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细胞周期。2016; 15(1): 72–83.
2015年12月4日在线发布。 数字对象标识：10.1080/15384101.2015.1120930
PMCID公司：PMC4825768美元
PMID：26636483

乳酸促进氧化性癌细胞对谷氨酰胺的吸收和代谢

Jhudit Pérez-Escuredo公司, Rajesh K Dadhich先生, 苏维埃拉·杜普, 安德里亚·卡塞斯, 文森特·范·海耶, 克里斯托夫·德·赛德勒, 玛蒂娜·斯波琳娜, 法比安·罗德里格斯, 玛丽·若泽芬·丰特妮尔, 露西·布里森, 保罗·波波拉托,和皮埃尔·松福1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

含氧癌细胞具有很高的代谢可塑性，因为它们可以利用葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸作为主要底物来支持其生物能量和生物合成活动。代谢优化需要整合。虽然糖酵解和谷氨酰胺分解可以协同支持细胞增殖，但氧化乳酸代谢可对抗氧化癌细胞中与其缺氧/糖酵化相邻细胞共生的糖酵分解。然而，关于氧化乳酸代谢和谷氨酰胺代谢之间的关系知之甚少。本研究使用SiHa和HeLa人类癌细胞，报道了细胞内乳酸信号促进氧化癌细胞中谷氨酰胺的摄取和代谢。这取决于单羧酸转运体1（MCT1）对细胞外乳酸的摄取。乳酸首先稳定低氧诱导因子-2α（HIF-2α），然后在模拟缺氧反应的途径中反式激活c-Myc。因此，乳酸诱导的c-Myc活化触发谷氨酰胺转运体ASCT2和谷氨酰胺酶1（GLS1）的表达，从而提高谷氨酰胺的摄取和分解代谢。解释这种代谢依赖性可能具有治疗意义。首先，针对MCT1的乳酸摄取抑制剂目前正在进入临床试验。它们有可能间接抑制谷氨酰胺分解。其次，在氧化性癌细胞中，对谷氨酰胺分解抑制的抵抗可能是由于氧化性乳酸代谢和增加乳酸信号的补偿引起的。

关键词：癌症、c-Myc、谷氨酰胺、谷氨酰胺分解、低氧诱导因子-2（HIF-2）、低氧诱发因子（HIF）、乳酸信号、单羧酸转运体1（MCT1）、肿瘤代谢

介绍

癌细胞表现出高度的代谢适应性，使其能够以最佳方式应对波动的微环境条件，同时实现其生物能量和生物合成活动。1,2葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸是它们的主要代谢底物。

对于氧化氧化癌细胞的高产能量代谢，在糖酵解过程中，一分子葡萄糖转化为两分子丙酮酸，丙酮酸为细胞线粒体中的TCA循环和氧化磷酸化（OXPHOS）提供燃料，从而提供最多38摩尔的ATP（糖酵化2摩尔+OXPHOS 36摩尔）每个葡萄糖分子。糖酵解丙酮酸的生产及其在TCA循环中的使用受巴斯德效应控制，即能量丰富的代谢物（如ATP和柠檬酸盐）对糖酵解酶的抑制性反馈变构控制。三此外，在TCA循环的第一个酶步骤中，丙酮酸脱氢酶（PDH）受PDH激酶1（PDK1）的抑制控制，糖酵解与OXPHOS的偶联受到调节。4,5当低氧诱导因子-1（HIF-1）转录诱导低氧和增殖细胞中PDK1表达时，就会出现解耦。5它与HIF-1控制下的糖酵解补偿一起上调大多数糖酵化转运体和酶的表达，其中胚胎亚型被重新表达。6,7糖酵解癌细胞确实经常表达己糖激酶2，这是一种胚胎己糖激酶亚型，与己糖激酶1相比，它具有2个催化位点，没有变构位点，因此对6-磷酸葡萄糖的变构反馈抑制不敏感。8,9他们还经常重新表达丙酮酸激酶M2（PKM2），与PKM1相比，PKM2要么是促进ATP生成的活性四聚体，要么是促进生物合成的非活性二聚体。10,11PKM2的四聚体和二聚体形式之间的平衡处于变构控制之下。12

癌细胞增殖需要代谢可塑性。大分子生物合成首先取决于细胞将碳水化合物从糖酵解分流到磷酸戊糖途径（用于NADPH和核糖核酸合成）和氨基酸生成途径的能力。13它还取决于谷氨酰胺的吸收和代谢，谷氨酰胺是谷胱甘肽合成的前体，是氮（用于DNA合成）和谷氨酸（用于氨基酸合成和交换）的来源，也是氧化TCA循环的燃料。14当用于生物还原模式时，谷氨酰胺还产生柠檬酸盐和NADPH，用于脂质生物合成。15在癌细胞中，这些过程受转录因子c-Myc的控制。c-Myc确实促进丙酮酸激酶的mRNA剪接(PK（主键）)至PKM2（平方公里）,16产生受变构调节的多功能PK亚型。12就谷氨酰胺水解而言，高亲和力谷氨酰胺转运体SLC1A5/ASCT2是c-Myc的靶基因产物，c-Myc进一步间接上调谷氨酰胺酶1（GLS1）的表达。17,18

