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自然细胞生物学。作者手稿；PMC 2016年5月23日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然细胞生物学。2015年12月；17(12): 1556–1568.
2015年11月23日在线发布。 数字对象标识：10.1038/ncb3272
预防性维修识别码：项目经理4663685
EMSID:EMS65682标准
PMID：26595383

谷氨酰胺合成酶活性促进核苷酸生物合成并支持谷氨酰胺限制性胶质母细胞瘤的生长

萨维里奥·塔迪托,1 阿纳伊斯·乌丁,2 沙菲克·艾哈迈德,三 弗雷德·法克,2 奥利维尔·基恩,2 梁正,1 Hrvoje Miletic公司,4 PerØystein Sakariassen公司,4 亚当·温斯托克,5 阿伦·瓦格纳,5 苏珊·L·林赛,6 安德烈亚斯·霍克,1 苏珊·C·巴内特,6 伊坦·鲁宾,5,7 Svein Harald Mørkve公司,8 莫滕·隆德·约翰森,8,9 安东尼·查尔默斯,三 罗尔夫·比克维格,2,4 西蒙·尼克鲁,2,4和埃亚尔·戈特利布1,10
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关联数据

补充资料

摘要

L-谷氨酰胺（Gln）在生理上发挥作用，平衡组织对碳和氮的需求。有人提出，在经历有氧糖酵解的癌细胞中，Gln-衍生碳维持加速的合成代谢，补充三羧酸（TCA）循环（回补）。然而，这里显示，在胶质母细胞瘤（GBM）细胞中，几乎一半的Gln-衍生谷氨酸（Glu）是分泌的，不会进入TCA循环，并且抑制谷氨酸分解不会影响增殖。此外，缺乏谷氨酰胺的细胞不能通过TCA循环补充得到拯救。相反，谷氨酰胺合成酶（GS）将Glu转化为Gln（卡普鲁西氏症）可赋予Gln原营养，并为其提供燃料从头开始嘌呤生物合成。在原位GBM模型和患者中，13C-葡萄糖示踪显示GS从TCA循环衍生的碳中产生Gln。最后，虽然循环对Gln的贡献很小，但GBM肿瘤生长所需的Gln要么由GS阳性神经胶质瘤细胞自主合成，要么由星形胶质细胞提供。

简介

Gln和Glu构成细胞生理学中的代谢中枢。近一个世纪以来，生物化学家已经认识到转化细胞对谷氨酰胺的需求不断增加，这与其作为丰富的循环呼吸燃料的作用有关1值得注意的是，Gln碳可以通过进入TCA循环支持合成代谢通过谷氨酰胺水解。只有特定的肿瘤类型显示出Gln依赖性2-9其遗传和代谢基础仍有争议。在某些癌症模型中，谷氨酰胺酶（GLS）的抑制作用可将谷氨酰胺脱氨化为谷氨酸，从而减少增殖和致瘤性10相反，GLS2级可由肿瘤抑制因子p53诱导11在人肝细胞癌中，β-catenin增加GS的表达，从而催化逆转GLS反应12最初，在中枢神经系统中观察到Gln-Glu周期的调谐13其中谷氨酸是最丰富的神经递质14与星形胶质细胞不同，胶质瘤细胞可以释放神经脱毒量的谷氨酸，可能促进肿瘤的发生15.谷氨酰胺成瘾被认为是GBM的标志，GBM是最具侵袭性的胶质瘤4在这里，我们分析了Gln-衍生碳和氮原子在维持六种人类建立的GBM细胞系、原代GBM干细胞样细胞和正常星形胶质细胞的合成代谢和生长中的差异代谢作用。此外，在原代原位小鼠异种移植物和GBM患者中研究了Gln-相关代谢，从而确定了GBM-星形胶质细胞代谢串扰。

结果

谷氨酰胺饥饿无系统地减少GBM细胞增殖

为了探索GBM细胞对不同营养物质供应的生长反应，我们将GBM细胞培养在含有超生理浓度葡萄糖且缺乏一些非必需氨基酸的DMEM中，或者培养在含有与人类血清相当的营养物质浓度的新形成的SMEM中(补充表1). 两种培养基都补充了不同浓度的谷氨酰胺(图1a). 在类血清培养基中，所有细胞系的生长速度与DMEM培养的细胞相当或更快。在这两种培养基中，最大生长所需的最小Gln浓度低于0.65 mM，随后用作对照浓度。在缺乏Gln的情况下，SMEM中的细胞生长更快，表明培养基配方会影响对Gln剥夺的反应。谷氨酰胺饥饿在不同程度上阻碍了增殖(图1b和补充图1a)与以前的报道相反，不会导致细胞死亡三,4以及他们对停糖的反应(图1c). DNA流式细胞术分析表明，谷氨酰胺饥饿不会导致细胞周期在任何特定阶段停滞(图1d和补充图1b). 总的来说，退出Gln会导致细胞株特异性生长抑制，从U251和SF188的20%到LN18细胞的80%不等(图1e)，与初始增殖率无关(图1f).

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谷氨酰胺饥饿降低GBM细胞增殖。(一)在DMEM或SMEM中与指定浓度的Gln孵育3天的细胞株的剂量-反应曲线。(b条)细胞在SMEM+/−Gln中培养指定时间。(c（c）)如图所示，细胞在SMEM+/-Gln或葡萄糖中培养72小时。每个点表示汇流指数上归一化的死亡细胞数（具有质膜完整性损失）。每小时评估一次细胞死亡指数。(d日)培养3天的细胞系的细胞周期分布+/−Gln。3个独立实验的平均值如所示补充图1b. (e（电子）)Gln饥饿引起的生长抑制。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(（f）)细胞系在谷氨酰胺喂养条件下获得的倍增时间的散点图，与谷氨酰胺饥饿引起的生长抑制有关。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(a-d公司)数据来自两次执行的一个实验(一,b条,c（c）)，或三次(d日). 统计源数据中提供了独立重复的原始数据补充表5.

基于Gln的回补对GBM细胞系的增殖不是必需的

为了研究谷氨酰胺饥饿后细胞代谢的变化，用HPLC-MS分析了细胞与培养基之间代谢物的交换率。谷氨酰胺是所有细胞系消耗量第二大的营养素(补充图2和补充表2). 然而，谷氨酰胺消耗量和谷氨酰胺依赖性之间没有明确的关系(图2a和补充图3a). 相反，尽管Glu存在于培养基中，但所有细胞系都显示出Glu的净分泌(图2b). 追踪13C类5-标记的Gln显示，消耗的Gln中有38±8%到60±19%（分别为GUVW和U87细胞）被脱酰胺并分泌为13C类5-谷氨酸(图2a-b). 出乎意料的是，即使是缺乏Gln的细胞也会分泌Glu(图2b，空条）。这里，细胞内Gln几乎耗尽(图2c)谷氨酸浓度下降了50%以上(图2d)然而，乙酰辅酶A(图2e)也不是油酸盐(图2f)水平降低，再次证实Gln在常氧条件下不能维持脂肪酸的生物合成16-20一直以来，在所有细胞系中，只有不到15%的柠檬酸来自还原羧基化(13C类5-柠檬酸盐；补充图3b)以及标记的乙酰辅酶A和油酸盐几乎无法检测到(图2e-f).

