介绍
溶质载体1家族（SLC1）由五种谷氨酸转运体（兴奋性氨基酸转运体，EAAT）组成，它们有助于调节中枢神经系统（CNS）中主要兴奋性神经递质谷氨酸的突触浓度；和两种中性氨基酸转运体（丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体，ASCT1和2），它们在神经元和/或外周组织细胞中交换氨基酸，有助于细胞内中性氨基酸浓度的稳态[1]. ASCT2（SLC1A5）是一种钠依赖性转运蛋白，位于肺、肾、肠和睾丸中，在那里跨细胞膜运输小的中性氨基酸。ASCT2在各种类型的癌症中表达水平增加，包括多形性胶质母细胞瘤（GBM）[2]、神经母细胞瘤[三]，肺癌[4]，前列腺癌[5]和黑色素瘤[6]. ASCT2被认为通过向生长中的肿瘤细胞提供氨基酸，在肿瘤代谢中发挥关键作用，这些氨基酸被用作构建生物量的营养物质和激活生长和增殖途径（如mTOR途径）的信号分子[7,8]. 因此，ASCT2是一种潜在的癌症药物靶点，其中与ASCT2相互作用的化合物可以是一种剥夺癌细胞营养素的抑制剂，一种具有细胞内靶点（例如代谢酶）的细胞毒性ASCT2底物，或一种在多个靶点上作为抑制剂或底物的低亲和力配体（底物或抑制剂），包括ASCT2[9].
目前，还没有实验确定人类SLC1家族成员（包括ASCT2）的原子结构。然而，SLC1同源物天冬氨酸转运蛋白Glt的结构酸碱度，来自太古宙生物霍里克希热球菌在运输循环的不同构象中确定[10,11]. Glt公司酸碱度与人类SLC1家族有24-35%的序列同源性和相同数量的跨膜螺旋（即8个），以及一个保守的结合位点；因此Glt酸碱度结构是生成SLC1成员同源模型的最合适模板[1,10,12]. 事实上，以前各种人类SLC1家族成员的同源模型[13–15]揭示了SLC1家族中重要的结构-功能关系。例如，Scopelliti等最近，通过突变三个结合位点氨基酸（例如A382T），将ASCT1的底物特异性从转运中性氨基酸转变为转运谷氨酸，揭示了SLC1家族以前未知的特异性决定因素[15].
此外，Glt的结构测定酸碱度不同构象的结构与X射线晶体学[10,11]以及使用其他方法（例如，双电子电子共振光谱法）对这种蛋白质进行实验表征[16])有助于我们了解SLC1家族的动态。例如，显示Glt酸碱度存在于原始分子的构象集合中，以几乎相等的概率对向外和向内的状态进行采样，并且特定的突变体采用独特的构象[16]. 这些研究以及计算分析[17,18]，确认Glt酸碱度以及可能的人类SLC1家族成员，包括ASCT2，跨细胞膜运输配体通过“交替存取”转运机制，在这种机制中，转运蛋白在细胞外向外和细胞内向内的状态之间发生构象变化，底物结合位点可以暴露在膜的两侧[19]. 特别是，有人建议Glt酸碱度通过“升降机构”运输底物，其中一个结构域保持静止，而运输结构域作为刚体从细胞外侧向细胞内侧进行大量运动[20]. 两个发夹环（细胞内侧的HP1和细胞外侧的HP2）作为门，允许底物的释放和结合。描述SLC1家族中底物特异性的结构基础，并进一步描述这一重要的药理学转运体家族，有望扩大我们对人类系统中转运的理解，并有助于代谢疾病和癌症药物的设计。
这里，我们使用计算和实验相结合的方法来描述ASCT2[21–24]. 我们基于Glt的结构构建ASCT2的结构模型酸碱度在两种不同的构象中，并细化模型以区分已知配体和可能的非结合物。我们针对这些模型对各种小分子库进行虚拟配体筛选，通过电生理方法对ASCT2的抑制和激活以及它们对黑色素瘤细胞系增殖和凋亡的影响进行实验性测试。最后，我们描述了这项研究的结果如何提高我们对区分ASCT2抑制剂和激活剂的化学基础的理解，并讨论了我们的结果的药理意义，包括将已识别的配体作为化学工具来表征ASCT2在癌症中的作用的潜在用途。
结果和讨论
ASCT2同源模型
我们使用MODELLER对ASCT2结构建模[25]基于Glt酸碱度两种不同构象的结构（序列一致性约为24%），包括向外封闭（“封闭”）状态和抑制结合向外开放（“向外开放”）状态[10,11]（方法）。ASCT2模型包含八个跨膜螺旋，构成蛋白质的整个跨膜区域，以及一个配体和两个钠离子，它们的初始坐标来自于它们在模板结构上的位置(). 接下来，通过对初始MODELLER模型中的不同构象进行迭代采样，对每个状态下的ASCT2模型进行优化，以实现蛋白质与互补性，并通过SCWRL4在固定主干上的侧链建模对这些模型进行细化[26]，使用GROMACS进行分子动力学（MD）模拟最小化[27]，并通过富集计算评估模型在多大程度上可以区分已知配体和诱饵（方法）。
