J控制释放。作者手稿；PMC 2016年11月10日提供。
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预防性维修识别码：PMC4640695型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院725075
一种用于癌症治疗和成像的高特异性药物载量放射治疗纳米颗粒
,一 ,b条和a、，c、，*
安德鲁·B·萨特利
一北卡罗来纳大学和北卡罗来那州立大学生物医学工程联合部，北卡罗来尼亚州教堂山，邮编27599
宏远
b条北卡罗来纳大学教堂山分校放射科生物医学研究成像中心，北卡罗来那州教堂山27599-7571
叶黄（Leaf Huang）
一北卡罗来纳大学和北卡罗来那州立大学生物医学工程联合部，北卡罗来尼亚州教堂山，邮编27599
c（c）美国北卡罗来纳大学埃塞曼药学学院分子药剂学部和药物输送纳米技术中心
一北卡罗来纳大学和北卡罗来那州立大学生物医学工程联合部，北卡罗莱纳州教堂山，27599
b条北卡罗来纳大学教堂山分校放射科生物医学研究成像中心，北卡罗来那州教堂山27599-7571
c（c）美国北卡罗来纳大学埃塞曼药学学院分子药剂学部和药物输送纳米技术中心
- 补充资料
1:图S1：177Lu-LCP和Free177氯-氯三药代动力学。数据表示为平均值±SEM。n=5177Lu无导线心脏起搏器，n=3免费177氯甲烷三.
GUID:53A34FAF-98D7-4571-B71D-7AF92AABE956
2:图S2：用于肿瘤生长抑制实验的H460荷瘤小鼠体重的相对变化。实验期间，小鼠体重没有明显减轻或增加。
GUID:DAD8E46E-B99E-4491-849E-64EBDD7630E6
三：图S3:A）注射DiI后24小时-177Lu-LCP、UMUC3/3T3肿瘤显示DiI-标记NP（红色）的肿瘤聚集更均匀。B） 未经治疗的UMUC3/3T3肿瘤比H460肿瘤具有更多的血管，表现为CD-31阳性区域更多（橙色）。
GUID:7714959F-2350-478C-B1D1-7CB71CC0EF16
4:图S4：250μCi治疗12天后，健康CD-1小鼠器官固定、切片并用苏木精和伊红染色177用于测试累积毒性的Lu-LCP或对照。比例尺=150μm。
GUID:E4926BBB-4C5A-4CDA-8B33-58CB09F9D69D
5:表S1：177Lu-LCP表征。蔗糖梯度纯化后，三次测量直径、zeta电位和PDI。
GUID:ADB37EC3-2280-43B4-841C-05F2F6B18495
6:表S2：生物分布177图中所示小鼠中的Lu–。SPECT和切伦科夫测量后，于t=24小时处死小鼠，并采集器官。左栏显示免费给予小鼠的器官积累177氯甲烷三右栏显示给药小鼠的器官积累177Lu-LCP。使用伽玛闪烁测量器官生物分布。
GUID:39E62F57-56BB-4611-BCE2-30D480C46412
摘要
我们已经开发出一种热致纳米颗粒，用于传递模型放射性核素177基于Lu的多功能脂质磷酸钙（LCP）纳米粒子输送平台。的特征177Lu LCP表明，放射性核素负荷可以增加几个数量级，而不会影响封装效率或177Lu-LCP，允许在制造过程中保持一致性，并克服纳米治疗典型的放大障碍。选择177Lu作为模型放射性核素体内通过双衰减模式的放射成像进行抗癌治疗177Lu.肿瘤堆积177使用SPECT和Cerenkov成像方式在活小鼠中测量Lu-LCP，并仅用一剂177Lu-LCP表现出显著性体内两种皮下异种移植物肿瘤模型中的肿瘤抑制作用。微环境和细胞毒性研究表明177Lu-LCP通过双链DNA断裂导致凋亡细胞死亡来抑制肿瘤生长，同时导致肿瘤微环境重塑为更无序、更少恶性的表型。
关键词：癌症、热疗、纳米粒子、高特异性药物负荷
介绍
标准的癌症治疗方案使用手术、化疗和放射治疗的组合来根除疾病。大多数接受放射治疗的患者接受外照射治疗，但全身内照射在过去十年中也取得了巨大的临床成功[1]. 与外部放射治疗通常用外部放射源发射的光子或电子轰击肿瘤区域不同，全身放射治疗通过静脉注射将放射性核素靶向肿瘤部位。因此，辐射源位于体内，低辐射发射距离仅允许治疗影响靠近粒子沉积的细胞。这与x射线或伽马射线从外部来源穿过身体的外照射疗法形成对比。目前全身放射治疗的金标准，称为放射免疫疗法，将放射性同位素螯合到肿瘤靶向单克隆抗体上。用放射性同位素标记的放射免疫治疗用泽瓦林90钇是第一种，于2002年被FDA批准用于治疗B细胞淋巴瘤[2]，但由于其高昂的成本和抗体介导的毒性，其临床成功受到了限制[三–5].
