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单元格元数据。作者手稿；PMC 2016年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2015年12月1日；22(6): 1068–1077.
2015年10月23日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日至2015年9月15日
预防性维修识别码：项目经理4670565
NIHMSID公司：尼姆斯727245
PMID：26603296

癌基因Myc通过启动子去甲基化诱导谷氨酰胺合成酶表达

亚历克斯·J·博特,1,9,11 I-陈鹏,1,8,11 范永军,1 布兰登·福伯特,2 Lu Zhao先生,三 李金玉,4 莎拉·奈德勒,5 于孙,1,9 纳迪亚·贾贝尔,1 达维德·克罗科夫斯基,6 文云路,7 吉安潘,1,9 斯科特·鲍尔斯,4 约书亚·拉比诺维茨,7 玛丽亚·哈佐格鲁,6 丹尼尔·墨菲,5 拉塞尔·琼斯,2 宋武,三 杰弗里·格尔农,4和宗维兴1,9,10
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

已知c-Myc通过上调谷氨酰胺酶（GLS）促进谷氨酰胺的使用，GLS将谷氨酰胺转化为谷氨酸，谷氨酸在TCA循环中分解代谢。在这里，我们报告了在许多人类和小鼠细胞和癌症中，Myc诱导谷氨酸-氨连接酶（GLUL）的高表达，也称为谷氨酰胺合成酶（GS），它催化谷氨酸和氨从头合成谷氨酰胺。这是通过上调Myc转录靶点胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG），促进GS启动子的活性去甲基化及其表达增加。GS的高表达可促进谷氨酰胺限制下的细胞存活，而GS的沉默可降低细胞增殖和异种移植瘤生长。GS过度表达后，谷氨酰胺增加会促进核苷酸合成和氨基酸转运。这些结果表明，Myc在诱导谷氨酰胺合成方面发挥了意想不到的作用，并提示了DNA去甲基化和Myc驱动的癌症中谷氨酰胺代谢之间的新的分子联系。

图形摘要

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介绍

癌细胞重组其代谢程序，包括异常的谷氨酰胺代谢，以利于其生长、增殖和生存(DeBerardinis等人，2008年). 一些癌症细胞株表现出增加的谷氨酰胺摄取和分解代谢，以刺激三环酸（TCA）循环，使细胞对谷氨酰胺上瘾。尽管如此，除了作为营养物质外，谷氨酰胺还参与其他生物过程，包括作为合成核苷酸和非必需氨基酸的专用氮供体，作为必需氨基酸输入的交换物，以及作为细胞内氨和谷氨酸解毒的手段(党，2012;DeBerardinis和Cheng，2010年;Hensley等人，2013年;怀斯和汤普森，2010年)

虽然癌细胞的代谢变化可以通过细胞被动适应环境条件（如缺氧和氧化还原应激）来促进，但它们通常受到基因改变的积极调节，如癌蛋白的激活和肿瘤抑制因子的丢失(DeBerardinis等人，2008年;Kroemer和Pouyssegur，2008年;Vander Heiden等人，2009年). 两种原癌蛋白Akt和c-Myc（以下简称Myc）在调节细胞代谢中的功能已被深入研究。Akt和Myc都可以促进有氧糖酵解，也称为Warburg效应。关于谷氨酰胺代谢，而迄今为止的研究表明Akt对谷氨酰胺代谢的影响最小(Fan等人，2013年)，致癌Myc已被证明通过直接反式激活谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5和SLC7A5/SLC3A2的表达来促进谷氨酰胺的摄取(Nicklin等人，2009年)以及通过GLS阻遏物微RNA（miR）-23a/b的转录抑制增加谷氨酰胺酶（GLS）的表达来促进谷氨酰胺分解(Gao等人，2009年). 在之前的研究中，我们建立了一个等基因双调节FL5.12前B细胞系，其中myrAkt在多西环素（DOX）的控制下表达，而与人类雌激素受体（ER）的激素结合域融合的Myc被4-羟基三苯氧胺（4-OHT）激活(Fan等人，2010年). 使用该系统，我们使用Affymetrix DNA阵列分析比较Akt和Myc对基因表达的影响。令我们惊讶的是，我们发现Myc而不是Akt可以上调谷氨酰胺合成酶（GS）的表达，GS是一种催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶，是GLS催化的谷氨酰胺分解的反向反应。