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Glu分泌和GLS抑制对GBM细胞生长和代谢的影响。(a-b公司)细胞培养24小时+/-13C类5-格林尼治大学。显示了Gln和Glu同位素的分泌（正条）和消耗（负条）速率。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(立方英尺)如（a-b）所示培养细胞，显示细胞内Gln、Glu、乙酰辅酶a和油酸同位素水平。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(g-h（克-小时）)LN18和SF188细胞在葡萄糖（g）或丙氨酸（h）完全替换为13C类6-葡萄糖或15N个1-丙氨酸。显示了介质中释放的Glu的同位素分布。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(我)在缺乏谷氨酰胺的情况下观察到的谷氨酸分泌散点图，与谷氨酰胺饥饿引起的生长抑制有关。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(j个)的示意图X（X）c（c）−谷氨酸代谢的活性。改编自Bannai等人。40(k)将LN18细胞在添加或不添加Glu、α-酮戊二酸二甲酯（dm-αKG）、柳氮磺胺吡啶（SSZ）或胱氨酸的培养基中培养24小时+/-Gln，并显示Glu的分泌/消耗速率。(l-o公司)LN18细胞按（k）培养，细胞内Glu（l）、天冬氨酸（m）、柠檬酸（n）和还原型谷胱甘肽（o）的水平显示为未处理对照的%。(第页)LN18细胞培养72小时，如（k）所述。细胞数显示为未处理对照的%。平均值±S.E.M.n=4个独立实验。p值是指未配对样本的双尾t检验。(q-r型)细胞在含有0、2.5、5、10、15、30μM BPTES的培养基中预培养3h。在t=0时，将培养基替换为含有13C类5-格林尼治大学。丰富的13C类5-Glu（q）或13C类5-随着时间的推移，监测培养基中的Gln（r）。在所有条件下，细胞均暴露于0.3%二甲基亚砜中。(秒)细胞在+/-2.5μM BPTES培养基中培养72小时，并进行计数。DMSO在所有条件下均为0.3%。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(k,我,米,n个,哦,q个,第页)数据来自一次实验(k,我,米,n个,哦)，或两次(q个,第页). 统计源数据中提供了独立重复的原始数据补充表5.

为了确定谷氨酸饥饿下谷氨酸合成的碳源，将缺乏谷氨酸的LN18和SF188细胞与13C类6-葡萄糖。在这两种情况下，葡萄糖碳对Glu的贡献都显著增加(图2g). 因此，丙氨酸消耗量增加(补充图2，插图），提供Glu生产所需的氮(图2h). 此外，还观察到谷氨酸外排和生长抑制之间有很强的直接相关性(图2i)这表明，在Gln退出后，Glu流出限制了细胞内Glu可用于生长必需反应。

为了测试谷氨酸流出是否确实限制了其可用性和缺乏谷氨酸的细胞的增殖，将LN18细胞与柳氮磺胺吡啶（一种X（X）c（c）−，一种谷氨酸/胱氨酸反向转运蛋白(图2j)在胶质瘤细胞中是活跃的15，或使用4mM Glu，大大超过K我对于X（X）c（c）−21在这两种条件下，Glu的释放都受到了很大的抑制(图2k). 始终如一地X（X）c（c）−通过增加胞外胱氨酸浓度，促进谷氨酸流出(图2k)，紧密联系X（X）c（c）−Glu从GBM细胞中逃逸。抑制X（X）c（c）−防止因谷氨酰胺撤除引起的细胞内谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸的下降(图2l-n). 谷胱甘肽是谷氨酸的另一种代谢途径，在谷氨酸饥饿时谷胱甘苷水平也显著降低，并由谷氨酸和柳氮磺胺吡啶显著补充(图2o). 然而，谷氨酰胺饥饿后谷胱甘肽的下降并没有伴随其氧化作用的增加(补充图3c)表明Gln限定了谷胱甘肽生物合成的Glu可用性，而不会导致氧化应激。此外，向缺乏Gln的细胞中添加膜透性α-酮戊二酸二甲酯（dm-αKG）可使Glu流出量加倍(图2k)补充谷氨酸、天冬氨酸、柠檬酸和谷胱甘肽细胞内池(图2l-o). 总的来说，在缺少Gln的情况下，X（X）c（c）−抑制或补充dm-αKG使细胞内谷氨酸、天冬氨酸、柠檬酸和谷胱甘肽水平恢复到非靶细胞水平。然而，维持这些代谢物的水平只能适度地挽救缺乏谷氨酰胺的细胞的增殖(图2p). 再加上观察到，在谷氨酰胺饥饿状态下，细胞内油酸不受影响(图2f)，葡萄糖依赖性谷氨酸生成增加(图2g-h)这些结果表明Gln对生长的贡献在很大程度上独立于回补。

为了直接评估这一点，采用了GLS抑制剂BPTES。LN18和SF188细胞分泌Gln-衍生Glu的动力学表明，BPTES抑制GLS活性(图2q). 因此，谷氨酰胺消耗率降低(图2r). 然而，在最低有效浓度下，BPTES并不影响GBM株系的生长(图2s和补充图3d-i)在此证实，GLS和基于Gln的补体对最大生长是不可或缺的。

谷氨酰胺合成酶在谷氨酰胺饥饿下维持嘌呤的可用性和细胞生长

接下来，采用基于基因组尺度约束的代谢建模方法22，寻找当Gln从SMEM培养基中去除时变得至关重要的反应。根据该模型，GS是Gln饥饿后维持生物量生产所必需的唯一酶(补充说明).

GS和GLS通过催化相反反应共同控制Gln稳态(图2j和​和3a）。3a年). 所有细胞株中GS和GLS的mRNA水平均未显示出Gln依赖性模式(补充图4a). 虽然有人提出c-Myc通过增加GLS表达来决定Gln成瘾三,23,24,MYC公司-诱导的肺部肿瘤显示GS表达增加2与此相一致，SF188细胞MYC公司放大25，并表达高水平的c-Myc(图3b和补充图4a)，GS mRNA和蛋白水平最高(图3b和补充图4a). 在大多数细胞系中，谷氨酰胺剥夺后GS蛋白水平升高(图3b). 此外，细胞中GS蛋白水平趋于增加，对谷氨酰胺提取的敏感性降低(图3c). 然而，GS与缺乏Gln的细胞中残留的低量Gln不匹配(图2c). 为了研究这种明显的差异，代谢通量通过GS通过纳入15N标记氨(全日空航空公司4+15)在LN18和SF188细胞中转化为Gln，这两种细胞分别显示低和高水平的GS。显著水平的15确实在SF188中检测到N标记的Gln，但在LN18细胞中未检测到(图3d). 接下来，将表现出高GS水平和低Gln提取敏感性的SF188和U251细胞与选择性不可逆GS抑制剂L-蛋氨酸亚砜胺（MSO）孵育，MSO使细胞对Gln饥饿敏感，并进一步消除补充Glu的保护作用(图3e). 为了补充这种方法，通过两个shRNA序列在这些细胞中稳定沉默GS表达(图3f). Gln饥饿时细胞增殖(图3g)以及菌落的形成(图3h和补充图4b)通过GS静音降低。补充谷胱甘肽底物谷氨酸和氨，比谷胱甘氨酸诱导的细胞更有效地挽救缺乏谷氨酸的对照细胞。

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GS在谷氨酰胺饥饿期间维持细胞生长。(一)GS和GLS催化的反应。(b条)培养细胞24小时+/-谷氨酰胺，并评估蛋白质表达。未经处理的western印迹扫描如所示补充图8. (c（c）)在Gln喂养条件下观察到的GS蛋白表达的散点图（任意单位，AU）与Gln饥饿引起的生长抑制有关。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(d日)LN18和SF188细胞在0.8 mM的存在下培养24小时+/-Gln全日空航空公司4+15。细胞内Gln同位素水平显示为%15N个0-LN18细胞中的Gln。数据来自两次执行的一个实验。统计源数据中提供了独立重复的原始数据补充表5. (e（电子）)如图所示，在补充有4mM Glu和1mM MSO的培养基中培养SF188和U251细胞72小时+/-Gln。细胞数量显示为未处理对照的百分比。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(（f）)将稳定表达非靶向对照shRNA（shNTC）或靶向GS的两个序列（shGS-1和shGS-2）的SF188和U251细胞培养24h+/-Gln。(克)在补充有4mM Glu和0.8mM Glu的培养基中培养细胞72小时+/-Gln全日空航空公司4+，如图所示。单元数显示为各个Gln-fed控制的%。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(小时)细胞在补充有4mM Glu和0.8mM Glu的培养基中培养12-17天+/-Gln全日空航空公司4+如图所示。显示了在代表性井中获得的菌落。n=4个独立实验，量化如所示补充图4b.