不同构象的ASCT2模型揭示了HP2环的门控机制。侧面(A类)和细胞质(B类)ASCT2模型在闭塞构造中的视图用灰色条带表示。向外开放构象的HP2环（粉色丝带）叠加到闭塞模型上。底物半胱氨酸的原子显示为球体，其中氧原子显示为红色，硫原子显示为黄色，碳原子显示为青色。钠离子显示为紫色小球。
最终模型得到的logAUC值为33.1（闭塞构象）和27（向外开放构象）()这表明这两种构象都可以用于生产性虚拟筛选，并且闭塞ASCT2模型比向外开放模型更准确地捕捉配体的相互作用[23,28]. 这些最终模型包括两个螺旋发夹环（称为HP1和HP2），它们从相反的侧面插入膜中，类似于Glt中的等效环酸碱度结构。在闭塞状态下，HP2闭塞水环境中的底物，而在向外开放状态下，HP2采用开放构象，并可能充当细胞外门(). 因此，尽管总体结构相似性很高（RMSD为0.5Å），但向外开放状态在配体结合位点具有显著更大的表面积。
ASCT2模型的富集图表明模型适用于生产性虚拟筛选。ASCT2富集图（A）闭塞构造，（B）向外开放的构造和（C）Asp460面向结合位点的外向开放构象。富集图用红色表示，而随机选择配体所期望的富集图用蓝色虚线表示。底部面板以半对数刻度显示富集。
封闭状态预测非平凡的基质类化合物
我们根据两种构象的模型分析了已知配体的预测对接姿势，并将其与Glt进行了比较酸碱度结构与底物天冬氨酸（封闭状态）和竞争性抑制剂TBOA（向外开放状态）形成复合物。闭塞的ASCT2构象模型揭示了一个小的结合位点，它限制了配体的大小及其与结合位点残基的相互作用模式（图和). 特别是，结合位点残基和已知ASCT2配体之间的大多数相互作用与Glt中的相似酸碱度-天冬氨酸复合物结构。例如，ASCT2配体的氨基和羧基，如丝氨酸()或苏氨酸()与ASCT2的Ser353、Pro432、Ile431、Asp464、Thr468和Asn471进行极性相互作用，类似于Glt的相应化学基团的相互作用酸碱度天冬氨酸配体与谷氨酸酸碱度结合位点残基（Arg278、Pro356、Val355、Asp394、Thr398、Asn401）(). 值得注意的是，Glt中Arg397的氨基酸替代酸碱度ASCT2中的Cys467对这些转运蛋白之间的配体结合特异性有显著贡献。特别是Glt酸碱度结合位点残基Arg397和Asp390形成盐桥，其中Arg396的碱性侧链原子也与天冬氨酸配体的β-羧基形成氢键。然而，在ASCT2中，Cys467替代Glt的Arg397酸碱度，打破盐桥，改变结合位点的大小、形状和总体电荷分布。因此，该地区被命名为“口袋B”()，被Glt中Arg397的侧链占据酸碱度ASCT2中的配体可以与Asp460相互作用（对应于Glt中的Asp390酸碱度)以及其他疏水残基，包括Phe407和Val477。有趣的是，在ASCT1中，与ASCT2中Cys467相对应的Thr459在确定底物特异性方面发挥了关键作用，进一步支持了该位置在介导与底物相互作用中的作用[15].
ASCT2和Glt的结合位点酸碱度它们的形状、大小和极性不同。闭塞构象中ASCT2的最终模型（灰色）叠加在Glt的X射线结构上酸碱度（粉红色）。关键残留物显示为线条，其中氧原子和氮原子分别用红色和蓝色表示；钠离子可视为紫色球体。来自Glt的L-天冬氨酸坐标酸碱度结构用绿色棒状物描述，已知配体对接ASCT2模型得到的L-丝氨酸坐标用青色棒状物可视化。(A类)L-天冬氨酸和Glt之间的氢键酸碱度用黄色虚线表示，在L-丝氨酸和ASCT2模型之间用黑色虚线表示。(B类)模板和模型的装订袋表面分别显示为粉红色和灰色，以便与Glt相比，可视化模型中可访问的附加袋（袋B）酸碱度结构。
ASCT2闭塞构象模型的配体结合模式揭示了底物结合的关键残基。所选已知配体的预测结合模式(A-B公司)以及本研究中确定的配体(首席财务官). ASCT2结合位点的骨架原子在灰色卡通中可视化；关键残基的侧链原子用灰线表示，配体显示为青枝，氧、氮和氢原子分别显示为红色、蓝色和白色；小分子和ASCT2之间的氢键（包括残基Phe407、Gly448、Pro446、Ile445、Ser353、Thr468、Asn471）显示为灰色虚线。小分子配体是苏氨酸(A类)，2-氨基-3-（丙酰氧基）丙酸(B类)，氨基氧烷-3-羧酸盐(C类),顺式-3-羟脯氨酸(D类)，杀螨素(E类)和L-DOPS(F类).