结果

Myc上调GS表达和活性

在我们之前建立的FL5.12 Akt/Myc（AM）克隆中，myrAkt和Myc可以在同基因背景下单独或同时诱导(Fan等人，2010年)使用Affymetrix小鼠cDNA阵列，发现GS表达在Myc激活后增加，但在Akt激活后没有增加(图1A). GS表达的诱导在两个单独的克隆（AM10和AM32）中都得到了证实(图1B)和蛋白质水平(图1C)伴随着GS酶活性的增加(图1D). 在生理环境下，将Myc引入Pdx1-Cre；LSL-KRasG12D模型(Hingorani等人，2003年)通过将其繁殖到Rosa26 LSL-Myc小鼠(Murphy等人，2008年)与年龄匹配的对照KRasG12D小鼠相比，GS在胰腺导管瘤中的表达显著增加(图1E). 在从LSL-KRasG12D分离的肺肿瘤细胞中；第53页flox/flox公司老鼠(Jackson等人，2001年)，使用MycER系统诱导Myc也导致GS mRNA水平升高(图1F). 在永生化但未转化的人乳腺上皮细胞系MCF10A中，Myc的表达(图1G)刺激细胞增殖(图1H)也导致两种蛋白的GS表达升高(图1G)和转录水平(图1I)伴随着酶活性的增加(图1J). 有趣的是，GLS蛋白水平在此系统中没有增加(图1G). 使用带有Myc扩增的人类T淋巴瘤的癌症基因组图谱（TCGA）数据，观察到Myc扩增与GS表达之间的强烈相关性(图1K). 相反，在许多人类癌症细胞系中，内源性Myc的沉默导致GS表达降低，但GLS水平发生变化(图1L). 这些数据表明，Myc上调可以促进GS在许多小鼠和人类细胞系及癌症中的表达。

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Myc上调GS表达

（A–D）FL5.12亲本细胞和AM克隆（AM10和AM32）在对照培养基中培养36小时，Dox激活Akt，4-OHT激活Myc，或两者都激活。小鼠cDNA阵列显示GS转录物的折叠变化（A）。通过qRT-PCR测定的相对GS转录水平显示为三份典型实验的平均值加SEM（B）。通过免疫印迹分析细胞裂解物（C）。测定了GS活性，并显示为至少5个独立实验的平均值加SEM（D）。（E） 2个月大的Pdx1-Cre胰腺；LSL-KRasG12D（n=4）和年龄匹配的Pdx1-Cre；LSL-KRasG12D；用IHC对R26-LSL-MYC（n=4）小鼠进行GS染色。一： 岛屿；N： 正常组织；T： 肿瘤。请注意，来自病毒-Cre诱导的LSL-KRas的GS.（F）小鼠肺肿瘤细胞的正常胰岛染色呈阳性G12D系列; 第53页飞行/飞行小鼠感染了pBabe-MycERT2段并用乙醇载体或100 nM 4-OHT处理24 h。mRNA进行Illumina测序。GS mRNA水平表示为测序读取次数（平均值加SD（n=4））。用载体或pBabec-Myc稳定转染（G-J）MCF10A细胞。细胞进行免疫印迹（G）。测量细胞生长，并显示为以三份为单位进行的三个独立实验的代表性实验的平均值加SD（H）。通过qRT-PCR分析的GS转录水平显示为重复进行的3个独立实验的平均值加SEM（I）。GS活性显示为3个独立实验的平均值加SEM（J）。（K） T细胞淋巴瘤中Myc-high组和Myc-low组GS的差异表达水平。图示为GS表达水平的方框图。Myc高表达组和Myc低表达组由Myc表达高于或低于中间水平定义。（五十） 指示细胞系被指示的shRNAs稳定感染，并进行免疫印迹。