为了证实Gln生物合成和Gln依赖性之间的因果关系，GS在LN18细胞中过度表达，表现出低GS水平和对Gln剥夺的高度敏感性。为此，仅稳定表达红外荧光蛋白（iRFP）的LN18衍生克隆26,27或建立iRFP和GS。为了消除固有的克隆变异性，在多个克隆（6个iRFP和9个iRFP-GS）中评估了GS的表达及其在谷氨酰胺饥饿下对生长的影响。饥饿五天后，iRFP对照细胞的生长平均达到对照Gln-fed细胞的16%±5%，而iRFP-GS克隆的生长平均为54%±12%(图4a). 在补充谷氨酰胺的情况下，iRFP-GS5克隆增殖速度慢于iRFP控件。这并没有通过使用MSO抑制GS来纠正(图5b)与报道的GS的非代谢、抗增殖作用一致28然而，iRFP-GS5，但不控制iRFP4细胞在无谷氨酰胺培养基中增殖并形成菌落，MSO阻止了这种生长优势(图4b-c). 这些结果表明，在谷氨酰胺饥饿的情况下，谷氨酸的酰胺化通过GS维持细胞生长。与此一致，当补充15N个1-显示氨、GS-表达细胞15N掺入总Gln库的约50%，即使在Gln喂养时也是如此(图4d). 当与15N个1-无Gln的氨，iRFP-GS中细胞内残留Gln较高5单元格与对照iRFP的比较4细胞，根据判断完全由GS产生15N公司(图4d).

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GS活性调节细胞生长和谷氨酰胺饥饿时嘌呤的可用性。(一)顶部：稳定表达iRFP或iRFP-GS的LN18克隆培养+/-Gln 5天，并评估蛋白质表达。western blot的未处理扫描如所示补充图8底部：每个克隆的生长量由蛋白质量决定，并表示为各自对照的%。虚线显示获得的平均%值-Gln。(b条)国际招标书4和iRFP-GS5细胞在培养基+/−Gln和MSO（1mM）中培养指定时间，并进行计数。(c（c）)国际招标书4和iRFP-GS5细胞被+/-谷氨酰胺和MSO（1mM）培养21天，显示了代表性微孔中的菌落。数据来自两次执行的一个实验。(d-j型)国际招标书4和iRFP-GS5细胞在添加0.8 mM的培养基中培养+/-Gln 24小时全日空航空公司4+15Gln、UMP、AICAR、IMP、AMP、ATP和GTP的细胞内同位素显示为15N个0iRFP中的代谢物4Gln存在下的细胞。(k)将细胞株培养+/-Gln 24小时，显示细胞内IMP的相对量。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(我)细胞内IMP水平变化与谷氨酰胺饥饿引起的生长抑制相关的散点图。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(m-n个)国际招标书4（m） 和iRFP-GS5（n） 细胞在含有腺苷（A）鸟嘌呤（G）胞苷（C）胸腺嘧啶（T）尿苷（U）的培养基中培养72h+/-Gln，每个培养基的浓度为0.2mM，或组合培养基（AGCTU）的浓度为0.2 mM，Glu（4mM），MSO（1mM），如图所示。细胞数量显示为未处理对照的百分比。虚线显示在没有任何进一步补充的Gln的情况下获得的百分比值。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(一,b条,d日,e（电子）,（f）,克,小时,我,j个)数据来源于一次实验(一,b条)或两次(d日-j个). 统计源数据中提供了独立重复的原始数据补充表5.

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分化（DIFF）和GBM干样（GSC）原代人GBM细胞中的Gln代谢。(一)在DMEM/F-12中保存的E2、R10和R24细胞中评估蛋白质表达，并按照方法部分所述进行补充。箭头指向SOX2特定频带。显示了重复两次的代表性实验。western blot的未处理扫描如所示补充图8. (b条)细胞在补充了SMEM（如方法部分所述）、+/-0.65mM Gln和1mM MSO（如所示）的SMEM中培养。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(c-d公司)补充0.8mM Gln的SMEM+/-0.65mM Gln培养24小时后，细胞中Gln（c）和Glu（d）同位素的交换率全日空航空公司4+15平均值±S.E.M.n=3个独立实验。(电子-小时)培养细胞中Gln（e）、Glu（f）、柠檬酸（g）和AMP（h）同位素的细胞内含量，如（c-d）所示。平均值±S.E.M.n=3个独立实验。

探讨从头开始在Gln饥饿条件下合成Gln，我们采用通量不平衡分析29.生物信息学核苷酸生物合成限制了细胞生长，嘌呤生物合成的加权成本更高(补充说明). 事实上，无论GS状态如何，Gln的去除仅对嘧啶核苷酸尿苷单磷酸（UMP）水平产生轻微影响(图4e). 此外，GS衍生的贡献15N个1-Gln至15N个1-UMP显示iRFP中的低GS活性4细胞可以维持UMP的产生。同样，在iRFP中也维持了UDP-N-乙酰葡萄糖胺的生物合成，这是己糖胺生物合成的中间产物，需要谷氨酰胺衍生的氮4谷氨酰胺饥饿期间的细胞(补充图4c). 相比之下，5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR），一种肌苷一磷酸（IMP）的嘌呤前体，在缺乏谷氨酰胺的iRFP中下降到无法检测到的水平4单元格(图4f). 氨衍生AICAR(15N个2-同位素极化）5细胞表明GS提供了生物合成所需的两个Gln氮原子(图4f). 因此，15N个2-缺乏Gln的iRFP-GS中积累的IMP5细胞，但不在iRFP中4单元格(图4g). iRFP GS中发现的IMP5饥饿细胞证实了Gln剥夺对IMP脱氢酶的抑制作用30并表明在这些条件下，GS的过活性超过了IMP转化为AMP和GMP的速率。事实上，AMP水平没有受到Gln存在或GS过度表达的显著影响(图4h). 此外，细胞生物能量状态的指标ATP和GTP水平在iRFP-GS之间具有可比性5和iRFP4饥饿细胞(图4i-j). 相反，分数15iRFP-GS中发现N标记的AMP、ATP和GTP5单元数超过了iRFP4细胞，证明在谷氨酰胺饥饿状态下，谷胱甘肽能够维持从头开始嘌呤核苷酸的生物合成。

值得注意的是，六个GBM细胞系中因谷氨酰胺饥饿导致的IMP减少与谷氨酰胺依赖性相关(图4k-l). 因此，腺苷而非鸟苷或嘧啶核苷部分恢复了iRFP的非Gln依赖性生长4单元格(图4m). 此外，腺苷和Glu的联合添加弥补了iRFP中外源性Gln的缺乏4单元格(图4m)仅Glu可完全恢复iRFP-GS的增殖5饥饿细胞(图4n). 在这两条线路中，MSO阻止了Glu的救援，证实了在Gln饥饿情况下，Glu的可用性决定了Gln的生成，而不是回复。腺苷对缺乏谷氨酰胺的细胞的作用是非MSO依赖性的(图4m-n)，因为它支持GS下游的扩散。

初级人类GBM干细胞能够满足Gln需求

研究已建立的胶质瘤细胞系的临床相关性受到质疑，因为它们无法形成重演人类病理学的肿瘤。因此，我们利用三种主要的患者源性GBM细胞系（E2、R10、R24），产生分化细胞（DIFF）和胶质瘤干样细胞（GSC）的配对群体31干细胞标记物，如CD133、Olig2和Sox2，主要在GSC中表达，但在DIFF中不表达，然而星形细胞标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与DIFF人群并不一致(图5a). 与DIFF相比，GS在所有GSC中的表达显著增高(图5a)虽然在缺乏Gln的情况下DIFF增殖减弱，但GSC的生长与补充Gln无关(图5b). MSO再次消除了缺乏谷氨酸的DIFF和GSC的生长(图5b).