本文介绍了一种新的全身内放射治疗方法。我们之前已经开发了一种目标明确、用途广泛的纳米颗粒平台，称为L（左）国际病童协会C类钙P（P）磷酸盐（LCP）[6]. LCP由两种含有浓缩钙和磷酸盐的反相微乳液混合而成，通过它们的共沉淀作用将磷酸化的小分子、肽和核酸封装在无定形磷酸钙沉淀中[7–9]. 在本报告中，我们通过封装模型放射性同位素，开发了一种用于癌症治疗的高比药量热纳米颗粒，从而扩展了LCP平台的应用177镥(177卢）。三价阳离子（如镥）可被打入LCP中，因为它们与磷酸盐的溶解度比磷酸钙的溶解率低很多数量级。然后，磷酸盐倾向于与这些放射性同位素一起沉淀，甚至微量的磷酸盐也可以高效地被包裹起来。
药物的高封装效率通常只有在每个粒子中装入少量药物时才能实现，这需要大剂量的粒子才能达到治疗效果。这可能导致颗粒介导的毒性，并使临床放大非常困难和昂贵。我们的放射性同位素加载方法没有遇到这些问题。因为177由于Lu与磷酸盐的溶解度低，并且只有少量的177需要Lu来提供治疗效果，一批LCP的药物装载窗口可以跨越几个数量级，而不会影响177Lu封装效率或LCP形态，无需更改任何其他输入参数。
177Lu被选为模型放射性核素，因为它能够提供同步成像和治疗：177Lu可使用单光子发射计算机断层扫描（SPECT）进行检测，而β-衰变来自177Lu除了诱发可通过光学成像技术检测到的切伦科夫辐射外，还会对附近的细胞造成DNA损伤。因此，靶向输送这些放射性核素可以在治疗肿瘤的同时测量活小鼠体内的肿瘤蓄积。与化疗不同，放射性同位素如177Lu的衰变速率与环境无关，为肿瘤提供了与衰变速率一致的低持续剂量。因此，我们测试了177Lu-LCP实现持续和量化的治疗效果体内只吃了一剂。
材料和方法
2.0.1：材料
177氯甲烷三购自PerkinElmer（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。1,2-二油酰-锡-甘油-3-磷酸（DOPA）和1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）购自阿凡提极性脂质（Alabaster，AL）。N-（羰基-甲氧基聚乙二醇2000）-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐（DSPE-PEG2000）由NOF美国公司（纽约州怀特普兰斯）购买。如前所述，DSPE-PEG2000-茴香酰胺（DSPE-PEG-AA）是在我们实验室合成的[10]. 其他化学品从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）购买。
2.0.2：细胞系
在下述实验中使用了三种不同的细胞系：NCI-H460（H460）人非小细胞肺癌细胞、UMUC3人膀胱癌细胞和NIH/3T3（3T3）小鼠成纤维细胞。在一些实验中，使用已经用绿色荧光蛋白（GFP）稳定转染的3T3细胞。
2.0.3：实验动物
本手稿中的所有实验均使用6-8周龄雌性裸鼠。这些小鼠从国家癌症研究所（马里兰州贝塞斯达）购买，并在北卡罗来纳大学查佩尔山分校实验动物医学部繁殖。对这些动物进行的所有研究都得到了北卡罗来纳大学查佩尔山分校动物护理和使用委员会的批准。
2.1:177Lu-LCP的制备与表征
177Lu-LCP制造已修改[6,11]根据以前的出版物中所描述的内容。在圆底烧瓶中制备了两种反相微乳液。两种微乳液油相均含有73.7:6.7:9.7:10环己烷：正己醇：IgepalCO520:TritonX-100（v:v:v）。在氯仿中向一个油相（1:0.023油：DOPA v:v）中添加25mg/ml DOPA。含有100mM Na的磷酸盐水相（1:0.0125油：水v:v）2高性能操作4在0.0125M的浓度下，将NaOH加入DOPA油相，并搅拌。含有500mM CaCl的钙水相2和跟踪177氯甲烷三在0.0125M中，向其他油相添加HCl。五分钟后，将含有磷酸盐的油相添加到含有钙的油相中，并搅拌40分钟。然后将100%乙醇添加到油中（1:1乙醇：油v:v）并搅拌30分钟。