Myc通过启动子去甲基化直接上调TDG导致GS表达

我们接下来研究了Myc如何诱导GS表达。由于Myc扩增是人类乳腺癌的主要致癌事件，因此我们将重点放在人类乳腺上皮细胞系上进行以下研究。我们检测的6个乳腺癌细胞系中有5个表现出强烈的GS表达，不包括Hs578T细胞(图2A). 因此，我们利用Hs578T细胞研究GS在癌细胞中的上调作用。我们还选择使用GS表达水平低的MCF10A细胞(图1G)研究GS对非转化细胞Myc活化的调控。Myc是一种螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链家族转录调控因子，与Max家族蛋白二聚体结合CAC（G/a）TG（E-box）序列，直接激活其靶基因的转录。然而，使用基因组分析仪分析假定的GS启动子区域(网址：http://www.genomatix.de)和SABiosciences转录因子搜索门户(http://www.sabiosciences.com)在人类、小鼠或大鼠GS启动子中没有发现典型的Myc结合位点，这与之前对GS启动因子的分析一致(Kung等人，2011年). 有趣的是，我们注意到GS基因转录起始位点上有G/C丰富的区域，该区域被预测为CpG岛(图2B). 这表明GS启动子的DNA甲基化可能是转录调控的机制。事实上，用5-氮杂胞苷（一种DNA甲基转移酶抑制剂）治疗MCF10A和Hs578T细胞时，GS的表达均增强(图2C). 亚硫酸氢盐测序表明GS启动子确实甲基化，Myc的表达导致其甲基化降低(图2D). 为了确定Myc如何影响GS启动子甲基化，我们检测了主要DNA甲基转移酶和去甲基化酶在Myc表达上的表达。而Myc并未显著改变DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达水平，或DNA脱甲基酶TET1、TET2和MBD4的表达水平(补充图S1A)，显著增加TET3的表达(补充图S1A)和TDG(图2E). 这表明Myc可以通过上调TET3诱导“活性去甲基化”，TET3氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）和TDG，然后通过切除修复去除氧化产物(He等人，2011年;Ito等人，2011年). 支持活性去甲基化理论，在Myc表达细胞中观察到DNA去甲基化酶活性增加(图2F). 吉西他滨，一种DNA去甲基化的药物抑制剂，抑制了MCF10A-Myc中Myc诱导的GS表达(图2G)和FL5.12-AM32单元(补充图S1B).