其次，汇率(图5c-d)和代谢物的细胞内成分(图5e-h)在这些缺乏谷氨酰胺的原代细胞或对照细胞中进行分析15N个1-氨。DIFF中的Gln净消耗量始终高于GSC，因此R24-GSC没有显示出Gln净消耗量(图5c). 作为细胞内15N个1-Gln分数显示，与DIFF相比，GSC具有更高的GS活性，并且在饥饿时保持更高的残留Gln水平(图5e). Glu交换率的差异也很显著：GSC表现出对Glu的净吸收，而DIFF则相反(图5d). 此外，在Gln退出后，细胞内柠檬酸盐水平(图5g)DIFF减少，但GSC保持不变，表明Gln-衍生的回补对于干细胞样群体是多余的。最终氨衍生15N并入嘌呤核苷酸(15N个2-与成对的DIFF相比，Gln饥饿下GSC中的AMP）更大。

人类GBM肿瘤依赖于原位从头开始Gln合成

如上所示，GS活性在很大程度上决定了Gln依赖性，在已建立的人GBM细胞和原代人GBM电池之间存在差异。同样，组织芯片（TMA）分析显示，人类GBM患者（n=209）的GS表达不同，类似于高斯分布，从GS水平较低的肿瘤（与神经元相当（25%的患者）到与星形胶质细胞相当的高表达肿瘤（15%）(图6a-b). 然而，GS表达并不能预测患者的中位生存率(图6c). 在对核心TMA进行取样的20例活检中，有5例显示出明显的肿瘤内GS免疫染色异质性（有3例报告于补充图5). 大多数GBM要么表现出GS的均匀性，要么表现为GS阳性细胞的镶嵌浸润，表明其具有肿瘤内Gln的自主生物合成能力。为了在人类肿瘤中评估这一假设，对7名GBM患者注射13C类6-手术前提取葡萄糖，并从切除的肿瘤及其水肿边缘提取代谢物。代谢分析通过使用胆碱与肌酸比率可靠地区分肿瘤和邻近组织，这是一个通过磁共振波谱对脑肿瘤进行分类的参数32(图6d). 肿瘤和邻近组织之间未观察到Gln含量的显著差异(图6e). 切除时，13C类6-血清中葡萄糖浓度在16%到50%之间(图6f、和补充图6a). 葡萄糖衍生的13C-Gln在6/7的肿瘤和7/7的邻近水肿组织中检测到，其富集范围为1%至12%(图6g). 在3/5的患者中，肿瘤中葡萄糖衍生的谷氨酰胺的比例高于血清样本中的比例，因此与循环的谷氨酰胺不平衡，这表明肿瘤的谷氨酰胺库是合成的就地和/或由邻近正常大脑提供。

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GBM患者和原发性原位异种移植物的Gln代谢。(一)GBM组织芯片。低倍和高倍（顶部和底部分别）下代表性组织核心的GS免疫染色。A： 星形胶质细胞，N：神经元。(b条)GBM患者（n=209）的频率分布根据其GS的组织评分进行划分，分为低、中和高。正常星形胶质细胞被用作确定最大免疫反应性的参考。(c（c）)GBM患者的Kaplan-Meier曲线分为低、中、高GS表达。p值指的是对数秩（Mantel-Cox）检验。(d-e公司)GBM患者肿瘤组织和邻近水肿脑内注射13C类6-术前血糖。n=7名患者，p值指配对样本的双尾t检验。(f-g（胎龄）)13C类6-葡萄糖（f），以及13肿瘤切除时血清、肿瘤组织和邻近水肿组织中的C-Gln（g）富集。包含一种或多种Gln同位素13显示了C-原子在检测到的Gln总量（占总量的%）上。na：不可用，nd：无法检测。修正了天然丰度值13C、(小时)人类P3-GBM异种移植物的冠状切片生长在免疫功能低下小鼠的大脑中，并对人类巢蛋白和谷胱甘肽进行染色。下面板是相应框架区域的放大图。A： 星形细胞，AF：星形细胞终末足，N：神经元，V：血管。(我,j个)在小鼠体内获得的代谢物（己糖磷酸盐、柠檬酸盐、α-KG、Glu、Gln）的等极性分布，这些代谢物是用人P3 GBM原位异种移植的，并在尾部注射一团13C类6-葡萄糖（i）或13C类5-Gln（j）。注射后22分钟对组织进行取样。所有条件下的数值均为平均值±S.E.M.n=3只小鼠，但注射葡萄糖的小鼠的对侧大脑除外，其中使用了2只小鼠。(我,j个)统计源数据中提供了独立重复的原始数据补充表5.

为了补充患者的分析，将GS阳性的人GBM（P3，图6h)并注入13C-标记葡萄糖或Gln在组织提取前约20分钟。富集44±3%13C类6-在组织采样时，在血液中发现了葡萄糖。细胞内己糖磷酸池来源于13C类6-肿瘤和对侧脑组织中的葡萄糖含量分别为~10%和5%(图6i). 同时，约10%和15%的总Gln被标记(13C类2)来自13C类6-肿瘤和对侧脑中的葡萄糖(图6i)与这些组织中的GS活性一致。之后13C类5-Gln注入，循环浓缩13C类5-组织取样时的Gln为17±1%。同位素分布分析显示13C类5-肿瘤和对侧脑组织中Gln均<5%(图6j)，而在肝脏中，13C类5-Gln占总数的12%(补充图6e). 谷氨酸分解产物，如谷氨酸和α-酮戊二酸，在肿瘤和脑组织中标记低于1%，但在肝脏中标记约5%(图6j和补充图6e). 这些结果表明，与肝脏相比，血液中谷氨酰胺的摄取以及GBM和脑组织中谷氨酰胺分解的动力学较慢。在恒定颈动脉上也得到了类似的结果13C类5-Gln输注：两小时内，循环13C类5-Gln水平在浓缩约20%时趋于稳定，Gln稳态水平总体增加约70%(补充图6f). 这里也是，13C类5-肿瘤和对侧脑中缺乏谷氨酰胺和谷氨酰胺分解产物(补充图6h-i)这表明，在生理上，循环的谷氨酰胺不能显著地向大脑或其内的肿瘤供应谷氨酰胺。

