分期、AFP水平是与总体生存率显著相关的因素，与肿瘤大小相比（表，图).
卡普兰-迈耶分析。A、 AFP水平。B、 G9a表达。C、 TNM阶段。D、 肿瘤大小。
G9a表达是最差生存率的独立预测因子
Cox回归分析显示G9a阳性肿瘤与TNM分期和肿瘤大小之间存在关联（补充材料1）。当我们根据这些变量进行分层后的分析时，我们发现G9a阳性肿瘤与所有TNM分期和肿瘤大小的患者的不良生存率显著相关。独立于分层，G9a阳性肿瘤的危险比在III-IV期患者中最高。在较大肿瘤患者中检测到类似的关联（见表).
讨论
在此，我们发现晚期TNM分期、较大肿瘤大小、血清AFP水平和G9a表达检测与肝切除术后HCC患者生存率降低相关。尽管人们普遍认为分期是HCC的关键预后因素，但肝功能和肿瘤大小对生存率起着重要作用，我们的研究表明，大于5cm的肿瘤预后较差，这与以前的报告结果一致。10在韩国对2558名HCC患者进行的研究表明，肿瘤增大、总生存期缩短和无病生存期之间存在线性关系，大于5cm的肿瘤是HBV相关HCC患者的独立预后因素。11
AFP是临床应用中最常见的HCC生物标志物，成人AFP水平>400 ng/mL可能提示HCC。此外，高AFP水平与治疗后复发和转移有关，12这与目前的研究结果一致。此外，AFP水平是不同治疗方案的独立预后因素。13例如，一项对接受肝移植的HCC患者的回顾性研究结果表明，如果AFP水平低，肿瘤负担高的患者可以存活下来。14由于HCC患者的血清AFP水平差异很大，因此很难确定临界值，不同的研究采用了不同的临界值。例如，一项以400 ng/mL为临界值预测226例HCC患者总生存率的研究表明，术前AFP水平与长期预后相关。15此外，肝硬化可导致AFP水平升高，而这一混杂因素可能影响AFP水平预测生存率的准确性。一项针对无肝硬化HCC患者的研究结果表明，术前AFP水平与肝硬化患者的生存率较低相关。16
我们在这里重点关注G9a，它催化组蛋白H3的赖氨酸残基9的二甲基化17因为它介导细胞分化、增殖、基因表达以及患者对药物的反应。由于G9a在细胞增殖中的重要作用，我们推断G9a与肿瘤发生有关。此外，G9a在癌组织中的表达水平高于相应的正常组织。例如EHMT2型在结肠癌、前列腺癌、肺癌和肝癌中检测到，18G9a表达下调抑制膀胱癌和肺癌细胞系的细胞生长和凋亡。19我们在此表明，与低表达患者相比，G9a高表达患者的预后较差，这表明G9a可能是肝癌手术切除后的预后生物标志物。此外，我们发现G9a表达检测与AFP相关，表明G9a促进肝癌的转移和血管侵袭。例如，G9a的高表达与135例食管鳞癌患者较短的生存期有关，20这与我们的发现一致。此外，本研究的独特之处在于将G9a确定为肝切除术后HCC患者预后不良的独立危险因素。
促进肿瘤侵袭和转移的潜在机制可能与抑制上皮粘附分子（EPCAM）的活性有关，因为EPCAM在原发性肺癌组织中的表达与G9a的表达呈负相关。7此外，RNAi介导的G9a体外敲除抑制肺癌细胞系的迁移和侵袭性。7这些研究和我们的研究表明，G9a与癌症进展和预后相关，并可能作为一种新的治疗靶点。然而，G9a在肝癌中的作用尚不清楚，因此将成为未来研究的主题。
脚注
缩写：AFP=α-fetoprotein；G9a=G9a组蛋白甲基转移酶；HCC=七细胞癌；IHC=免疫组织化学。
作者没有利益冲突需要披露。
参考文献
1Gomaa AI、Khan SA、Toledano MB等。肝细胞癌：流行病学、危险因素和发病机制.世界胃肠病杂志2008;14:4300–4308.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2McGlynn KA，华盛顿州伦敦。全球肝癌流行病学：现状与未来.临床肝病2011;15:223–243.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Forner A、Reig ME、de Lope CR等。当前分期和治疗策略：BCLC更新和未来展望.赛明肝病2010;30：61–74。[公共医学][谷歌学者] 4Poon RT、Ngan H、Lo CM等。经动脉化疗栓塞治疗无法手术的肝细胞癌和术后肝内复发.外科肿瘤杂志2000;73:109–114. [公共医学][谷歌学者] 5Benson AB、Abrams TA、Ben-Josef E、3rd等人。NCCN肿瘤学临床实践指南：肝胆癌.J Natl Compr Canc Netw杂志2009;7:350–391.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Chen MW、Hua KT、Kao HJ等。H3K9组蛋白甲基转移酶G9a通过沉默细胞粘附分子Ep-CAM促进肺癌侵袭和转移.癌症研究2010;70:7830–7840. [公共医学][谷歌学者] 8Hua KT、Wang MY、Chen MW等。H3K9甲基转移酶G9a是促进腹膜转移的侵袭性卵巢癌的标志物.摩尔癌症2014;13:189.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Hung SY、Lin HH、Yeh KT等。组蛋白修饰基因作为肝细胞癌的生物标志物.国际临床实验病理学杂志2014;7:2496–2507.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Tandon P、Garcia-Tsao G。肝癌预后指标：72项研究的系统回顾.肝脏国际2009;29:502–510.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Hwang S、Lee YJ、Kim KH等。肿瘤大小对孤立性肝癌切除术后长期生存结果的影响：2558例患者的单机构经验.胃肠外科杂志2015;19:1281–1290. [公共医学][谷歌学者] 12Imamura H、Matsuyama Y、Tanaka E等。肝切除术后肝癌早期和晚期肝内复发的危险因素.肝脏病学杂志2003;38:200–207. [公共医学][谷歌学者] 13王毅，沈姿，朱姿，等。外周血AFP、GPC3 mRNA预测肝细胞癌OLT术后复发的临床价值.赫帕·蒙2011;11:195–199.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Berry K、Ioannou GN。血清甲胎蛋白水平独立预测肝细胞癌患者移植后生存率.肝脏转运体2013年；19：634–645。[公共医学][谷歌学者] 15Wan P，Zhang J，Long X等。术前甲胎蛋白和CA19-9水平预测肝癌患者肝移植术后生存.欧洲胃肠病学杂志2014;26:553–561.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Witjes CD、Polak WG、Verhoef C等人。血清α-fetoprotein水平升高可预测非肝硬化肝细胞癌的生存和复发.Dig Surg公司2012;29:522–528. [公共医学][谷歌学者] 17Shinkai Y，Tachibana M。H3K9甲基转移酶G9a及其相关分子GLP.基因开发201;25:781–788.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Huang J、Dorsey J、Chuikov S等。抑癌基因p53中的G9a和Glp甲基化赖氨酸373.生物化学杂志2010;285:9636–9641.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Cho HS、Kelly JD、Hayami S等人。EHMT2的增强表达通过SIAH1的负调控参与癌细胞的增殖.肿瘤形成2011;13:676–684.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20钟X、陈X、管X等。食管鳞癌中G9a和MCM7的过度表达与预后不良相关.组织病理学2015;66:192–200. [公共医学][谷歌学者] 