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Myc通过TDG介导的GS启动子去甲基化上调GS表达

（A） 检测显示的乳腺癌细胞株的GS表达。（B） CpG在5′-调节区的分布示意图GLUL公司来自CpG岛屿搜索器的基因(http://www.cpgislands.com). CpG位点由垂直勾号表示，外显子1的开头被描述为“+1”。（C） 用20μM 5-氮杂胞苷（5-Aza）处理MCF10A细胞和Hs578T细胞。通过qRT-PCR测定的GS转录水平显示为三份典型实验的平均值加SEM。（D） 通过有限稀释建立载体控制和Myc表达MCF10A细胞的单细胞克隆。在每种细胞类型的5个克隆中扩增GS启动子，并通过硫酸氢盐测序进行分析。图中显示了测序结果和带有编号CpG的人类GS启动子的示意图。开口圆圈和填充圆圈分别表示非甲基化和甲基化胞嘧啶。（E） 用qRT-PCR分析Myc表达的MCF10A细胞中的TDG转录水平，显示为5个独立实验的平均值加SEM，共进行3次。（F） 在Myc表达的MCF10A细胞中测定DNA脱甲基酶活性，并显示为4个独立实验的平均值加SEM。（G） 用吉西他滨处理载体控制（v）和Myc-expressing（m）MCF10A细胞24小时，并进行免疫印迹。（H） 通过使用Myc抗体的ChIP分析以及启动子内两个特定区域的PCR（PCR#1和PCR#2），分析Myc表达MCF10A细胞中Myc与TDG启动子结合的水平。折叠增强表示IgG对照物上丰富的DNA片段。（一） 用pGL3控制载体、野生型TDG启动子或TDG启动因子突变体驱动的荧光素酶报告子转染MCF10A细胞，两个E-box分别或同时发生突变，并与肾素荧光素素酶构建物一起转染。24小时后对细胞裂解物中的荧光素酶活性进行量化，并根据肾小球荧光素酸酶活性进行标准化，并将其归一化为pGL3转染细胞的荧光素酶活性（三份典型实验的平均值加SD）。（J） FL5.12-AM32细胞在4-OHT中培养以诱导Myc活化。通过qRT-PCR测定的GS和TDG转录水平显示为两个独立实验的平均值加SEM，实验分三次进行。（K） MCF10A细胞被指示的shRNAs稳定感染。通过qRT-PCR（三份实验的平均值加SEM）分析TDG转录水平。

我们进一步表征了Myc如何诱导TET3和TDG的表达。有趣的是，最近两次独立的全基因组染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）分析表明，Myc可以直接与TDG启动子结合，但不能与TET3启动子结合(Perna等人，2012年;Walz等人，2014年). 启动子分析发现TDG启动子中存在两个假定的电子盒。使用Myc抗体和两个包含E-box的特定序列进行的ChIP-PCR分析表明，Myc被招募到TDG启动子(图2H). 然后，我们生成由野生型TDG启动子或在E-box共识位点突变的启动子驱动的荧光素酶报告子结构。虽然野生型启动子在Myc表达细胞中驱动了显著更高的荧光素酶活性，但单个E-box突变体和双突变体都失去了Myc介导的诱导性(图2I). 使用可急性诱导Myc的FL5.12-MycER细胞和MCF10A-MycER细胞，在Myc活化后4 h和8 h分别观察到GS和TDG的快速诱导(图2J和补充图S1C)与GS启动子甲基化降低相关(补充图S1D和S1E)与复制无关的主动去甲基机制相一致。最后，在表达Myc的MCF10A细胞中TDG沉默可以消除Myc诱导的GS表达(图2K). 因此，我们确定了一种先前未描述的机制，即Myc通过其启动子去甲基化激活GS表达。

Myc诱导的GS促进谷氨酰胺代谢

然后我们研究了GS在癌细胞中的作用。GS在Hs578T细胞中异位表达(图3A)，细胞与15N标记的氨（NH4Cl）并进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。在载体控制细胞中，约30%的细胞内谷氨酰胺为m+1(15N个1)标记，由m+0谷氨酸和NH缩合生成4Cl.GS的表达显著增加15将超过40%的谷氨酰胺m+1标记的N并入谷氨酰胺(图3B)证明GS促进谷氨酰胺合成。