然后，我们从ZINC对接了各种库[29]和KEGG[30,31]数据库与闭塞结构模型。我们假设，基于与底物天冬氨酸结合的模板结构的闭塞构象模型的虚拟筛选将捕获底物类ASCT2配体，这些配体可以是活化剂或竞争抑制剂。此外，闭塞构象的结合位点小而窄；因此，与这种构象相互作用的预测化合物更有可能是氨基酸类似物。事实上，ASCT2配体的各种先前特征化氨基酸底物在我们的筛选中排名很高，增加了我们对该方法的信心。例如，半胱氨酸和苏氨酸在KEGG药物对接屏幕上的6436个分子中分别排名第14位和第24位。根据已知配体的预测姿势，对来自各种配体屏幕的500个最大对接姿势进行了直观分析() [32,33].
我们的策略是根据分子与功能所需的结合位点残基保持重要保守相互作用的能力来选择分子，同时探索每个构象的额外相互作用和囊，类似于以前成功研究中采用的方法[9,21,23]. 特别是，我们选择了与结合位点残基形成极性相互作用的分子，这些残基也被预测与已知配体（例如，Ser351、Ser353、Ile431、Asp464和Asn471）的羧基和氨基相互作用。因此，由于大多数化合物预计由氨基酸类支架组成，因此增加了识别潜在新型支架的可能性，并减少了视觉分析带来的偏差，（i）我们选择了探索新发现的囊袋B的配体，该囊袋由几个疏水性物质（Phe407和Val477）组成和极性残基（Asp460），预计这将增加可探索的潜在配体化学空间；（ii）我们还专注于“非平凡”氨基酸类似物，如果不通过虚拟筛选进行高度排名，这些类似物不太可能进行测试。例如，脯氨酸不是ASCT2的配体，我们测试了脯氨酸类似物顺-3-羟脯氨酸，因为它与ASCT2结合位点（例如Asn471，). 最后，根据闭塞模型选择八种化合物进行实验测试(和和S1图).
表1
实验证实的配体。
| 姓名一
| 我最大值
b
| K（K）米
c（c）（百万分之一） | 温度控制（Tc）d日
|
|---|
| 丙氨酸（对照） | 1 | 0.41 ± 0.02 | |
|
闭塞构造
|
|
顺式-3-羟脯氨酸 | 1.39 ± 0.1 | 0.019 ± 0.01 | 0.51 |
| 氨基氧烷羧酸盐（AOC） | 1.17 ± 0.13 | 0.22 ± 0.02 | 0.55 |
| 青霉素 | 0.68 ± 0.08 | 1.37 ± 0.68 | 0.64 |
| 氯丙氨酸 | 1.28 ± 0.22 | 0.90 ± 0.12 | 0.62 |
| 阿维星 | 0.45 ± 0.03 | 5.1 ± 1.5 |
0.46
|
| 左旋多巴酚钠 | -0.03 ± 0.01 | 1.95 ± 0.9 | 0.55 |
|
外开构象
|
|
γ-固定基地计划 | -0.64 ± 0.13 | 0.087 ± 0.022 |
0.47
|
实验测试证实ASCT2激活剂
我们使用转运蛋白介导的阴离子电流作为转运/抑制活性的测量[34,35]（方法），因为ASCT2作为电中性专性交换器的功能，不介导稳态传输电流。我们之前已经证明，阴离子电流是一种运输活性的测量方法[36]由于转运和阴离子通量的动力学耦合，这一事实对于同源谷氨酸转运蛋白也得到了很好的证实[37]具有更严格的药理学[38]. 当转运体在运输循环中达到某些状态时，阴离子电流被激活，例如全钠+/底物占用状态（底物诱导的阴离子电导），或Na+-束缚态（漏电导）[39]. 因此，迁移的底物会产生负离子电流，而非迁移的抑制剂会阻止泄漏的负离子电流。运输和阴离子电流之间的这种动力学联系可以用一种典型的竞争性抑制剂苄基丝氨酸来证明，与运输底物丙氨酸相比，苄基丝琳不能在ASCT2表达细胞中激发交换介导的瞬态运输电流(S2图) [39]. 这些瞬态电流是由电压突变时氨基酸易位平衡的重新平衡直接引起的，因此是对运输的直接测量。当与虚拟筛选相结合时，通过膜片钳进行功能表征是一种强大的方法，该方法优先考虑来自大型文库的分子，但由于其劳动密集的性质，排除了对大量化合物的筛选。
应用8种选定化合物中的5种，观察到向内阴离子电流，类似于天然转运底物丙氨酸()，表明这些化合物可能是转运底物（活化剂）。这些先前未知的配体之一，抗癌药阿昔星，是一种化学上新颖的ASCT2配体（Tanimoto系数（Tc）为0.46，与最相似的已知ASCT2配体），尽管其表观亲和力相当低(). 其中两种化合物（AIB和噻唑烷-2-羧酸盐）在浓度高达5 mM时未引起任何显著反应，表明它们不会与ASCT2相互作用。其他两种化合物，N-（2-苯乙基）色氨酸和3-{[（1H-咪唑-2-基甲基）（甲基）氨基]甲基}-5-甲基-1H-吲哚-2-羧酸在水中溶解性差，在浓度高于1mM时需要5%的二甲基亚砜进行溶解。在测试的最大浓度为500μM时，这些化合物也不起作用。它们不包括在由于这些溶解度问题。其他一些化合物，包括氯丙氨酸、顺-3-羟脯氨酸和青霉胺，可激活内向阴离子电流，其中三种具有更高的我