肿瘤中的乳酸来源于糖酵解和谷氨酰胺水解，19但它不是一个死产品。从生物能量学的观点来看，乳酸确实被证明是氧化/氧化癌细胞中葡萄糖的首选氧化底物，从而支持糖酵解细胞和氧化细胞之间的合作20,21氧化癌细胞与糖酵解成纤维细胞的共生性。22乳酸还充当旁分泌信号剂，在氧化癌细胞中产生假低氧反应，在其氧化为丙酮酸和丙酮酸介导的脯氨酰羟化酶（PHD）抑制后激活HIF-1。23-25

癌细胞使用不同资源的可能性需要整合和协调。因此，糖酵解和谷氨酰胺水解协同支持癌细胞增殖。26在氧化性癌细胞中，乳酸盐的使用通过糖酵解的变构反馈抑制来抑制葡萄糖代谢，27支持基于底物交换的细胞间代谢共生。20,21在这种情况下，氧化癌细胞中乳酸代谢和谷氨酰胺分解是否以及如何相互影响仍然是一个悬而未决的问题。因此，本研究旨在测试氧化SiHa和HeLa癌细胞中乳酸和谷氨酰胺代谢之间的关系，这些细胞与糖酵解癌细胞相反，对乳酸信号敏感。25事实上，单羧酸盐家族（MCT）的被动乳酸-脯氨酸同转运体促进了乳酸在质膜上的转运：由于乳酸和质子的向内梯度，氧化癌细胞能够输入乳酸进行信号传递，而产生和输出乳酸的糖酵解癌细胞不吸收乳酸，也不显示细胞内对外源乳酸的反应信号。25

结果

SiHa和HeLa人癌细胞作为氧化癌细胞代谢模型的选择

乳酸跨细胞膜转运主要由MCT家族的被动转运蛋白促进，28这意味着消耗乳酸的氧化细胞容易摄取乳酸，而产生乳酸的糖酵解细胞不会显著输入乳酸，也不会通过外源乳酸显示细胞内信号。25由于本研究旨在测试氧化乳酸代谢对谷氨酰胺代谢的影响，我们首先选择氧化癌细胞系作为主要模型。使用海马分析仪进行的生物能量测量表明，SiHa和HeLa人宫颈癌细胞比MDA-MB-231人乳腺癌细胞氧化性更强(图1)：SiHa的OCR/ECAR比率最高（表明存在高度氧化代谢），29HeLa的氧化程度低于SiHa，但高于本实验中用作糖酵解对照的MDA-MB-231（Warburg表型）。30这些数据与之前的观察结果一致，即SiHa和HeLa细胞吸收乳酸并激活HIF-1以响应外源乳酸。20,25,31

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SiHa和HeLa比MDA-MB-231人类癌细胞氧化性更强。SiHa、HeLa和MDA-MB-231细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）之比（n=5-8*第页< 0.05, ***第页< 0.001).

乳酸刺激氧化癌细胞中的谷氨酸分解

为了确定乳酸和谷氨酰胺代谢之间可能的相互作用，我们首先分析了小鼠Matrigel栓塞中生长的SiHa肿瘤的活检。每只小鼠接受2个塞子：一个含有乳酸钠（30 mM），另一个含有等量的生理盐水。在评估谷氨酰胺加工途径时，我们发现12天内从Matrigel输送的乳酸刺激谷氨酰胺转运蛋白ASCT2的蛋白表达(图2A,左侧面板)谷氨酰胺酶1（GLS1）(图2B，左侧面板)与在缺乏乳酸的情况下生长的成对肿瘤相比。膜结合的ASCT2是介导细胞谷氨酰胺摄取的主要转运蛋白，而线粒体驻留的GLS1是谷氨酰胺分解途径转化的第一种酶L（左）-谷氨酰胺转化L（左）-谷氨酸。14,32因此，我们的数据表明，乳酸代谢可能会刺激癌细胞中的谷氨酸分解。因此，由于肿瘤缺乏内向乳酸转运蛋白MCT1（shMCT1，见参考文献25目标消亡）未显示乳酸诱导的ASCT2(图2A)和GLS1(图2B)蛋白质表达。

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乳酸促进癌症中的谷氨酰胺代谢。（A） 代表性的免疫印迹和条形图表示谷氨酰胺转运蛋白ASCT2在使用对照shRNA转染的SiHa癌细胞（shCTR，左侧面板)或靶向单羧酸转运体1（shMCT1，右侧面板). Matrigel塞含有30 mM的乳酸或等量的生理盐水（n=5；纳秒，不重要*第页< 0.05). （B） 相同的是在A类但分析谷氨酰胺酶1（GLS1）蛋白表达（n=5；纳秒，不重要*第页< 0.05). （C） 用乳酸钠（10 mM）处理野生型SiHa细胞6小时，并在增加剂量的情况下培养18分钟L（左）-[3,4–三H（H）(N个)]-谷氨酰胺。图表显示细胞内三H合并（n=8***第页< 0.005). （D） 用siRNA靶向转染SiHa癌细胞中GDH1和β-actin蛋白表达的代表性免疫印迹总账1/GDH1（siGDH1）。（E） 与相同C类但使用模拟转染的SiHa细胞(左边，n=8***第页<0.005）或转染siGDH1的SiHa细胞(正确的，n=8***第页< 0.005).