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GS导致谷氨酰胺合成的反补体流量增加，并促进核苷酸合成

（A） 用载体控制或GS稳定转染Hs578T细胞15N-氨氮4用GC-MS测定谷氨酰胺缺乏介质中6 h的Cl和谷氨酰胺中的氮掺入量。对谷氨酰胺同位素的分数进行归一化，以获得稳定的同位素天然丰度。（C–F）GS表达的Hs578T细胞的代谢追踪分析。细胞在无谷氨酰胺培养基中培养16 h，然后用12.5 mM标记13C-葡萄糖在无谷氨酰胺培养基中培养6小时。相对丰度12C和13每个代谢物池中的C通过GC-MS测量，并相对于内部标准物和每个样品中的蛋白质含量表示，标准化为12载体控制细胞中的C组分（C：谷氨酰胺，D：谷氨酸，E：α-KG，F：其他指示代谢物）。所有数据都表示总标记，即所有同位素。所示为3个（某些情况下为2个）样本的平均值加SD。（G） 用标记细胞16小时15N-氨氮4谷氨酰胺-补体（2 mM）培养基中的Cl，并进行LC-MS。每种的百分比15图中显示了N标记的分子。所有数据代表总标签（平均值加上3个样本的标准偏差）。（H） MCF10A细胞被标记为15N-氨氮4用GC-MS测定无谷氨酰胺培养基中6 h的Cl和谷氨酰胺中的氮掺入量。将谷氨酰胺总库归一化为稳定同位素天然丰度。（I和J）MCF10A细胞被指示的shRNAs稳定感染。（一） 显示GS消音成功。（J） 用标记细胞16小时15N-氨氮4谷氨酰胺-补体（2 mM）培养基中的Cl，并进行LC-MS。每种的百分比15图中显示了N标记的分子。所有数据表示总标记（来自三个独立实验的代表的平均值加SD，一式三份）。

众所周知，Myc可促进谷氨酰胺分解，从而在TCA循环的αKG阶段增加回补(DeBerardinis等人，2007年;Wise等人，2008年). 因此，GS促进的谷氨酰胺合成可能会消耗TCA循环中间体，其中主要来源是葡萄糖。因此，13在不含谷氨酰胺的GS表达的Hs578T细胞中追踪C-葡萄糖。与15N-氨氮4Cl标记，追踪13C-标记的葡萄糖显示GS表达的Hs578T细胞中谷氨酰胺增加(图3C)伴随着谷氨酸相对丰度的降低(图3D)和αKG(图3E). 我们没有观察到13C并入丙酮酸和乳酸，这两种糖酵解代谢产物最接近TCA循环(图3F)我们也没有观察到TCA循环中间产物柠檬酸盐的显著差异(图3F). 此外，琥珀酸、富马酸和苹果酸的丰度显著降低(图3F). 这些数据表明，强制表达GS可能从αKG的角度促进TCA循环的猝发流出。

基于这些数据，我们试图确定新合成的谷氨酰胺在GS或Myc过度表达背景下的命运。除了谷氨酰胺在TCA循环中贡献碳的胸膜间质作用外，谷氨酰胺在多种细胞合成代谢过程中起主要作用，主要是通过末端氮基团的贡献，可以通过15N-氨氮4Cl标签。为了直接确定谷氨酰胺的去向，我们利用15N-氨氮4Cl标记，然后甲醇提取代谢物，然后通过液相色谱-质谱（LC-MS）进行追踪。与GC-MS数据一致(图3B)，LC-MS还显示了大量的15N转化为谷氨酰胺，同时天冬酰胺增加，末端受体15谷氨酰胺捐赠的N-胺基(图3G). 有趣的是，标记模式揭示了15N被还原成谷胱甘肽，谷胱甘苷是由谷氨酸合成的15GS表达细胞中核糖核苷和单磷酸核苷酸中的N掺入显著增加(图3G).

接下来，我们使用MCF10A细胞研究Myc表达的代谢效应。重要的是，类似于GS过度表达的Hs578T细胞(图3B)，m+1分数增加(15N个1)使用GC-MS在Myc表达的MCF10A细胞中观察到谷氨酰胺15N-氨氮4Cl标签(图3H). GS促进核苷酸合成(图3G)Myc刺激MCF10A细胞增殖(图1J)，我们检测了GS是否在Myc诱导的核苷酸合成中发挥作用，这与DNA合成和细胞增殖的增加有关。为此，在Myc表达的MCF10A细胞中GS被沉默(图3I)，并且细胞受到15N-氨氮4Cl标记后进行LC-MS。Myc活化导致15N-谷氨酰胺和15N-天冬酰胺，在GS沉默后显著降低(图3J). 这个15谷胱甘肽中的N掺入对GS沉默没有显著影响，表明GS对Myc活性细胞中谷胱甘苷的依赖性调节机制(图3J). 重要的是，在Myc过度表达的细胞中，尽管它们没有显示出稳定状态下不含甲醇的核糖核苷水平显著增加，这可能是由于Myc细胞的快速增殖表明核苷酸更快地并入DNA或RNA链，GS沉默导致稳态水平显著下降15N并入核糖核苷(图3J). 总之，这些结果强烈表明GS促进谷氨酰胺的生成，谷氨酰胺可用于合成代谢过程，如Myc活性细胞中天冬酰胺和核苷酸的合成。