最大值而不是丙氨酸(). 这些结果表明，这些化合物是ASCT2阴离子电导的更有效的激活剂，并且可能更快速地转运。例如，顺式-3-羟脯氨酸诱导的相对电流为1.39，是所有活性化合物中活性最高的(和). 令人惊讶的是，顺式-3-羟脯氨酸是脯氨酸衍生物。脯氨酸是已知的ASCT2非配体，在这里作为阴性对照进行测试(). 脯氨酸的羟基部分与残基Asn471建立氢键，这可能有助于提高化合物的亲和力(). 这些结果表明，在捕获配体时，相对无偏见的基于结构的虚拟筛选具有优势，否则不太可能考虑进行测试。新鉴定的ASCT2激活剂的整体结构包括一个小的中性氨基酸支架，其中一个氧原子连接到Cγ原子与结合位点残基进行关键的极性相互作用。这为设计用于癌症治疗的更好的ASCT2细胞毒性底物提供了初始药效团模型。
电生理方法证实了预测的激活剂和抑制剂。(A类-C类)代表性的全细胞电流示踪，对应于在灰色条指示的时间施加的1 mM丙氨酸、L-DOPS和氨基氧烷-3-羧酸盐（AOC）。(D类)AOC和青霉胺的剂量响应曲线（膜电位=0 mV，内部缓冲液含有130 mM NaSCN和10 mM丙氨酸，外部缓冲液含有140 mM NaCl）。(E类)相对于1 mM丙氨酸诱导的最大全细胞电流（膜电位=0 mV，内部缓冲液含有130 mM NaSCN和10 mM丙酸，外部缓冲液含有140 mM NaCl）。
最后，发现L-DOPS是ASCT2泄漏阴离子电导的弱抑制剂()，通过抑制电池泄漏阴离子流出，诱导明显的外向电流。L-DOPS电流反应虽然很小，但总是外向的，表明抑制作用虽然很小但很显著。相反，4-羟脯氨酸-苄基醚引发的电流太小，在大多数细胞中无法测量，或者随机向内或向外，这表明反应与零没有显著差异。除了只诱导很小的外向电流外，L-DOPS还表现出低的表观亲和力，与K我约2 mM(). 由于这种低亲和力，L-DOPS在高达5 mM的浓度下无法显著抑制丙氨酸诱导的反应。阿维辛和L-DOPS对ASCT2的调节，两者都是L型氨基酸转运蛋白1（LAT-1）的配体[22]，表明ASCT2和LAT-1有共同的配体，靶向营养物质转运蛋白的药物可能被设计为同时与这两种蛋白质相互作用。
面向外部的模型揭示了新的口袋
向外开放构象的ASCT2模型基于Glt酸碱度与氨基酸类似物TBOA结合的结构。TBOA是Glt的弱抑制剂酸碱度[11]但与哺乳动物谷氨酸转运体（如EAAT）的低微摩尔亲和力相互作用。因此，该模型被认为是近似于无法运输的构造。因此，我们的理由是，基于抑制构象的模型将有助于识别假定的抑制剂。配体与ASCT2结合位点之间的一些相互作用类似于闭塞模型中的ASCT2-ligand相互作用。特别是，氨基酸配体的氨基和羧基与结合位点残基Ser351（主链）、Ser353、Asp464、Thr468和Asn471形成极性相互作用(). 这些相互作用也与模板结构有关，其中氨基酸类似物TBOA与Glt中的相应残基相互作用酸碱度（即Arg276、Arg278、Asp394、Thr398和Asn401）。值得注意的是，外开构象模型结合位点的两个关键特征可能有助于其偏好具有较大且更疏水侧链的氨基酸类配体。首先，HP2处于开放构象，与闭塞状态相比，配体结合位点的表面可及面积增加(). TBOA的疏水侧链占据ASCT2模型中的额外结合囊（“囊A”），类似于Glt酸碱度结构。其次，与闭塞状态模型类似，ASCT2中的Cys467替代Glt中的Arg397酸碱度用Asp460（Glt中的Asp390）打破盐桥酸碱度)从而显示出可用于装订的附加口袋（在闭塞状态下称为“口袋B”）(). 因此，我们检验了这一假设，即在外向开放模型中，与闭塞状态模型类似，Asp460面对结合囊并直接与配体相互作用(). 然而，Asp460侧链朝向结合囊的ASCT2模型的logAUC分数分别为27和11.1，表明Asp460-侧链朝向囊的模型不能更好地区分已知ASCT2配体和诱饵。这表明，对于这种构象，Asp460不太可能参与配体配位，更可能面向表面(). 此外，这一结果强调了迭代建模和对接在细化结构方面的实用性，从而捕获蛋白质表面上具有重要功能的残基和区域。