其次是Erwinase，一种暂时耗尽循环天冬酰胺（Asn）并显著降低Gln的酶9,33(图7a)每天（每周五次）将，注射到携带GS阴性原位GBM异种移植物（T101，图7b). Erwinase降低肿瘤内和脑内Asn，但不降低Gln(图7c). GS阴性肿瘤的弥散形态受损体外MRI分析体积定量(图7d). 组织重建评估肿瘤负担(图7e)对照组和酶处理组之间无显著差异(图7f). 总之，这些结果表明，Gln不是由血液提供给GBM的，因此，GS阳性星形胶质细胞和GS阴性胶质瘤细胞的邻近性(图7b和7g作为代表）表明星形胶质细胞可能是Gln的来源。事实上，当小鼠携带GS阴性GBM异种移植物（T407，图7g)被注入15N个1-氨进入颈动脉4小时15肿瘤和对侧脑组织中的N-Gln均为~5%(图7h)这表明它们是一个隐蔽的、自主的Gln生物合成和利用隔间，表达GS的细胞向GS阴性的细胞提供Gln。

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低GS表达的GBM肿瘤的谷氨酰胺供应。(一)通过HPLC-MS测量在指定时间点从腹膜内注射Erwinase（5U/gr体重）的免疫功能受损小鼠获得的外周血样本中的Gln和Asn水平。平均值±S.E.M.n=5只小鼠。p值是指成对样本的双尾t检验。(b条)生长在免疫功能受损小鼠大脑中的人T101 GBM异种移植物的冠状切片，并对人巢蛋白和GS进行染色。左图为各框区域的放大图。A： 星形胶质细胞，N：神经元。(c（c）)按照方法一节中的描述，将免疫功能低下的小鼠原位植入T101 GBM肿瘤，并用欧文酶治疗6周。在最后一次注射欧文酶后6h，对肿瘤和对侧大脑中的Asn和Gln进行评估。平均值±S.E.M.n=3只小鼠。(d日)如（c）所述，用Erwinase治疗的T101 GBM肿瘤的基于MRI的表观扩散系数（ADC）图。肿瘤掩模已被手动描绘以突出肿瘤区域。显示了与MRI扫描相对应的脑切片的IHC染色。T101肿瘤用抗人EGFR抗体染色。(e（电子）)对两组具有代表性的T101脑异种移植物冠状切片进行人类EGFR染色。如（c）所示，用欧文酶处理小鼠。(（f）)T101原位肿瘤的体积获得了EGFR-染色的大脑连续切片的彻底定量成像。如（c）所示，用欧文酶处理小鼠。平均值±S.E.M.n=7只小鼠。p值是指未配对样本的双尾t检验。(克)人类T407 GBM异种移植物的冠状切片生长在免疫缺陷小鼠的大脑中，并对人类巢蛋白和谷胱甘肽进行染色。左侧面板是相应框架区域的放大图。A： 星形胶质细胞，V：血管。(小时)15N个1-在T407 GBM肿瘤和对侧大脑中，经颈动脉内输注全日空航空公司4+15.虚线表示15N个1-格林尼治大学。平均值±S.E.M.n=4只小鼠。p值是指配对样本的双尾t检验。

缺乏谷氨酰胺的GBM细胞以星形胶质细胞衍生的谷氨酰胺为食

为了评估这种潜在的相互作用，培养了大鼠初级皮质星形胶质细胞，并研究了它们的谷氨酰胺需求和代谢。与GBM细胞类似，星形胶质细胞最大生长所需的最小Gln浓度为~0.65 mM(图8a). 尽管如此，胶质细胞增殖几乎不受谷氨酰胺剥夺的影响(图8b). 正如在人类TMA中观察到的那样(图6a)星形胶质细胞和表达最高的GBM细胞中的GS蛋白水平具有可比性(图8c). 然而，只有星形胶质细胞没有表现出Gln净消耗，而是Glu快速摄取(图8d-e)，与该细胞类型中兴奋性氨基酸转运蛋白（EAAT）的表达一致34在谷氨酰胺饥饿的情况下，谷氨酰胺的消耗不受影响，并与等摩尔净谷氨酰胺流出平行(图8d-e). 培养基中缺少Gln会降低细胞内Gln，但不会降低Glu(图8f-g). 此外，13C类6-葡萄糖示踪显示，只有30-40%的细胞内Glu和Gln(图8f-g)是葡萄糖衍生的。星形胶质细胞在Gln饥饿的情况下维持了细胞内Gln控制水平的约30%(图8f和8h)，符合高GS表达。从这两方面来看，谷氨酰胺的维持依赖于谷胱甘肽的活性15N个1-MSO对氨的示踪和GS的抑制(图8h). 此外，GS抑制显著提高了其底物Glu的细胞内含量(图8i)，而不改变Gln-产物AMP的稳态水平(图8j). 然而，联合使用Gln撤除和GS抑制显著降低了来自从头开始合成(15N个2和15N个三;图8j)并阻碍了扩散(图8k).

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星形胶质细胞以Gln-GBM细胞为食。(一,b条)星形胶质细胞在SMEM中用0、0.1、0.3、0.65、1、2、4mM Gln（a）孵育6天，或用0和0.65mM Gln。(c（c）)将来自两个独立提取物和细胞系的星形胶质细胞培养3天+/-谷氨酰胺和蛋白质表达评估。western blot的未处理扫描如所示补充图8. (d-j型)星形胶质细胞在含有5.56mM葡萄糖的SMEM中培养24小时(13C类6或13C类0)，0.65mM Gln(13C类5或13C类0)，0.8毫米15全日空航空公司4+和1mM MSO，如图所示。显示了Gln（d）和Glu（e）的分泌/消耗率（分别为正/负条形）。细胞内Gln（f）和Glu（g）同位素水平报告为对照组的%（Gln喂养条件下的同位素总量）。Gln（h）、Glu（i）、AMP（j）的细胞内同位素显示为对照的%（存在Gln和15全日空航空公司4. (k)培养星形胶质细胞6天+/-0.65mM Gln和1mM MSO并计数。(我)星形胶质细胞在多孔板中生长汇合。国际招标书4细胞接种在+/-孔星形胶质细胞和+/-Gln中。显示了典型井中iRFP4细胞的荧光。实验进行了两次，结果相当。(米)星形胶质细胞在多孔板中生长汇合。iRFP公司4如图所示，接种在跨孔插入物中的细胞是共同培养的+/-星形胶质细胞、+/-谷氨酰胺和+/-欧文酶（Erw）。显示了代表性插入物中iRFP4细胞的荧光。在第5天，星形胶质细胞用磺酰亚胺-B染色，并显示代表性孔的荧光。(n个)iRFP的量化4如（m）所述的荧光。(一,b条,d日,e（电子）,（f）,克,小时,我,j个,k,n个)数据来自两次执行的一个实验。统计源数据中提供了独立重复的原始数据补充表5.

最后，在共培养中，星形胶质细胞使GS阴性LN18 iRFP增殖4不添加谷氨酰胺的细胞(图8l). 此外，这些细胞的跨阱共培养表明，传递生长的因子是扩散的(图8m-n). 添加Erwinase会耗尽Asn和Gln，阻止星形胶质细胞对Gln缺失细胞的救援(图8m-n). 由于在所有谷氨酰胺饥饿实验中，培养基中都存在谷氨酰胺，并且星形胶质细胞消耗谷氨酰胺，但产生并分泌谷氨酰胺(图8d和补充图6k)这些结果表明，星形胶质细胞衍生的Gln是缺乏Gln的GBM细胞的生长支持因子。

讨论

Gln发挥着多种代谢和非代谢作用。因此，很难辨别癌细胞对谷氨酰胺的依赖性。然而，这里证明了GBM中的Gln要求超出了补充剂(图2q-s). 我们确定了Gln敏感性的两个替代代谢决定因素：1）Glu释放通过这个X（X）c（c）−反转运蛋白和2）Glu到Gln的依赖于GS的转化。GS和X（X）c（c）−似乎在竞争细胞质谷氨酸，在谷氨酸饥饿期间，谷氨酸变得有限(图2d，l). 然而，通过维持细胞内谷氨酸通过X（X）c（c）−抑制作用取决于GS活性(图3e、h、g和图4m-n). 这些结果表明，当谷氨酸饥饿时，谷氨酸转化为谷氨酸构成生长所需的关键限制反应。这种代谢特性适用于已建立的GBM系和幼稚的原代细胞。事实上，当原代GBM细胞保持干样状态时，GS表达显著增加(图5a)Glu被吸收而不是释放(图5d). 这两种反应都能使胶质瘤干细胞独立于细胞外Gln生长(图5b). 新合成的Gln在已建立和原代GBM细胞中的命运由15N个1-氨追踪，确定AMP生物合成途径在谷氨酰胺依赖性中的重要作用(图4 d-j和图5h).