GS促进氨基酸转运、细胞存活和肿瘤发生

为了检测谷氨酰胺合成代谢程序的另一个下游功能，我们测试了谷氨酰胺在亮氨酸双向转运中作为交换因子的可能性(Nicklin等人，2009年). 仅GS的过度表达就足以以系统L依赖的方式增加约20%的亮氨酸摄取，因为系统L抑制剂BCH会消除这种摄取(图4A，左右面板）。当细胞在氨基酸缺失培养基中培养时，细胞内氨基酸对系统L-介导的亮氨酸摄取的重要性也通过抑制亮氨酸摄取来证明(图4AKRB）。此外，即使在缺乏细胞外谷氨酰胺的情况下，高水平的谷胱甘肽也能持续摄取亮氨酸(图4A)，与GS一致，GS有助于增加谷氨酰胺的细胞内水平，谷氨酰胺作为亮氨酸摄取的外排底物(Krokowski等人，2013年;Nicklin等人，2009年). 与亮氨酸摄取和谷氨酰胺流出增加一致，GS-表达细胞中检测到细胞外谷氨酰胺水平增加(图4B).

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GS促进氨基酸摄取和肿瘤发生

（A） 检测Hs578T细胞在基础条件下、氨基酸提取（KRB）下和单独谷氨酰胺剥夺5小时后的亮氨酸摄取。在不含钠的EBSS中检测亮氨酸的系统L依赖性摄取，并通过使用系统L抑制剂BCH进行确认。（B） Hs578T细胞培养基中的细胞外谷氨酰胺水平。将浓度归一化为蛋白质浓度，并显示为载体细胞的倍数变化（两次实验的平均值加标准偏差为三倍）。（C） Hs578T细胞在无谷氨酰胺培养基中培养。细胞活力显示为三个独立实验的平均值加SD。含shNTC或shGS的（D和E）Myc-expressing MCF10A细胞在完全培养基（D）或无谷氨酰胺培养基（E）中培养。测量细胞生长（D）和细胞活力（E）。（F和G）显示的细胞系被两个独立的GS shRNAs稳定感染。成功静音如图（F）所示。测量细胞在完全培养基中的生长（G）。（H） 测量用两个单独的GS shRNA感染的MDA-MB-231细胞的自发细胞死亡。（一） 将表达Myc的MCF10A细胞培养在完全或无谷氨酰胺的培养基中，在没有或存在GS抑制剂蛋氨酸亚砜（MSO）的情况下。48小时后测定细胞活力。（J和K）MCF10A细胞在完全培养基或无谷氨酰胺培养基中培养，不存在或存在MSO（J）或GLS抑制剂BPTES（K）。48小时后测量细胞活力。（L-N）MDA-MB-468细胞被Tet-诱导的GS shRNA稳定感染，并进行免疫印迹（L）。测量细胞生长（M）。将细胞皮下注射到裸鼠两侧。给小鼠喂食不含（n=8）或含（n=10）盐酸多西环素（1 mg/ml）的饲料。显示平均肿瘤大小和扫描电镜。肿瘤图像显示在插页中。