肿瘤在代谢和细胞组成上高度异质。为了记录氧化癌细胞中乳酸诱导的谷氨酰胺分解，我们使用在体外用SiHa细胞进行检测。20在用10 mM乳酸钠预处理6小时后，细胞暴露于增加剂量的[三【H】-L（左）-谷氨酰胺。意外地，三与对照细胞相比，乳酸处理的细胞中H标记减少(图2C). 这可能表明谷氨酰胺摄取减少或谷氨酰胺代谢增加与下游标记代谢物的输出有关。为了区分这两种可能性，我们使用针对谷氨酸脱氢酶1的smartpool siRNA靶向线粒体谷氨酰胺代谢(总账1/GDH1，参见图2D对于目标灭绝），酶转化L（左）-谷氨酸在线粒体中转化为GLS1下游的α-酮戊二酸。与表现为野生型的模拟转染细胞相比，谷氨酰胺代谢阻断增加[三【H】-L（左）-乳酸处理细胞与乳酸处理细胞对谷氨酰胺的摄取(图2E). 综上所述，我们的数据表明，乳酸摄取触发氧化癌细胞中谷氨酰胺的摄取和代谢。

乳酸激活氧化癌细胞中的c-Myc并稳定HIF-2α

众所周知，ASCT2和GLS1受c-Myc的转录控制，17,18但据我们所知，乳酸盐从未被报道能调节c-Myc活性。为了建立乳酸和谷氨酰胺途径之间的分子联系，我们首先记录了用10 mM乳酸钠处理6小时后，在SiHa细胞中诱导c-Myc蛋白表达，这在HeLa中得到证实(图3A). 在这两种细胞系中，反应都是转录后的(图3B). 这在生物学上具有重要意义：在pH-缓冲培养基中用作钠盐的乳酸诱导c-Myc活性增加约3倍，这是使用双荧光素酶报告试验检测到的(图3C). 此外，SLC16A1型/MCT1沉默抑制了这种对乳酸的反应(图3D; 有代表性的免疫印迹显示靶点消亡），从而证明MCT1依赖的乳酸摄取刺激这些癌细胞中的c-Myc活性。

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MCT1依赖性乳酸摄取稳定并激活氧化癌细胞中的c-Myc。（A-D）癌细胞接受±10 mM乳酸钠治疗6小时。A、，代表性免疫印迹和条形图表示氧化SiHa中c-Myc蛋白的表达（左侧)和赫拉(正确的)癌细胞（n=4-8*第页< 0.05, **第页< 0.01 ). （B）c-Myc公司RT-qPCR检测SiHa中mRNA的表达(左边)和赫拉(正确的)细胞（n=6–9；纳秒，不显著）。（C） 使用双报告基因萤光素酶测定法定量野生型HeLa细胞中的C-Myc活性（n＝4**第页< 0.01). （D） 与中的相同C类但使用转染有对照siRNA（siCTR）或siRNA靶向的HeLa细胞SLC16A1型/MCT1（siMCT1；n=4***第页< 0.005). 代表性免疫印迹显示转染siCTR或siMCT1的HeLa细胞中MCT1和β-肌动蛋白的表达。

我们接下来的目的是了解乳酸如何激活c-Myc。众所周知，乳酸作为一种缺氧模拟物，能够在包括SiHa和HeLa在内的氧化癌细胞中激活HIF-1。23-25在此过程中，乳酸衍生丙酮酸与α-酮戊二酸竞争以阻断HIF PHD，从而稳定HIF-1亚单位α并触发HIF-1活性。有趣的是，HIF-2α与HIF-1α类似，处于PHD控制之下。33此外，HIF-2α通过结合并稳定细胞核中的c-Myc:Max复合物来增强c-Myc活性。34因此，我们的目的是在我们的模型中测试乳酸对HIF-2α的影响。在SiHa和HeLa细胞中，乳酸可以独立于缺氧稳定HIF-2α蛋白的表达(图4A; siRNA敲除鉴定了与HIF-2α相对应的条带图4B). 乳酸没有改变EPAS1/HIF-2αmRNA水平(图4C)，从而表明在常氧癌细胞中，乳酸通过类似的翻译后机制激活HIF-1和HIF-2。因此，增加α-酮戊二酸的剂量可抑制正常氧HeLa细胞中乳酸对HIF-1α和HIF-2α的稳定作用(图4D). 此外，c-Myc、ASCT2和GLS1的表达水平与HIF对乳酸和α-酮戊二酸的反应一致(图4D). 这些数据共同表明存在一种乳酸信号通路，通过依次抑制HIF PHD、稳定HIF-2α、稳定和激活c-Myc以及增加ASCT2和GLS1的表达来促进谷氨酰胺的摄取和使用。

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乳酸能稳定氧化癌细胞中的HIF-2α。A-C、，对SiHa和HeLa癌细胞进行±10 mM乳酸钠处理6 h。（A）代表性免疫印迹和条形图表示HIF-2α蛋白表达（n=4-8*第页< 0.05). （B） 代表性免疫印迹显示，用对照siRNA（siCTR）或siRNA靶向转染的SiHa和HeLa细胞中HIF-2α和β-肌动蛋白表达EPAS1系统/缺氧诱导因子-2α（siHIF-2α）。（C）EPAS1系统/RT-qPCR检测HIF-2αmRNA表达（n=6；纳秒,不重要). （D） 在有无增加α-酮戊二酸剂量的情况下，对HeLa细胞进行±10 mM乳酸钠处理6小时。免疫印迹代表n=3，显示HIF-2α、HIF-1α、c-Myc、ASCT2、GLS1和β-actin的表达。