GS存在于大多数人类GBM中(图6a-b)，其表达与预后不良相关35尽管我们的TMA研究不支持这一点。然而，我们发现GS的表达在肿瘤之间差异很大，从阴性（与神经元中的GS表达相似）到高表达（与正常星形胶质细胞中的GS-表达相似）不等。这种变异符合富含Gln的肿瘤微环境，从而减少了合成Gln的需要。然而，与以前的报告一致36,37这里显示，大多数人类GBM以及GS产生的原位GBM异种移植物从TCA循环（卡普鲁斯）中提取碳来合成Gln通过与肝脏相比，GBM倾向于净Gln合成，而不是谷氨酰胺分解(图6i和补充图6d). 因此，血液循环为正常大脑提供了最少的谷氨酰胺38和GBM(图6l和补充图6f，h，i). 此外，循环中Gln水平的显著降低并不影响肿瘤的生长(图7a-h)而且，表达低GS的GBM的氨衍生Gln水平与对侧大脑相当(图7j). Gln水平的稳定性可以解释患者之间GS表达的异质性(图6b)在一些肿瘤中(补充图5)：GS-阳性星形胶质细胞和/或GBM细胞（可能是GSC）分泌支持GS-阴性GBM细胞生长的Gln。事实上，培养的原代星形胶质细胞保留了Glu摄取、依赖于GS的Gln合成和Gln分泌的代谢特征，并支持GS-阴性、Gln-营养缺陷型GBM细胞的增殖(图8l-n). 因此，这种脑对肿瘤的代谢通讯描绘了这样一个场景：由星形胶质细胞提供的谷氨酰胺喂养GS阴性癌细胞(图3g). 事实上，在原位异种移植和人类肿瘤中，星形胶质细胞的GS-阳性细胞突起围绕着GS-阴性GBM细胞(图7b，g和补充图5p). 癌细胞的这种“寄生”行为可能会改变大脑中的生理Gln-Glu循环，事实上，据报道，GBM表达低GS的患者癫痫发作增加39.

方法

细胞培养

人类胶质母细胞瘤细胞系MOG-G-UVW、LN-18、LN-229、SF-188、U-251 MG、U-87 MG（以下分别称为GUVW，LN18，LN229，SF188，U251，U87）是从以下来源获得的：GUVW:格拉斯哥大学Ian Freshney博士最初分离的冻存物；LN18和LN229:ATCC；SF188：加州大学旧金山分校脑瘤组织库；U251和U87分别由Kevin Ryan教授和Anthony Chalmers教授赠送。使用Promega GenePrint 10系统（扩增9个四核苷酸重复位点和Amelogenin性别决定标记的STR多重分析）对细胞系进行鉴定。在ICLAC数据库中未发现手稿中使用的常见错误识别的细胞系。皮质星形胶质细胞由P7 Sprague-Dawley大鼠幼崽（未分类性别）的皮质产生。简单地说，从每只幼崽身上取下两个皮层，清除脑膜，并按前面所述进行酶解和纯化。将2只幼崽的组织添加到每个75cm2组织培养聚-L-赖氨酸涂层烧瓶（13μg/ml，Sigma）。通过对胶质纤维酸性蛋白的免疫反应评估，用这种方法制备的星形胶质细胞纯度超过95%41.

用MycoAlert检测所有细胞株支原体阴性™使用支原体检测试剂盒（Lonza）进行测试。细胞保存在补充有2 mM谷氨酰胺和10%FBS的DMEM（Invitrogen 21969-035）中。所有实验均在接种细胞上进行，并在一种血清样培养基（SMEM）中培养至少24小时，SMEM的配方如补充表1，并补充10%FBS，在半渗透纤维素膜上进行透析（3.5kDa MW截止值）。

在共培养实验中，将30000个星形胶质细胞/孔置于24孔板中，并允许其生长汇合，然后将稳定表达红外荧光蛋白iRFP的LN18衍生克隆4，电镀25000个电池/孔或5000个iRFP4细胞/跨阱（Costar，CLS3413）分别接种在完全培养基中进行直接或跨阱共培养实验。iRFP的第二天4用PBS对细胞培养物进行广泛清洗，在含有星形胶质细胞的孔中插入一个跨阱，并用下列条件替换培养基图8l，n在整个实验期间，每天更新一半的培养基。通过使用Licor Odyssey扫描仪和量化的Image Studio 2.0软件测量荧光来评估生长情况。

获得E2、R10和R24人胶质母细胞瘤细胞，并按先前报道的方法进行培养，但进行了少量修改31在短暂分化（DIFF）细胞中，在补充有10%FBS和2mM L-Gln的晚期DMEM/F-12（Gibco）中维持细胞，而胶质瘤干样细胞（GSC）在补充有B27（1%，Invitrogen）、N2（0.5%，Invit罗gen），4μg/ml肝素，20 ng/ml成纤维细胞生长因子2（bFGF，Sigma），20 ng/ml表皮生长因子（EGF，Sigma）、1mM丙酮酸和2mM L-谷氨酰胺。在所有实验中，将干细胞接种在如上所述补充的SMEM中并培养，而将DIFF细胞接种在补充10%透析FBS的高级DMEM/F-12中并培育。如图所示，添加0.65mM谷氨酰胺。

细胞数评估

在24孔板中以20000个细胞/孔的密度对细胞进行电镀。在规定的实验时间评估细胞数量，如下所示：每个孔用PBS洗涤两次，胰酶消化，细胞重新悬浮在Casyton溶液中，并用Casy细胞计数器计数。倍增时间（DT）是使用GraphPad棱镜5.0的指数增长方程获得的。生长抑制率根据以下公式计算：[1−(DT公司(+格林)DT公司(−格林))]×100

细胞死亡评估

将细胞以15000个细胞/孔的密度放置在12孔板中。2天后，将细胞置于含有或不含葡萄糖和Gln的培养基中，并补充CellTox™绿色染料（1:1000，Promega，G8731）。细胞在IncuCyteTM FLR（EssenBioScience）中培养72小时，在此期间每隔15分钟拍摄一次亮场和荧光照片。对于每个时间点，通过在融合指数上除以死亡细胞的数量来计算细胞死亡指数。

细胞周期分析

收集培养基和细胞，离心并用PBS洗涤。然后用冷甲醇固定细胞，并用含有碘化丙啶（100μg/ml）和RNA酶a（250μg/ml）的PBS溶液染色。使用Beckton Dickinson FACScan流式细胞仪测量DNA核含量，并使用FlowJo软件分析数据。