然后我们确定了GS表达的生物学后果。在Hs578T细胞中，GS的过度表达增强了谷氨酰胺剥夺后的细胞活力(图4C). 相反，在表达Myc的MCF10A细胞中沉默GS会导致细胞在完全培养基中的增殖降低(图4D)使细胞对谷氨酰胺缺乏敏感(图4E). 通过在MCF10A-Myc和侵袭性更强的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468中使用两个独立的shRNA沉默GS，进一步说明了这种现象的普遍性(图4F)导致增殖减少(图4G). GS沉默对未转化的MCF10A亲本细胞没有明显影响(图4F和4G). GS沉默也导致MDA-MB-231细胞自发死亡(图4H). GS抑制剂MSO可增强Myc表达细胞对谷氨酰胺剥夺的敏感性，进一步证明了GS的促生存作用(图4I). 有趣的是，与MSO不同，GLS抑制剂BPTES对谷氨酰胺缺乏没有敏感性，而是抑制了MCF10A-Myc细胞的细胞死亡(图4J和4K)与谷氨酰胺的促合成代谢功能一致。此外，为了测试体内GS抑制的效果，我们在内源性GS水平较高的MDA-MB-468细胞中引入了一种Tet诱导的GS shRNA(图4L)以及细胞生长减少(图4M)和异种移植瘤生长(图4N). 这些数据表明，GS促进细胞增殖和存活，可能是真菌驱动癌症的可行治疗靶点。

讨论

在这里我们报道了Myc上调GS的表达，GS是一种催化谷氨酸和氨形成谷氨酰胺的酶。这种Myc诱导的GS表达促进谷氨酰胺合成代谢，并与细胞增殖、存活和异种移植瘤生长相关，表明GS在Myc驱动的肿瘤发生中具有重要作用。除了作为营养物质外，谷氨酰胺还参与许多生物过程，包括在嘌呤和嘧啶合成的多个步骤中充当专性氮供体，并有助于非必需氨基酸的生产(DeBerardinis和Cheng，2010年;怀斯和汤普森，2010年). 事实上，我们的数据表明，新合成的谷氨酰胺的几种命运已被阐明，即核苷酸和天冬酰胺的合成以及氨基酸转运(图3F和​和4A），4A级)，适合谷氨酰胺的合成代谢促进作用。

Myc与许多重要的细胞过程（大分子生物合成、核糖体生物生成和DNA复制）之间的联系以前已经建立，并为我们报告的谷氨酰胺合成代谢增强提供了解释。GS驱动的谷氨酰胺合成是唯一已知的内源性谷氨酰胺生产反应。在哺乳动物中，近90%的谷氨酰胺生产来自内源性来源(Biolo等人，2005年;库恩等人，1999年). 虽然肌肉组织占合成谷氨酰胺的大多数，谷氨酰胺可以释放到循环系统中，并被其他组织和肿瘤吸收，但许多组织和细胞类型在谷氨酰胺缺乏时有能力上调GS和谷氨酰胺的合成(He等人，2010年;Newsholme等人，2003年). 在具有Myc扩增的细胞中，生物合成过程的增加可能会增加对谷氨酰胺的需求，以作为许多合成代谢过程的基础。最近的一份报告证实了这一点，即在人类胶质母细胞瘤中发现谷氨酰胺从头合成增加(Maher等人，2012年). 因此，致癌Myc可能劫持谷氨酰胺合成系统，以确保谷氨酰胺供应满足自主需求，或者可能以共生方式供应，这有利于肿瘤组织异质性和微环境，尤其是在谷氨酰胺缺乏的情况下，例如在血管化不良的肿瘤中。

虽然我们的发现似乎与Myc在促进谷氨酰胺分解以促进TCA循环中的作用矛盾，但这并不完全令人惊讶。事实上，最近的报告强调了葡萄糖氧化是患者样本和人类原位肿瘤模型中的主要燃料来源，这些模型显示葡萄糖是肿瘤中谷氨酰胺积累和恢复的一种手段(Maher等人，2012年;Marin-Valencia等人，2012年). Myc可能以上下文相关的方式优先激活谷氨酰胺分解或谷氨酰胺合成。Myc通常不会导致GLS和GS同时上调，这一观察结果支持了这一观点(Yueva等人，2012年)在各种乳腺癌亚型中，GS和GLS之间可能存在相互抑制机制(Kung等人，2011年). 此外，即使在单个细胞内，这两种反应也可能受到严格调节，因为它们发生在不同的亚细胞区室：主要在线粒体中的谷氨酰胺裂解和在胞质溶胶中的谷氨酰胺合成(Svenneby和Torgner，1987年).