向外打开的构造揭示了一个额外的新颖口袋。(A类)对接衍生的已知抑制剂苄基半胱氨酸的预测结合模式。ASCT2的主链原子被视为灰色卡通，主键残基与灰色棍子中的配体建立氢键，氧、氮和氢原子分别为红色、蓝色和白色。Asp460的两种潜在的旋转体，包括朝向结合部位的方向（粉红色）和表面（灰色），显示为棒状物。钠离子以紫色球体表示。(B类)ASCT2与苄基半胱氨酸结合的外向开放模型的结合位点表面揭示了HP2开放产生的新口袋（口袋A）。
接下来，我们将ZINC数据库中的各种小分子库与向外开放的模型对接。该构象的结合位点大于闭塞模型的结合位点；因此，向外开放的结合位点可能容纳比封闭模型捕获的分子大的抑制剂。我们通过实验测试了以下分子：i）与保守的结合位点残基相互作用，这些残基与已知配体的氨基和羧基形成极性相互作用（例如，Ser351和Asp464与氨基酸主链的氨基部分相互作用，而Ser353和Asn471与底物的羧基部分相互作用）；和分子ii）结合囊袋A或B以增加化学空间和潜在命中的结合亲和力。总共选择了三种符合这些标准的化合物。同样，尽管我们选择了氨基酸类化合物，但这种转运体具有高度的特异性，已知配体的一个或两个重原子内的分子不一定与ASCT2相互作用[14]. 此外，根据Tanimoto系数（Tc）值，这些化合物在化学上与已知的ASCT2配体不同(和S1图). 此外，这些假定的配体预计会结合新发现的囊袋，这表明ASCT2与小分子配体的新型相互作用模式。
预测配体的实验表征表明了新的抑制模式
令人惊讶的是，在三种选定的化合物中，脯氨酸衍生物γ-固定基地计划()被发现会引发较大的外向电流（相对于饱和[丙氨酸]的反应为-0.64±0.13μM，和)表明它是ASCT2功能的抑制剂。与该结果一致，γ-FBP能够缓解浓度低至100μM的丙氨酸活化(). 此外，表观K我对于γ-无丙氨酸时的FBP（87±22μM，和)丙氨酸存在时增加(，K我250±75μM），这是一种预期的竞争抑制效应。如果抑制纯粹是非竞争性的，K我与实验数据相比，预计与丙氨酸浓度无关。
基于外向开放模型的强效ASCT2抑制剂的鉴定。(A类)新鉴定的抑制剂的预测结合模式γ-固定基地计划。ASCT2绑定站点可视化为灰色卡通；关键残基的侧链原子用灰色线表示，配体显示为黄色条，氧、氮和氢原子分别用红色、蓝色和白色表示；抑制剂和ASCT2之间的氢键（包括残基Ser351、Asp464、Thr468和Asn471）显示为黑色虚线。(B类)应用丙氨酸后的代表性电流记录，γ-FBP和丙氨酸+γ-图例所示条件下的FBP。灰色条表示复合应用的持续时间。(C类)的剂量反应关系γ-FBP感应电流，括号中显示了每个数据点的平均实验次数。(D类)不同浓度丙氨酸诱导电流（100μM）γ-FBP（膜电位=0 mV，内部缓冲液含有130 mM NaSCN和10 mM丙氨酸，外部缓冲液含有140 mM NaCl）。括号中显示了每个数据点的平均实验次数。虚线表示基于K（K）
我87μM，与（C）进行比较。
γ-FBP是ASCT2的一种化学新型配体，与已知最密切相关的ASCT2配体的Tc为0.47(). 脯氨酸衍生物是本研究中发现的最有效的抑制剂，这一结果特别有趣，因为脯氨酸不是ASCT2配体()因为一种不同的脯氨酸衍生物可以激活ASCT2(和). 此意外活动γ-FBP可以用一种新型疏水性支架来解释，该支架包括一个能够与口袋B的Phe407形成π-π相互作用的芳香环和一个氟原子(). 氟原子已被证明可以通过各种方式增强药物的亲和力来提高药物的治疗活性，其中之一是氟与肽键的相互作用[40]. 在这种特殊情况下，氟原子指向Val364-Asp365肽键(). 总之，向外开放的模型有一个更大的结合位点，有助于靶向更多的口袋以进行药物发现。预计未来的研究将优化这种新支架的结合，以设计更有效的ASCT2抑制剂。
配体对ASCT2介导的C8161黑色素瘤细胞谷氨酰胺摄取和细胞活力的影响
我们之前已经证明ASCT2介导C8161人黑色素瘤细胞中谷氨酰胺的摄取，并且阻断ASCT2活性抑制细胞生长和生存能力（方法）[6]. 因此，我们使用该模型证实了三种ASCT2配体的活性：氯丙氨酸和氨氧基丁烷-3-羧酸盐（AOC），这两种最有效的活化剂，以及γ-FBP，抑制ASCT2最有效的抑制剂配体(). 在这些化合物存在的情况下[三H] -在C8161细胞中，L-谷氨酰胺的摄取以剂量依赖性的方式减少，这与它们激发电流作为活化剂和潜在底物的情况一致(). IC50氯丙氨酸的浓度为9.2 mM，并且IC50AOC和γ-FBP在10-15 mM之间，与ASCT2配体苄基丝氨酸（IC）类似50在C8161细胞中为5.3 mM）[6].