组织微阵列（TMA）和免疫组织化学（IHC）

挪威卑尔根Haukeland大学医院的区域伦理委员会批准了人体活检组织的采集（REK 013.09）。所有患者都出具了肿瘤活检采集的书面知情同意书，并签署了一份声明，允许使用其活检标本进行研究。胶质母细胞瘤癌组织的核心组织（n=209）由病理学家鉴定，并从患者手术切除的肿瘤的代表区域采集。为每位患者收集三份组织核心。收集随访细节，包括死亡日期和原因。对于TMA和小鼠脑切片的IHC分析，遵循以下程序。在pH 6的柠檬酸盐缓冲液中，在98°C下进行15'的表位检索。使用EnVision System-HRP DAB（Dako，K4006）进行免疫染色。核心与一级抗体孵育过夜。用苏木精对岩芯进行复染，脱水并盖住。使用加权组织学方法对染色进行量化，最终值范围为0-300。正常星形胶质细胞的免疫染色强度被归类为300，并用作参考。低-中-高谷氨酰胺合成酶（GS）表达组的定义见图6b对于TMA和IHC，以下抗体在TBS-tween中5%BSA的溶液中稀释，并按规定的稀释度使用：纯化的小鼠抗人单克隆GS抗体（BD转导实验室，Cat 610518，克隆6，最终浓度为250ng/ml）；小鼠单克隆抗人巢蛋白抗体（Abcam ab6320，克隆3k1，1:500）；小鼠抗人EGFR单克隆抗体（Dako 7239克隆E30，1:200，室温下1h）。对于通过IHC进行肿瘤体积量化，将小鼠大脑石蜡包埋并完全切片为8μm的切片。每个载玻片上加载两个切片，每10个载玻片中有一个切片进行EGFR染色。使用Leica SCN400 Slide扫描仪采集数字图像，加载到Matlab中，进行校准，识别染色阳性像素，并用于量化肿瘤体积。所有显示的IHC染色均代表三个或多个切片。

GBM患者的代谢研究

在进行肿瘤手术切除之前，7名GBM患者接受了15分钟20克的静脉注射13C类6-葡萄糖。手术期间，对肿瘤核心和外围区域的组织碎片进行立体定向取样（每个区域约200 mg）。平均而言，在葡萄糖注射结束后47分钟（范围30-80分钟），将标本进行快速冷冻。在组织采样的同时采集外周血样本。进一步从肿瘤的外围和核心区域以及水肿的邻近组织中解剖冷冻组织（15-25 mg）的亚碎片。样品在干冰上提取，并按照下文所述进行处理，用于人类原位GBM异种移植物。

所有参与研究的人类受试者都获得了知情同意，重同位素给药和手术切除组织的采集得到了挪威卑尔根Haukeland大学医院区域伦理委员会的批准（REK 2010/130-2）。

原发性原位人GBM异种移植物

如前所述，生成了患者源性GBM异种移植物42,43简而言之，使用Hamilton注射器将GBM患者衍生球体立体定向植入8-12周龄NOD-SCID雄性和雌性小鼠（里昂Charles River）的右额叶皮层（美国里昂Hamilton）。4-6周后，P3 GBM肿瘤在大脑中完全形成，U-13C类6-葡萄糖或U-13C类5-谷氨酰胺（剑桥同位素实验室，Tewksbury，MA）以团注的形式在尾静脉注射，剂量分别为1mg/gr和0.15mg/gr体重。注射后22分钟，动物被安乐死，器官被解剖，肿瘤和对侧脑碎片被快速冷冻。对于颈动脉内输注，小鼠被氯胺酮-美托咪定-异氟醚麻醉，并接受手术暴露右颈动脉。4.7μmol/Kg/min的15N个1在NOD SCID小鼠（查尔斯河，里昂）原位异种移植T407 GBM后，注射0.833μl/min氨4h13C类5-将0.125μl/min谷氨酰胺注入8周龄雌性瑞士Nu/Nu小鼠（查尔斯河，里昂）原位异种移植GS阳性T16 GBM，持续4h。为了评估Erwinase的效果，将T101肿瘤球体植入8周龄女性瑞士Nu/Nu小鼠（查尔斯河，里翁）中（6/只）。植入42天后，将小鼠随机分为Erwinase治疗组和对照组。腹腔注射欧文酶5U/gr体重，每周5次。治疗持续6周。对照组小鼠腹腔注射生理盐水。最后一次注射6小时后，对小鼠实施安乐死，并将肿瘤和对侧脑碎片快速冷冻以进行代谢分析。立即将整个大脑固定在4%多聚甲醛中体外MRI。为了进行代谢分析，使用珠磨机（Qiagen，Tissuelyzer）在含有20%水、50%甲醇、30%乙腈（25μl提取液/mg组织）的溶液中提取10-20mg组织。将提取物在16000g下旋转10分钟，并将上清液储存在-80°C下进行LC-MS分析。人类胶质母细胞瘤活检取自卢森堡中心医院神经外科（CHL）。所有患者都提供了书面知情同意书，其程序得到了卢森堡国家研究伦理委员会（CNER）批准的项目（项目编号：REC-LRNO-20110708）。根据欧洲动物实验指令（2010/63/EU）和卢森堡国家法规以及当地伦理委员会（动物福利机构（AWS）LIH）批准的协议（协议编号：LRNO-2014-06），对动物进行处理和手术。

MRI分析

在Erwinase治疗结束时，收集20周龄患有T101肿瘤的瑞士Nu/Nu小鼠（7只雌性小鼠/组）的大脑，并将其固定在4%的多聚甲醛中。体外扫描在7T micro-MRI系统（Bruker PharmaScan）上进行，使用小鼠大脑体积线圈。T2加权MRI协议使用快速自旋回波序列，TE=36 ms，TR=4300 ms，平面分辨率为63μm。扩散加权成像（DWI）序列使用EPI读数，TE=28.5ms，TR=7000ms，b值在3个方向上为500至6000 s/mm2。两名使用者（A.O.和O.K.）使用Paravision 5.0（Bruker；Ettlingen，德国）独立描绘肿瘤。

免疫印迹法

用冷PBS洗涤细胞两次，并在添加有1mM Na3VO4、1mM NaF和蛋白抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液（20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton、2,5mM焦磷酸钠、1mM甘油磷酸）中溶解细胞。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用双钦尼克酸测定法（Thermo-scientific）测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质与Laemmli缓冲液4×（250 mM Tris-HCl，pH 6.8，8%SDS，40%甘油，0.4 M DTT）混合，在95°C下加热5 min，并装入10%凝胶上进行SDS-PAGE。电泳分离后，将蛋白质印在0.22 mm硝化纤维素膜（Millipore）上，用5%的非脂肪乳在TBS-Tween中封闭，并在4°C下与以下抗体孵育过夜：谷氨酰胺合成酶（BD Transduction Labs，610517，clone 6，1:1000），β-微管蛋白（Sigma-Aldrich，T5201，clone AA2，1:5000），GLS（Abcam，ab60709，1:1000），c-Myc（Cell Signaling Technology，5605，clone D84C12，1:1000，）胶质纤维酸性蛋白（Dako，Z0334，1:10000），SOX2（Abcam，ab75485，clone 57CT23.3.4，1:1000。），CD133（Miltenyl Biotec，W6B3C1，clone W6B3C1,1:1000），Olig2（研发系统，AF2418，1:500），Actin（圣克鲁斯生物技术，sc-1616-R，1:100）。然后清洗膜，并用二级驴抗兔（Licor 926 32213，1:10000）或驴抗鼠（Lictor 926 31212，1:1000）孵育。使用Licor Odyssey扫描仪进行红外扫描，并使用Image Studio 2.0进行采集。除非另有说明，否则所示的所有蛋白印迹均代表两个实验。

qPCR分析

为了进行qPCR分析，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从细胞中分离出1μg总RNA，并使用M-Mulv逆转录酶和随机六聚体逆转录到cDNA中。根据制造商的说明，使用Fast Sybr Green Master Mix（Applied Biosystems）、0.5 mM引物、ROX染料和最终体积为20μl的25ng cDNA进行qPCR反应。使用了以下引物MYC公司_对于CACCAGCAGCGACTCTGA，MYC公司_R gatccagactccttaccttttgc；GS_F TCATCTTGCATCGTGTGTGTG，GS_R cttcagaccattctcctccg；GLS_F GAAATTCGGAACAGACTGTGG、GLS_R AACTTCGATGTGCCTTCACβ-actin_F TCCATGAAGTGACGT、β-acti_R TACTCCTTGCTGATCCAC。在7500快速实时PCR系统（生命技术公司）上执行以下PCR步骤，在95°C下15分钟，然后在94°C下40个周期，10秒，55°C下30秒，72°C下30s。在72°C下进行10分钟的最后一步，通过熔融曲线对PCR产物进行可视化。使用肌动蛋白归一化的ΔΔCT方法计算指示基因的表达水平。