乳酸触发氧化癌细胞中HIF-2α依赖的c-Myc活化

在正常氧的SiHa和HeLa细胞中，乳酸同时稳定HIF-1α25和HIF-1α(图4)，2种对c-Myc产生拮抗作用的蛋白质。35, 36乳酸激活c-Myc，表明HIF-2α活性在c-Myc诱导中占主导地位。因此，沉默EPAS1系统/HIF-2α足以抑制乳酸诱导的HeLa细胞c-Myc、ASCT2和GLS1的表达(图5A，将第1行和第2行与第5行和第6行进行比较）；而乳酸对HIF-1α的稳定作用得以保持。相比之下，乳酸诱导的c-Myc、ASCT2和GLS1的表达在HIF-1型α沉默（siHIF-1α）和siHIF-α不干扰乳酸对HIF-2α蛋白的稳定作用(图5A). 沉默c-Myc公司通过乳酸抑制细胞中ASCT2和GLS1表达的上调，并保留HIF-1α和HIF-2α诱导(图5A). 因此，该实验表明HIF-2α通过乳酸控制c-Myc活化。因此，沉默HIF-2α足以抑制HeLa细胞中乳酸诱导的和基础的c-Myc活性(图5B).

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HIF-1α控制氧化性癌细胞中乳酸对c-Myc的激活。（A） HIF-2α、HIF-1α、c-Myc、ASCT2、GLS1和β-actin在HeLa细胞中检测到表达，这些细胞是模拟转染、转染siHIF-1 A、siHIF-2 A或siMyc-1并经±10 mM乳酸钠处理6小时的细胞。免疫印迹是n=3的代表。（B） 用双报告荧光素酶法对转染siCTR或siHIF-2α并培养6 h±10 mM乳酸钠（n=4***P（P）< 0.005). （C） 代表性免疫印迹显示C-Myc(左边)和HIF-2α(正确的)经24 h±10 mM乳酸钠或±缺氧（1%O2). 图中显示了由核标记层粘连蛋白A/C表达归一化的核部分中的蛋白质表达（n=3*第页< 0.05). （D） HeLa细胞在24小时±10 mM乳酸钠或±缺氧（1%O2). n=3的代表性免疫印迹显示HIF-2α和c-Myc在全细胞裂解物、对照IgG免疫沉淀（IP）和c-Myc免疫沉淀中表达。E、，在±10 mM乳酸钠或±缺氧（1%O2). 异质复合物在代表性图片中显示为红点，细胞核染色为蓝色（DAPI），F-actin染色为绿色（指骨样蛋白）。省略c-Myc的一级抗体作为阴性对照。棒材=50μm。

乳酸处理后，HIF-2α和c-Myc同时转位到细胞核(图5C)从而重现细胞对缺氧的反应（1%O2). 尽管没有商业上可获得的抗体使我们能够验证乳酸诱导的HIF-2α：在我们的人类细胞系中的最大相互作用，但我们发现，与未经处理的HeLa细胞相比，乳酸处理的HIF-1α和c-Myc共同免疫沉淀更丰富(图5D). 低氧概括了乳酸的作用(图5C和D). 在邻近连接分析（PLA）中，HIF-2α和c-Myc之间的相互作用增加也被观察到，其中乳酸触发了HIF-2α：c-Myc异源复合物的形成(图5E).

乳酸诱导的HIF-2α-c-Myc信号传导刺激谷氨酰胺途径

乳酸（10 mM）增加了SiHa和HeLa细胞中ASCT2蛋白的表达(图6A)与SiHa肿瘤中较高浓度（30 mM）时的作用程度相同体内（请参见图2A). 诱导很快（6小时，图6A)在慢性乳酸输送（12天，图2A). 要么c-Myc公司沉默（使用2种不同的siRNA，siMyc-1和siMyc-2）或HIF-2α沉默SiHa和HeLa细胞中乳酸诱导的抑制ASCT2蛋白(图6B). 同样，乳酸诱导细胞中GLS1的表达(图6C)被siMyc-1、siMyc-2和siHIF-2α完全独立地抑制(图6D). 目标消光如所示图6E对于两种细胞系。这些数据将乳酸盐诱导的HIF-2α和c-Myc表达与谷氨酰胺代谢联系起来，从而证实了氧化癌细胞中存在功能性乳酸盐-HIF-2α-c-Myc信号通路。

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乳酸促进氧化癌细胞中HIF-2α和c-Myc依赖的ASCT2和GLS1蛋白的表达。（A-D）癌细胞接受±10 mM乳酸钠治疗6小时（A），典型的免疫印迹和条形图显示野生型SiHa中ASCT2蛋白的表达（上面板)和赫拉(下部面板)细胞（n=4-7*第页< 0.05). （B） 与中的相同A类但使用模拟转染的SiHa和HeLa细胞(左侧面板)，转染siHIF-2α的细胞(中等偏左)和转染了2种不同的靶向c-Myc的siRNA（siMyc-1和siMyc-2，中等偏右和正确的)（n=3–6；纳秒，不重要*第页< 0.05). （C） 代表性免疫印迹和条形图显示野生型SiHa中GLS1蛋白的表达（上面板)和赫拉(下部面板)细胞（n=4-7*第页< 0.05). （D） 与中相同C类但使用模拟转染的HeLa和SiHa细胞(左边)，转染siHIF-2α的细胞(中等偏左)和转染siMyc-1的细胞(中等偏右)或siMyc-2(正确的)（n=3–6；ns，不显著*第页< 0.05). （E） 代表性免疫印迹显示转染siMyc-1或siMyc-2的SiHa和HeLa细胞中c-Myc和β-actin蛋白的表达。

乳酸以c-Myc依赖的方式增加谷氨酰胺的氧化代谢

我们最终旨在了解乳酸和谷氨酰胺代谢结合对氧化癌细胞的代谢优势。我们发现，乳酸（用作预处理，以区分其代谢效应与谷氨酰胺的代谢效应）提高了以谷氨酰胺（2 mM）为燃料的SiHa和HeLa细胞的耗氧率(图7A). 乳酸引起的谷氨酰胺氧化分解增加依赖于c-Myc，因为c-Myc在转染siMyc-1或siMyc-2的细胞中丢失(图7B). 这些结果表明，乳酸通过c-Myc活化刺激谷氨酰胺的氧化使用，如图7C.