我们还表明，Myc诱导的GS表达是由一种涉及活性启动子去甲基化的新机制介导的。DNA甲基化被认为是肿瘤发生的关键因素，但其确切的作用和调控在很大程度上仍不明确。尽管如此，尽管特定基因的调控尚待阐明，但全球低甲基化也被普遍检测到并被认为是癌症的病因(库利斯和埃斯特勒，2010年). 我们目前的数据提供了一个新的例子，即Myc可以诱导DNA去甲基化并改变细胞代谢。这与活性DNA去甲基化在生殖细胞和多能干细胞发育中起重要作用的证据一致(Wu和Zhang，2014年)与Myc驱动的肿瘤发生有许多共同的信号通路和代谢改变(戈丁等人，2014年).

实验程序

细胞死亡分析

将碘化丙锭（PI）以1μg/ml的浓度添加到每个样品中。使用流式细胞仪（FACSCalibur，BD Biosciences）通过PI排除法显示的质膜通透性来测量细胞活性。

细胞生长测定

结晶紫染色法测定细胞生长速率。简单地说，用4%PFA固定细胞，然后用0.1%结晶紫染色。洗涤后，用10%乙酸萃取结晶紫，并在590 nm处测量吸光度。

氨基酸转运分析

如前所述进行氨基酸摄取(Krokowski等人，2013年).

定量RT-PCR

用RNeasy试剂盒（Qiagen）分离总RNA。使用SuperscriptIII第一链合成系统（Invitrogen）对2μg总RNA进行反转录。合成的cDNA用于StepOnePlus（Applied Biosystems）上PerfeCTa SYBR Green Super mix（Quanta Bioscience 95055）的实时定量PCR（qPCR）。

稳定同位素代谢物示踪

13C-葡萄糖和15N-氨氮4在麦吉尔大学和石溪大学的代谢组学核心进行Cl标记和GC-MS。15N-氨氮4Cl标记结合LC-MS在普林斯顿大学化学系和路易斯西格勒综合基因组研究所进行

动物

雌性裸鼠，6至8周龄，购自Charles River Laboratories。老鼠被安置在石溪大学实验动物资源部并进行监测。所有实验程序和方案均由石溪大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

统计分析

进行纵向数据分析以评估生长曲线。ANOVA程序用于通过Dunnett或Newman-Keuls检验评估多组之间的差异。使用独立的双样本和单样本t检验对两组进行比较，并分别评估折叠变化是否与一组不同。主要使用SAS 9.4中的PROC MIXED、PROC FREQ、PROC MEANS和PROC TTEST进行分析（SAS institute，Cary，NC）。还使用GraphPad Prism 5 for Windows进行了一些初步分析。不同水平的统计显著性表示为：无显著性，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

更多详细的实验程序见“补充信息”.

补充材料

1

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2

单击此处查看。（536K，pdf）

致谢

我们感谢Richard Lin博士、Eyal Gottlieb博士、Eileen White博士和Jessie Guo博士的深入讨论和批判性阅读。这项工作得到了NIH（R01CA129536和R01GM97355给WXZ，R37DK060596和R01DK053307给MH）以及Carol Baldwin乳腺癌研究基金会给WXZ.的资助。

脚注

作者贡献

AJB、ICP、YF和WXZ构思了这些想法并设计了实验。所有作者都进行了实验或数据分析。AJB、ICP和WXZ撰写了这篇论文。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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