氯丙氨酸、AOC和γ-FBP抑制ASCT2介导的C8161人黑色素瘤细胞的谷氨酰胺摄取和细胞活力。(A类-C类) [三H] -使用C8161细胞中的L-谷氨酰胺摄取来确定IC50氯丙氨酸、AOC和γ-FBP（n=3）。(D类-F类)用氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）和γ-FBP（5 mM）。进行双向方差分析测试以确定显著性。(G公司-我)用流式细胞术检测与氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）和γ-FBP（5 mM）。采用Mann-Whitney U检验确定显著性。（J） 在与氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mM）和γ-FBP（5 mM）。
谷氨酰胺是癌细胞生长所需的一种条件性必需氨基酸，用作TCA循环的燃料来源，也是生产大分子的碳和氮来源。因此，我们检测了存在氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）和γ-使用MTT法在C8161细胞中检测FBP（5 mM）（方法）。氯丙氨酸、AOC和γ-FBP显著抑制C8161细胞的活性(). 为了确定这些化合物是否也诱导了细胞凋亡，我们使用流式细胞术对暴露于氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）和γ-FBP（5 mM）48小时(). 虽然氯丙氨酸显著增加了细胞凋亡，但AOC和γ-FBP导致早期（Annexin V+PI-）或晚期（Annessin V+PI+）细胞凋亡显著增加。抑制细胞内氨基酸水平已被证明通过ATF4转录调节氨基酸转运体（包括ASCT2）诱导适应性反应[三,8].
为了确保这些抑制作用不是由于ASCT2蛋白水平的变化引起的，我们在与氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）或γ-FBP（5米）(). 虽然氯丙氨酸降低了ASCT2蛋白的水平，但AOC或γ-FBP，表明抑制作用直接影响ASCT2转运而非蛋白质表达。氯丙氨酸作用后ASCT2的低水平可能是由于凋亡引起的，在氯丙氨酸处理的细胞中，凋亡显著增加，但AOC或γ-FBP处理的细胞。尽管这些先前未知的ASCT2配体对黑色素瘤细胞株的治疗作用较弱，因此不太可能用于药物开发，但这些化合物可以作为有用的化学工具，进一步表征ASCT2在癌症代谢中的作用。例如，γ-FBP是一种剥夺癌细胞营养的抑制剂，激活剂氯丙氨酸可能被进一步开发为细胞毒性配体。
结论
ASCT2是一种位于外周组织中的钠依赖性中性氨基酸交换物，在多种癌症中高度表达，为生长和增殖提供关键营养素和信号分子。ASCT2可以作为阻隔营养吸收抑制剂的药物靶点，也可以导入细胞毒底物作用于不同的靶点。在这里，我们描述了ASCT2在两种不同构象中的结构模型，并确定了该蛋白的特异性决定因素。这项研究得出了三个主要结论。
首先，我们鉴定了七种先前未知的ASCT2配体，包括五种激活剂和两种抑制剂。这一结果为区分抑制剂和激活剂提供了化学基础，也为优化更有效的配体来对抗ASCT2（癌症和神经疾病的新兴药物靶点）提供了新的支架。此外，其中三种化合物的化学性质与已知配体（阿西维辛）不同，或与已知非配体有化学联系(). 例如，激活器顺式-3-羟脯氨酸及其抑制剂γ-FBP是脯氨酸衍生物，我们证实脯氨酸不是ASCT2配体(). 对于活化剂，羟基Cβ脯氨酸能够与残基Asn471进行额外的相互作用，但该分子仍足够小，足以激活转运蛋白并可能被转运(). 相反，对于抑制剂，氟苄基与C结合γ脯氨酸(). 这个庞大的基团可能通过π-π和氟-肽键相互作用增强分子的亲和力，但分子太大，无法运输。值得注意的是，基于结构的虚拟筛选使我们能够识别看似非配体。
第二，我们的三个点击（choloroalanine、AOC和γ-FBP）以与ASCT2抑制剂苄基丝氨酸类似的浓度抑制黑色素瘤细胞系C8161的谷氨酰胺摄取和增殖(). 有趣的是，细胞毒性化合物阿维星（acivicin）也与结构无关的癌相关氨基酸转运蛋白LAT-1相互作用，以前的研究表明它可以抑制GBM细胞系的增殖[22]. 阿维菌素不是这些转运蛋白的强抑制剂，但它可能通过多药作用于多个靶点而获得其积极和消极的药理作用。事实上，最近研究表明，阿维辛与其他代谢酶相互作用，这表明多药疗法有助于其治疗效果[41,42]. 因此，通过优化它们与多个转运蛋白和其他靶点的相互作用，可以开发出未来的药物。
第三，我们使用迭代建模和对接方法，基于原核天冬氨酸转运蛋白的X射线结构对ASCT2结构进行建模，该转运蛋白与ASCT2具有约24%的序列同一性和不同的底物特异性。对一个具有技术挑战性的靶点的分析为理解氨基酸转运蛋白SLC1家族中的氨基酸选择性提供了一个框架，氨基酸转运蛋白在神经信号、，以及一种通常适用于表征其他人类转运体结构及其与配体（包括药物）相互作用的方法。