代谢物提取和HPLC-MS

将建立的细胞系接种在6孔板中，在完整的DMEM中从125000到250000个细胞/孔。24h后，用补充有10%透析FBS的SMEM替换培养基。按照细胞培养部分所述，在补充SMEM的6孔板中，以150000个细胞/孔的速度将干细胞样和分化的原发性胶质瘤干细胞接种在补充SMEM的6个孔板中。当达到最佳融合时（1-3天），按如下所述提取3个孔，并测定蛋白质（μg prott吨0). 将剩余孔中的培养基更换为2或7 ml/孔完整的SMEM，以分别分析培养基或细胞中的代谢物。U型-13C类5-Gln（0.65 mM，剑桥同位素），U-13C类6-葡萄糖（5.56mM，剑桥同位素），或15N个1-如图所示，补充氨（0.8mM Sigma）。细胞以及平行的无细胞孔在37°C下培养24小时。培养结束时，将一份培养基稀释在含有20%水、50%甲醇和30%乙腈的溶液中。从没有细胞的微孔中提取的培养基用于估计代谢物的交换率。为了分析细胞内代谢物，单层用冰镇PBS快速清洗3次，并用50%甲醇和30%乙腈的水溶液萃取。将培养基和细胞提取物在4°C下离心16000g 10min，用HPLC-MS分析上清液。提取的细胞单层用于蛋白质测定（μg蛋白t吨24)进行Lowry分析。平行处理新鲜制备的不含FBS的SMEM等分样品，并加入已知浓度的乳酸，用作代谢物定量的参考。根据方程式得出特定代谢物（x）的分泌/消耗率x个=2×(Δ代谢物)μ克保护t吨0+μ克保护t吨24式中，Δ代谢物=[（x）无细胞nmol培养基–（x）有细胞nmol介质]。使用带保护柱（Hichrom）的ZIC-HILIC（SeQuant）对介质样品进行LC分离。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%乙酸乙腈溶液。流动相流速保持在100μl/min，梯度为：0分钟80%B，12分钟50%B，26分钟50%B、28分钟20%B、36分钟20%B和37 37至45分钟80%B。流动相C：20 mM碳酸铵+水中0.1%氢氧化铵。流动相D：乙腈。流速保持在100μL/min，梯度如下：0分钟80%D，30分钟20%D，31分钟80%D和45分钟80%D。Exactive Orbitrap质谱仪（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）在极性切换模式下运行。

细胞转染与感染

为了稳定转染，将10 cm培养皿中80%融合的LN18细胞与10 ml无FBS转染培养基（含1μg/ml DNA）培养9小时（载体仅含P2A-iRFP IRES puro或GS-P2A-iRFP IRES-puro和2μl/ml Lipofectamine 2000（Invitrogen））。然后用10ml完整的DMEM替换转染混合物。第二天更换培养基，细胞在含有2μg/ml嘌呤霉素的选择培养基中培养3周。用Licor-Odyssey扫描仪观察荧光菌落，在选择培养基中挑选并扩增，以获得稳定的培养物。为了建立表达针对谷氨酰胺合成酶（GS）的shRNA的细胞系，根据制造商的说明书（TL312740a:GGTGAGAAGTCCAGGCCATGTATATCTG；TL312740b:GAATGGTGCAGGCTGCCATACCACATCA公司；TL312740c:TGGTACTGGAGGAGAGTGCTGCAAGA；TL312740d:GGCACACCTGTAAACGATAATGGACATG公司；TR30021ntc:GCACTACAGCTAACTCAGATAGTACT，Origene）。TL312740b TL3127400d和TR30021ntc在手稿中分别报告为shGS-1 shGS-2和shNTC。简单地说，根据标准磷酸钙程序，通过将每个shRNA质粒、慢病毒质粒psPAX2-1和包装质粒pVSV-G-1与HEK293T细胞共转染来产生慢病毒。收集、过滤含有病毒的上清液，并在−80°C下冷冻。对于受体细胞的感染，将上清液解冻，与溴化六甲菊酯（Sigma，H9268，8μg/ml）混合，并与细胞孵育24小时。在含有1-3μg/ml嘌呤霉素的培养基中选择感染细胞2周。

集落形成分析

在不含或含有0.65mM Gln和1mM MSO的情况下，将iRFP和iRFP-GS表达细胞以300个细胞/孔的速度接种在6孔板中的完整SMEM中。3周后，用三氯乙酸固定菌落，用SRB染色，用Licor-Odyssey扫描仪扫描平板。使用Image Studio 2.0获取图像。将表达shNTC和shGS序列的SF188和U251细胞分别以500和350个细胞/孔的速度接种在6个孔中。细胞在完整的SMEM中培养，并按照图3图例。接种菌落后12-17天进行固定、染色，并按上述方法获得代表性图像。为了量化菌落表面积，设计并运行了ImageJ宏。从宏量中获得的值被归一化为培养细胞的确切天数，并表示为相对对照的%。

试剂

U型-13C类5-L-谷氨酰胺和U-13C类6-D-葡萄糖（剑桥同位素实验室，公司CLM-1822，CLM-1396），15N个1氯化铵（Sigma-Aldrich 299251）、柳氮磺胺吡啶（Sigma Aldrich S0883）、MSO（Sigma-Aldrich M5379）、化合物968（Calbiochem 352010，在DMSO中溶解10mM）、BPTES，研究中使用的含氮碱来自Sigma Aldrich。

基于基因组尺度约束的代谢建模

代谢建模方法和结果的详细描述见补充说明.

统计方法

没有使用统计方法预先确定样本量。在动物研究中，实验不是随机的，研究人员在实验期间没有对分配盲目。执行的独立实验数量如图图例所示。对于一次或两次执行的实验，统计源数据中提供了独立重复的原始数据。误差条表示平均值的标准误差（S.E.M.）。使用Graph Pad Prism 5.0进行双尾Student’s t、Pearson相关检验和Log-rank（Mantel-Cox）检验。

补充材料

补充图形和表格图例

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补充说明

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补充表1

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补充表2

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补充表3

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补充表4

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补充表5

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补充图1

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补充图7

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补充图8

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致谢

这项研究得到了英国癌症研究所的支持。S.T.是AIRC/Marie Curie癌症研究国际奖学金的获得者。人类和动物代谢组学研究得到了挪威癌症协会、挪威研究委员会、Helse Vest、Haukeland大学医院和K.G-Jebsen基金会的支持。我们感谢Anna Golebiwska、Virginie Baus-Talko、Niels Van Den Broek、Gillian MacKay、Colin Nixon、Elaine MacKenzie提供的出色技术支持，以及Ayala King出色的编辑工作。

脚注

竞争性金融利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

补充信息可用

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