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乳酸刺激氧化性谷氨酰胺分解。A至B在含谷氨酰胺（2 mM）的无葡萄糖新鲜溶液中，在细胞处理后6 h±10 mM乳酸钠中测量SiHa和HeLa细胞的耗氧率（OCR）。（A） 野生型SiHa和HeLa细胞的OCR（n=3个独立实验***第页< 0.005). （B） 与A组相同，但使用模拟转染的SiHa和HeLa细胞或转染siMyc-1或siMyc-2的细胞（n=3个独立实验；纳秒，不显著*第页< 0.05, **第页< 0.01). （C） 描述氧化癌细胞中乳酸诱导谷氨酰胺摄取和代谢的模型。根据该模型，乳酸通过单羧酸转运体1（MCT1）促进的转运进入氧化癌细胞，并在胞浆中氧化为丙酮酸（乳酸脱氢酶1[LDH1]反应）。乳酸衍生丙酮酸通过竞争性抑制脯氨酰羟化酶（PHD）对α-酮戊二酸（α-KG）的使用来介导乳酸信号，从而实现HIF-2α蛋白的稳定。然后，HIF-2α稳定细胞核中c-Myc蛋白的表达（很可能是通过稳定c-Myc:Max复合物），c-Myc在细胞核中促进靶基因的转录，其中SLC1A5型/ASCT2是主要的膜结合谷氨酰胺转运蛋白，谷氨酰胺酶1（GLS1）催化L（左）-谷氨酰胺L（左）-谷氨酸是线粒体中谷氨酸分解的第一步。谷氨酰胺可用于胞浆或线粒体。在线粒体基质中，谷氨酸脱氢酶1（GDH1）转换L（左）-α-KG中的谷氨酸可促进谷氨酸氧化分解。由于沉默MCT1可以阻断乳酸诱导的c-Myc活化，因此MCT1抑制剂有可能间接抑制氧化癌细胞中谷氨酰胺的摄取和代谢。

讨论

癌细胞努力在以营养物质可用性动态变化为特征的微环境中以最佳方式满足其代谢需求。靠近灌注血管的含氧癌细胞处于有利位置，具有高糖和谷氨酰胺输入（因为这两种营养物质是从血管输送的）以及糖酵解/缺氧癌和宿主细胞的额外乳酸输送。从生物能量学的观点来看，当含氧癌细胞采用基于乳酸优先使用而非葡萄糖的氧化代谢时，肿瘤生长会得到促进，因为因此血管附近多余的葡萄糖可用于为远处缺氧癌细胞的糖酵解代谢提供燃料。20,21,25在这里，我们报道了选择氧化使用乳酸盐的癌细胞进一步利用细胞内乳酸盐信号来优化谷氨酰胺代谢，特别是氧化谷氨酰胺分解。乳酸确实通过PHD抑制、HIF-2α稳定、HIF-2α介导的c-Myc反式激活以及c-Myc介导的谷氨酰胺内向转运蛋白ASCT2和GLS1表达增加来刺激谷氨酰胺的摄取和分解代谢，后者催化L（左）-谷氨酰胺L（左）-线粒体谷氨酸水解第一步的谷氨酸(图7C).

高水平的乳酸对许多类型的人类肿瘤预后不良，37,38其不仅反映了癌细胞的糖酵解活性，而且还反映了乳酸介导的活性。乳酸确实可以被氧化癌细胞用作代谢燃料。20,21,39-44它还可以作为能够激活转录因子HIF-1、，23-25,45NF-κB，21,46和c-Myc通过翻译后HIF-2α稳定（本研究），完全独立于缺氧。

除了乳酸与GPR81（细胞膜上的G蛋白偶联乳酸受体）结合外，47乳酸信号至少需要2个特征。首先，乳酸信号依赖于乳酸摄取，这一过程主要由氧化癌细胞中的MCT1促进。20, 25, 46MCT1是一种被动的乳酸-脯氨酸转运体（Km乳酸≈2.5–5 mM），由穿过细胞膜的乳酸和质子梯度驱动，28这就解释了为什么氧化癌细胞对外源性乳酸信号有反应，而产生乳酸的糖酵解癌细胞却没有反应。25MCT1在控制乳酸摄取方面发挥的关键作用可能最好地通过以下事实来说明：使用药理学或遗传学方法抑制MCT1，不仅可以防止乳酸被用作氧磷燃料20也包括乳酸诱导的HIF-1，25,45核因子-κB46和HIF-2α-c-Myc信号(图3D). 乳酸信号的第二个关键特征是乳酸能够独立于缺氧促进PHD抑制。HIF-1和HIF-2活性在翻译后由PHD控制，PHD催化HIF-1/2α亚基上关键脯氨酸残基的氧依赖性羟基化，在常压下靶向其泛素化和蛋白酶体介导的降解。33,48如果PHD在氧限制下被灭活（从而使HIF-1α和HIF-2α蛋白在缺氧条件下快速稳定），那么乳酸也可以抑制PHD的活性。23,24,45它通过支持乳酸衍生丙酮酸和α-酮戊二酸之间的抑制竞争而独立于缺氧。HIF-1α和HIF-2α均受PHD控制，25,33我们在这里显示，与HIF-1α类似，25乳酸稳定氧化性癌细胞中的HIF-2α(图4D). PHD抑制参与乳酸诱导的HIF-1α和HIF-2α的稳定并不排除乳酸对细胞氧化还原状态的额外影响，因为乳酸氧化为丙酮酸（乳酸脱氢酶1反应）增加NADH/NAD+比例和丙酮酸具有抗氧化性能。49,50考虑到癌细胞长期适应细胞外酸性激活HIF-2α并对谷氨酰胺上瘾，51MCT1与乳酸共转运质子的贡献当然值得进一步考虑。