最后，许多溶质载体（SLC）通过介导氨基酸、糖（如GLUTs）和其他代谢物（如柠檬酸循环中间产物）的运输，在各种人类疾病中发挥关键作用[12]. 这种疾病是由单点突变或异常表达水平引起的代谢失调引起的。因此，营养素SLC转运体是靶向和递送的新兴药物靶点。例如，食品和药物管理局最近批准了2型糖尿病药物卡格列净，其作用是通过抑制钠的转运+-葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2/SLC5A2）降低血液中的糖浓度[43]. 膜转运蛋白结构数量的显著增加，加上计算机辅助药物设计方法的进步，提高了基于结构的合理药物设计对人类SLC的适用性[9]. 重要的是，即使确定了人体结构，仍需要通过计算和实验表征转运体的额外构象，以便如本研究所示，利用虚拟筛选覆盖化学空间的额外部分。综上所述，在未来几年内，以SLC转运蛋白为靶点的药物的数量预计将显著增加，这些转运蛋白是通过计算和实验技术相结合进行合理设计的。
材料和方法
同源建模
我们根据Glt的X射线结构对ASCT2进行了建模酸碱度从horikoshii Pyrococcus horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horikoshii horik在闭塞构象和向外开放构象中（PDB标识符分别为2NWX和2NWW）。ASCT2和Glt之间的初始对齐酸碱度使用Promals3D服务器使用各种参数进行计算[44]然后根据与先前发布的SLC1成员与Glt的全面比对进行改进酸碱度[10]以及通过基于各种路线构建模型并进行可视化分析[45]. 我们的模型中没有包括三个长而分散的片段，包括N末端（53个残基）、跨膜螺旋（TM）3和TM4a之间的环（29个残基[10]. 这些区域远离结合位点，不太可能与配体相互作用。分别用385和387个ASCT2残基构建封闭模型和向外开放模型，覆盖70%和71%的蛋白质序列。
对于每种构造，我们使用标准的“automodel”类MODELLER-9v11[25]生成最初的100个模型，并使用基于已知蛋白质结构的归一化原子距离相关统计势Z-DOPE进行评估[46]. 顶模的Z-DOPE得分在闭塞模型中为-0.19分，在向外开放模型中为0.08分，这表明模型可能足够准确，以指导进一步的结构/功能研究[9,46,47]. 此外，根据非蛋白原子在模板结构中的坐标，用非蛋白原子构建模型。这些非蛋白元素包括钠离子，以及分别用于封闭和向外开放模型的配体分子天冬氨酸和TBOA。最后，我们通过侧链建模和MD模拟的能量最小化对额外构象进行采样以进行富集计算。
分子动力学（MD）模拟
使用GROMACS4进行MD模拟[27]. 每个模型都使用以下协议进行了改进。使用Amber99SB-ILDN力场对模型进行10000步共轭梯度最小化[48,49]. 为了解释膜的疏水环境，使用了基于广义玻恩公式的溶剂隐式模型。使用等于2的介电常数来模拟膜内部。只要模型中存在离子，就“在真空中”模拟系统，并使用等于2的介电常数筛选库仑相互作用。使用LINCS算法将所有键长限制为其平衡值[50]时间步长为2fs。Lennard-Jones和静电相互作用的截止值为1.0 nm。
配体对接和富集
如前所述，使用DOCK进行了初始对接和浓缩计算[51–53]. 通过计算富集图的AUC（曲线下面积）和LogAUC来评估同源性模型，该富集图表示虚拟筛选在诱饵组中区分已知配体的能力。该图显示了所有数据库化合物中排名靠前的子集中正确预测的已知配体（y轴）的百分比(x-对数刻度上的轴）() [28,29,54]. 从文献中选择了28个已知的ASCT2配体[14,55,56]DUD-E服务器生成了1400个诱饵[57]. 然后用OpenEye FRED对这组1428个分子与三种模型进行筛选[58]：i）闭塞构象模型ii）向外开放构象，iii）Asp460朝向结合位点的向外开放构像。
与FRED对接
OpenEye FRED使用基于经验和形状的评分功能[58]. 利用FRED的MAKE_RECPTOR效用制备受体。包围结合位点的盒子是基于晶体配体的坐标产生的（天冬氨酸和TBOA分别用于封闭的向外开放构象）。对接姿势通过Chemgauss4评分函数进行排序，该评分函数由描述配体和结合位点之间互补性（通过形状和化学性质）的平滑高斯势定义。
虚拟筛选配体库
我们使用DOCK和FRED从ZINC中虚拟筛选了以下化合物库：（i）京都基因和基因组百科全书（KEGG）药物数据库的过滤版本，其中包括日本、美国和欧洲的6436种批准药物以及非处方药（OTC）[52]. （ii）KEGG配体化合物数据库的过滤版本，包括12730种代谢物、生物聚合物和其他生物活性分子。例如，含有50个或更多非氢原子或分子量大于600 Da的分子被过滤掉，因为对接对于这样大的分子来说通常不起作用。（iii）ZINC Fragment Now集合包括分子量（mwt）为250道尔顿或更低的575000个化合物，五个或更少的可旋转键（rot），xlogP值为3.5或更低，其中xlogP是通过原子加法计算的辛醇/水分配系数（logP）。iv）锌铅现在含有2268809种化合物，分子量在250到350道尔顿之间，7个或更少的可旋转键，xlopP值为3.5或更低[29,59].
电生理HEK293培养和转染
大鼠ASCT2的cDNA编码由S.Bröer善意提供[60]. cDNA的编码区被亚克隆到EcoR中我pBK-CMV载体的位置（Stratagene）。使用cDNA构建物用轻质试剂（Polyplus，Ilkrich，France）瞬时转染人类胚胎肾细胞（HEK293，ATCC No.CGL 1573）。按照供应商说明书中的详细说明进行转染。转染后24–48小时进行电生理记录。
电生理学方法
使用Adams&List EPC7放大器（德国兰姆勒支HEKA）在电压灯条件下记录ASCT2相关的全细胞电流。开口电极电阻为2–3 MΩ，串联电阻(R（右）
S公司)为5-8 MΩ。R（右）
S公司在记录中未进行补偿，因为补偿对观测电流的大小没有影响。细胞外液（单位：mM）：140 NaMES，2 MgGluconate2，2葡萄糖酸钙2和10个HEPES（MES=甲烷磺酸，pH 7.4/NaOH）。所含移液管溶液（mM）：130 NaSCN，2 MgCl2、10 EGTA、10 HEPES和10 L-丙氨酸/半胱氨酸（pH 7.3/NaOH）。利用这种细胞内溶液，转运蛋白在钠离子+/丙氨酸交换模式。在这里，在没有净转运的情况下，外部丙氨酸与内部丙氨酸交换。交换模式与未偶联阴离子电流的激活有关，该电流被用作运输活性的间接测量[14,36]. 电流在3 kHz下进行低通滤波（EPC7内置滤波器），并使用数字化板（Digidata 1200，Axon Instruments，Foster City，CA，USA）以10–50 kHz的采样率进行数字化（由软件Axon PClamp7控制）。所有实验均在室温下进行。快速溶液交换基本上如前所述[61]. 简单地说，底物和抑制剂应用于ASCT2表达的HEK293细胞，石英管（350μm管直径）位于距细胞约0.5 mm的位置。从管开口处流出的溶液的线性流速约为5–10 cm/s。
用于摄取、增殖和凋亡研究的黑色素瘤细胞培养
如前所述进行人类黑色素瘤细胞系C8161培养[6]. 所用培养基为DMEM/F12培养基（生命科技），含有5%（v/v）胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液（Sigma-Aldrich）。细胞在含有5%CO的完全增湿大气中保持在37°C2.抑制剂（氯丙氨酸、AOC和γ-FBP）重悬于H中2O、 用适当浓度的溶媒单独处理对照细胞。
谷氨酰胺摄取测定
C8161细胞（1×105/well）与[三H] -L-谷氨酰胺（400 nM；PerkinElmer）在MEM介质（Life Technologies）中，37°C，在存在或不存在每种抑制剂的情况下放置15分钟。收集细胞并使用96 well平板采集器（Wallac PerkinElmer）将其转移到滤纸上，干燥后暴露于闪烁液中，并使用液体闪烁计数器（PerkinEl默）测量计数。
细胞活力测定
MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四溴化钠；如前所述进行Millipore）细胞活力测定[62]. 简单地说，C8161细胞（1×104/well）接种在96孔平底平板中，在培养基中培养过夜，然后添加或不添加抑制剂。在添加100μL异丙醇/盐酸溶液之前，向每个孔中添加MTT溶液（10μL）4 h。将溶液彻底混合，然后立即在PolarStar平板读取器（BMG）中以570 nm/630 nm的波长读取平板。结果绘制为对照孔中观察到的吸光度百分比。
Annexin V检测
电池（5×105（每孔）接种在24孔板中，让其粘附过夜，然后在5 mM氯丙氨酸、AOC或γ-FBP 48小时。使用Tryple分离细胞，并用Annexin V-APC（BD）在300μL结合缓冲液（HEPES-buffered PBS补充2.5 mM氯化钙）中重新悬浮细胞，并在室温下黑暗中培养15分钟。添加碘化丙锭溶液（5μg/mL），并使用BD LSRFortessa和FlowJo软件分析细胞。
蛋白质印迹
电池（5×105（每孔）接种在24孔板中，让其粘附过夜，然后在5 mM氯丙氨酸、AOC或γ-FBP 48小时。使用Tryple分离细胞，并使用蛋白酶抑制剂Cocktail III（加利福尼亚州生物处理生化公司）在裂解缓冲液（50μL；20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS）中裂解细胞。使用微量BCA法（Pierce）测量蛋白质，并将其装入4–12%的凝胶（Life Technologies）中，电泳并转移到PVDF膜上。用PBS-Tween20中的2.5%（w/v）BSA封闭膜，并与一级抗体（ASCT2，细胞信号传导；GAPDH，Abcam）和二级抗体孵育。在柯达成像仪（Kodak）上使用化学发光试剂（Pierce）检测二级HRP标记抗体（Millipore）。