在缺氧癌细胞和高HIF-1α表达的von Hippel-Lindau（VHL）缺陷癌细胞中，HIF-1对抗c-Myc活性。HIF-1确实增加了墨西哥比索1编码c-Myc阻遏物并促进c-Myc降解。35, 36该途径被认为可以防止c-Myc过度激活和c-Myc诱导的缺氧癌细胞凋亡。35相反，众所周知，HIF-2α具有相反的作用：它通过结合并稳定活性c-Myc:Max复合物来增加c-Myc活性。34在对乳酸的反应中，我们观察到HIF-2α对正常氧化性癌细胞中的c-Myc产生主要影响，这由以下事实说明：（i）乳酸稳定c-Myc转录后表达(图3A和B)，（ii）沉默HIF-2α足以抑制乳酸诱导的c-Myc稳定和激活(图5A和B)和（iii）乳酸触发HIF-2α：c-Myc杂合物的形成，该杂合物几乎只定位于细胞核(图5D和E). 在正常氧的癌细胞中，HIF-1α比HIF-1α占主导地位，以支持乳酸盐对c-Myc的激活，而HIF-1α依赖性的c-Myc在缺氧条件下的抑制可以通过两种条件下不同水平的HIF-1α稳定来解释。事实上，在SiHa细胞中，缺氧诱导HIF-1α的表达是乳酸（10 mM）的10倍，25表示响应幅度的对数差为1。因此，更普遍地说，可以推测HIF-1激活存在一个阈值，低于该阈值时HIF-2α诱导的c-Myc激活受到最低程度的抑制，高于该阈值时可被完全抑制。显然还需要进一步的研究来验证这一假设。

放射标记实验表明，乳酸触发氧化SiHa细胞摄取谷氨酰胺，这就需要在线粒体中谷氨酰胺氧化分解的GDH1步骤中观察到谷氨酰胺分解抑制(图2C和E). 谷氨酰胺代谢控制着细胞生物学的不同方面。由于GDH1抑制和放射分析反映了谷氨酰胺摄取的初始速率，因此乳酸的影响非常微妙，但在摄取速率方面都很显著(图2E)和谷氨酰胺依赖性耗氧量(图7A和B). 这强烈表明，即使部分额外负荷的谷氨酰胺用于线粒体中的氧化谷氨酰胺水解，52谷氨酰胺可以为氧化性癌细胞提供额外的优势。首先，谷氨酰胺被用作谷胱甘肽合成的前体，并为NADPH的生成（苹果酸转化为丙酮酸）提供燃料，从而提高抗氧化能力26这在代谢活性增强的氧化性癌细胞中非常受欢迎。其次，生物还原性谷氨酰胺代谢产生柠檬酸盐，促进脂质合成，从而维持癌细胞增殖。19最后，谷氨酰胺通过谷氨酸被转氨酶用作氮供体，它可以进一步用于跨膜氨基酸交换。26使用乳酸作为氧化燃料可以提高癌细胞对谷氨酰胺的摄取，从而优化蛋白质和核苷酸的合成。事实上，我们观察到GDH1抑制后谷氨酰胺摄取曲线只发生了微小的变化，这表明谷氨酰胺主要用于乳酸燃料氧化癌细胞的再补体，而不是去补体。谷氨酰胺及其代谢产物的很大一部分也可能最终从细胞中输出，这值得在未来的研究中进行研究。

在肿瘤中体内，我们记录了在乳酸作用下ASCT2和GLS1蛋白表达增加(图2A和B)当癌细胞缺乏SLC16A1型/MCT1.因为野生型SiHa细胞能够代谢谷氨酰胺，以及自然发育的不同代谢表型体内只有氧化癌细胞能够吸收乳酸，20,25我们没有观察到肿瘤放射标记在L（左）-[14C（U）]-谷氨酰胺输送(数据未显示). 然而，事实上，乳酸在整个肿瘤水平上以MCT1依赖性的方式强烈激活了谷氨酸分解机制，这表明，除了抗代谢作用外20和抗血管生成作用，25,45,46谷氨酰胺代谢抑制可能参与先前确定的MCT1抑制的抗肿瘤作用。相反，增加的乳酸信号可能导致肿瘤对以ASCT2或GLS1为靶点的抗谷氨酸药物的耐药性（参见参考文献9用于最近的审查）。为了支持这一点，ASCT2抑制剂γ-L（左）-谷氨酰-第页-据报道，硝基苯胺（GPNA）可增强MCT1在癌症中的表达和活性。53补偿可能进一步涉及c-Myc诱导的SLC16A1型/MCT1转录。54因此，乳酸和谷氨酰胺代谢之间的相互干扰值得在未来的治疗发展中特别考虑。

总之，我们报告了生理相关剂量的乳酸（10–30 mM）38从而抑制PHD，稳定HIF-2α，激活c-Myc并刺激氧化癌细胞中的谷氨酰胺代谢。虽然我们的研究侧重于乳酸氧化代谢和谷氨酰胺分解之间的协调，但它为未来的研究铺平了道路，这些研究旨在探索HIF-2α和c-Myc在癌症和其他病理学中可能传递的乳酸的其他作用。因为它可以激活肿瘤中的HIF-1、HIF-2、NF-κB和c-Myc，我们建议将乳酸视为一种肿瘤代谢物。

实验程序

细胞系和试剂

HeLa人宫颈癌腺癌细胞、SiHa人宫颈鳞癌细胞和MDA-MB-231人乳腺癌细胞来自ATCC。HeLa常规培养在含有FBS（10%）、非必需氨基酸（1%）、丙酮酸钠（1%）和青霉素-链霉素（1%）的RPMI中；以及含有葡萄糖（4.5 g/L）、FBS（10%）和青霉素-链霉素（1%）的DMEM中的SiHa和MDA-MB-231。在pH 7.4（3.7 g/L NaHCO）下缓冲培养基三，5%一氧化碳2). 为了避免细胞外pH值的变化，乳酸被用作钠盐。缺氧（1%O2)是在Ruskin缺氧工作站中实现的。除非另有规定，否则所有试剂均来自Sigma-Aldrich。

体内实验

全部体内实验是在UCL的批准下进行的动物实验伦理委员会（批准ID TUMETABO）符合国家动物护理法规。使用先前公开的方案实现了Matrigel塞±乳酸中的肿瘤生长25SiHa细胞表达对照shRNA（shCTR，Addgene质粒1864）或靶向shRNASLC16A1型/MCT1（Open Biosystems shRNA克隆TRCN0000038340）。简言之，8周龄雄性BALB/c裸鼠（Elevage Janvier）接受双侧皮下注射106在300μl生长因子中的癌细胞减少了含有30mM乳酸钠（右侧）或等量生理盐水（左侧）的基质胶。植入12天后，处死小鼠。收集Matrigel塞子，并将其在液氮冷却异戊烷中进行snap冷冻，以进行进一步的蛋白质表达分析。我们还使用了之前研究中收集的样本。25

协同免疫沉淀、免疫印迹和免疫标记

协同免疫沉淀-细胞在免疫沉淀（IP）缓冲液中溶解（40 mM Hepes pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM焦磷酸钠，10 mM甘油-3-磷酸，0.5%Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合物[Sigma]和PhosSTOP磷酸酶抑制剂[Roche]）。使用Dynabeads蛋白G（Invitrogen）进行共免疫沉淀。按照制造商的建议进行了以下修改。在添加珠子之前，将两微克抗c-Myc小鼠单克隆抗体（Santa Cruz）与100μl蛋白裂解物在4ºc的温度下搅拌≥6 h。使用IP缓冲区代替Ab Binding&Washing buffer。用IP缓冲液清洗珠子。将珠子添加到抗-Myc抗体细胞裂解物混合物中，并在4°c下引导培养过夜。结合后，使用200μL IP缓冲液从珠子中洗脱蛋白质，将样品在30μL莱姆利（3X）中稀释，并在8%SDS-PAGE凝胶上运行。将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上进行后续免疫印迹分析。

免疫印迹法-根据制造商指南，使用活性Motif的核提取试剂盒进行细胞分离。组织样本在RIPA缓冲液中均质。在RIPA缓冲液中收集细胞。如前所述，对等量的总蛋白进行蛋白质印迹，21但裂解产物没有热变性。主要抗体为：靶向HIF-2α（Novus Biologicals）、MCT1（Millipore）、层粘连A/C（Santa Cruz）、GLS1（Proteintech）、ASCT2（Milliepore）的兔多克隆抗体；抗c-Myc、HIF-1α和β-actin的小鼠单克隆抗体；和山羊抗GDH1多克隆（Novus biologials）。

免疫标记-这个就地c-Myc:HIF-2α杂合物的检测是通过邻近连接试验（PLA、Duolink、Olink Bioscience）实现的，该试验检测距离小于40nm的相互作用。55我们遵循了制造商关于用4%多聚甲醛固定并用Triton X-100（0.1%）渗透的电池的建议。阴性对照组在没有抗c-Myc一级抗体的情况下进行。所有图像都是在配备Apotome模块的蔡司AxioImager显微镜上以相同的设置采集的。

RT-qPCR

先前公开的协议51在ViiA 7 Real-Time和Biorad IQ5 PCR系统上使用SYBR green进行RT-qPCR。引物为：人类EPAS1系统/HIF-2α有义，5′-GTC TCT CCA CCC CAT GTC TC-3′，反义，5′-GGT TCT TCA TCC GTT TCC AC-3′；人类c-Myc公司正，5′-ATG AAA AGG CCC CCA AGG TA-3′，反义，5′-TTT CCG CAA GTC CTC TTC-3′；管理人类核糖体蛋白L19(hRPL19型)正、5′-CAA GCG GAT TCT CT GGA ACA-3′、反义、5′-TGG TCA GCC AGC TTC TT-3′。

c-Myc活性测定

使用Promega的双荧光素酶试剂盒测量c-Myc活性，pBV-Luc wt MBS1–4（Addgene）作为c-Myc活性的报告基因，pRL-雷尼拉萤光素酶（Promega）作为内部对照。使用脂质体RNAiMax（生命技术）联合转染细胞。

RNA干扰

根据制造商的方案，使用Lipofectamine RNAiMax将siRNAs转染细胞。siRNAs靶向：人类SLC16A1型/MCT1 5′-AAG AGG CUG ACU UUU CCA AAU-3′（siMCT1），人HIF-1α5′-AAC UGG ACA CAG UGU GUU UGA-3′（siHIF-1β），人类EPAS1/HIF-2α5′-CCC GGA UAG ACU UAU UGC CAA-3′（siHIF-2β）和人类c-Myc公司5′-GAG AAC AGU UGA AAC ACA A-3′（siMyc-1）和5′-GACA AGU UGA-AAC ACA A-3'（siMyc-2）。使用ON-TARGETplus智能池siRNA（5′-CCC AAG AAC UAU ACU GAU A-3′，5′-GCG AAG CGC UGC UGC C-3′，5'-GAA GAU CUA UGG UUG ACU A-3’，5'-CCC AUG AAG UAG UAG AUA A-3′；Dharmacon）沉默人类总账1/GDH1、Mock转染和Allstar siRNA（Qiagen）作为阴性对照。

代谢分析

使用Seahorse XF96细胞外流量分析仪（Seahorse Bioscience）测量线粒体耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。HeLa、SiHa和MDA-MB-231细胞（200μL培养基中20000个细胞/孔）接种在96个海马试验板中，并允许其粘附过夜。然后将细胞处理为±10 mM乳酸钠6 h。在测量之前，用不含葡萄糖和血清的含有2 mM谷氨酰胺的非缓冲DMEM替换上清液，并在37°C下使细胞平衡1 h，不含CO2补充。在4分钟内获得了三个基线OCR测量值，并在每孔总蛋白量归一化后报告为pmol/min（Bradford分析）。每个板八个孔作为技术复制品，每个实验独立重复至少3次。

谷氨酰胺摄取测定

如前所述，谷氨酰胺摄取是通过测量初始摄取率的放射性分析测定的。51将SiHa细胞（500000/孔）接种在聚乙烯中-L（左）-赖氨酸涂层24孔板。隔夜培养后，用1 ml DMEM±10 mM乳酸钠替换培养基，培养细胞6 h。用含有2 mM的改良克雷布斯溶液清洗细胞3次L（左）-不含葡萄糖的谷氨酰胺，在此溶液中37ºC培养18分钟。平衡后，将其暴露于浓度增加2 mCi/ml的环境中L（左）-[3,4–三H（H）(N个)]-谷氨酰胺（PerkinElmer）（0、50、100、125、200、250 nM）在37ºC下再维持18分钟。取出培养基，然后用含有2 mM的无葡萄糖冰镇克雷布斯溶液清洗细胞3次D类-谷氨酰胺，并用0.1 M NaOH溶解。将等分样品（100μl）转移到96 well Optiplates（PerkinElmer）中，并在室温下在150μl Microscint 40液体闪烁溶液（Perkin埃尔默）中培养1小时。在PerkinElmer Topcount读数器上测量放射性，并以标准化为总蛋白质含量的cpm表示（Bradford测定）。

统计分析

结果表示为平均值±SEM（误差条有时小于符号）。学生的t吨在适当的情况下，使用了单因素方差分析（Tukey的事后检验）和双因素方差分析。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

缩写

α-千克
α-酮戊二酸
ASCT2型
氨基酸转运蛋白2
ECAR公司
细胞外酸化率
EPAS1系统/HIF-2型α
内皮PAS结构域蛋白1
GLS1级
谷氨酰胺酶1
总账1/GDH1型
谷氨酸脱氢酶1
全球行动计划
γ-L（左）-谷氨酰-第页-硝基苯胺
高强度聚焦
低氧诱导因子
hRPL19型
人核糖体蛋白L19
SLC16A1型/MCT1型
单羧酸转运蛋白1
法国试验标准-κB类
核因子-κB
光学字符识别
耗氧量
牛津大学
氧化磷酸化
PDH公司
丙酮酸脱氢酶
PDK1系列
丙酮酸脱氢酶激酶1
博士
脯氨酸羟化酶
PK（主键）
丙酮酸激酶
解放军
邻位连接技术
VHL（甚高频）
冯·希佩尔·林道（蛋白质）

潜在利益冲突的披露

没有披露潜在的利益冲突。

致谢

我们感谢Elise Beneteau和Thibaut Vazeille提供的出色技术援助。

基金

这项工作得到了欧洲研究委员会（FP7/2007-2013）的资助（欧洲研究委员会独立研究员启动资助号243188 TUMETABO），比利时科学政策办公室（Belspo）的大学间吸引极（IAP）资助号UP7-03国家科学基金会（F.R.S.-FNRS），以及Recherche音乐会行动来自比利时法兰西公社（ARC 14/19–058）约瑟夫·梅辛（Joseph Maisin）之友、和贝尔热癌症控制基金会A.C.是特雷维博士后研究员。V.F.V.H.、C.J.D.和M.S.是Télévie博士研究员。P.S.是F.R.S.-FNRS的研究助理，P.E.P.是博士后研究员。

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文章来自细胞周期由以下人员提供泰勒和弗朗西斯