通过12600g离心将LCP洗涤三次，去除上清液，用100%乙醇替换上清液并旋转溶液以重新悬浮LCP颗粒。卢、卡和PO4在混合过程中没有沉淀的被丢弃在初始洗涤的上清液中（约为输入的15%177Lu被移到这里），并且最小177在第二和第三上清液中检测到Lu信号。最终清洗后，将沉淀物溶解在氯仿中，并在10000g下离心五分钟。然后，上清液中含有有机-可溶性LCP核心，颗粒中含有任何在DOPA中未被良好包覆的沉淀物，因此不溶于氯仿（约输入量的15%177Lu被移到这里）。用这两种方法净化LCP芯确保177Lu只出现在LCP内部。然后将溶解于氯仿中的外叶脂质（OLL）添加到氯仿可溶核心中（40:40:18:2 DOPC:胆固醇：DSPE-PEG2000:DSPE-PEG2000-AA mol:mol:mo）（总OLL：初始油相v:v；20mM浓度下的所有脂质）。在使用DiI-标记的LCP的实验中，将溶解在氯仿中的DiI添加到具有OLL的核心中（1:100 DiI：总OLL mol:mol）。蒸发三氯甲烷，直到颗粒和脂质在小瓶上形成脂质膜。然后用80°C水将颗粒再水化至注射体积。对溶液进行旋涡和超声充分处理，然后在80°C下加热>10 min并被动冷却。茴香胺配体用于所有制剂中，以靶向UMUC3和H460细胞中过度表达的sigma受体[12,13].
在使用DiI-标记的Lu-LCP的实验中，使用蔗糖梯度超速离心（50000g，4 h）从过量游离DiI和掺入过量游离脂质体的DiI中纯化DiI-Lu-LCP。的封装效率177吕成177Lu-LCP由AA2010型“Nucleus”伽马闪烁计数器或Capintec放射性同位素校准仪CRC-127R测量，并计算为（信号来自177LCP核心中的Lu）/（来自177输入水相中的Lu）。177利用Malvern Nano ZS动态光散射仪测量蔗糖梯度超速离心后Lu-LCP的流体动力学直径和zeta电位。测量了三个不同批次的LCP。使用透射电子显微镜（TEM）证实了颗粒大小。
2.2：装载能力
要模拟177Lu加载到177Lu-LCP，微量177Lu补充了额外的非放射性物质175Lu.当Lu:Ca输入比从1:10000000增加到1:1时，除了增加175卢。177使用γ闪烁和177在北卡罗来纳大学教堂山分校教堂山分析和纳米制造实验室，使用TEM和能量色散X射线光谱仪（EDS）测量了Lu-LCP的形态/结构组成。TEM图像是使用TEM JEOL 2010F-FasTEM或TEM JOOL 100CX II拍摄的，EDS测量是使用TEM-JEOL 100CX-II拍摄的。
2.3：药代动力学和生物分布
健康裸鼠注射177Lu-LCP或免费177氯甲烷三已知活动。这个177Lu LCP或177氯甲烷三注入左尾静脉循环177Lu-LCP或177氯甲烷三通过在注射后的几个时间点从右尾静脉中取出20–30μl血液进行测量。使用伽玛闪烁读取信号，并用于计算血液中剩余的总信号。一个名为PKSolver的Microsoft Excel外接程序[14]用于药代动力学分析。在另一个实验中，H460或UMUC3/3T3荷瘤小鼠被注射治疗剂量为177Lu-LCP或免费177氯甲烷三.注射24小时后，处死小鼠，解剖其器官并阅读177Lu活动。
2.4：SPECT和切伦科夫成像
静脉注射2.5 mCi的UMUC3/3T3荷瘤裸鼠177Lu-LCP或免费177氯甲烷三24小时后，在北卡罗来纳大学校园的小动物成像设施使用小动物SPECT/CT系统（eXplore SPECCZT，GE Healthcare）对小鼠进行成像。SPECT图像是在能量窗设置为188–229keV的情况下拍摄的，接收的主要伽马光子来自Lu-77，峰值为208keV。使用小鼠狭缝准直器提供1.5mm横轴和2.5mm轴向分辨率的全身成像，使用针孔准直器进行更高分辨率（1mm各向同性分辨率）的局部身体成像。SPECT/CT成像后，立即将小鼠送往体内光学成像系统（IVIS-Kinetic，Perkin-Elmer），用于测量177卢。
2.5:在体内肿瘤抑制
6至8周龄裸鼠皮下接种含有5×10的100ul PBS6H460电池或5×106UMUC3电池+2.5×1063T3细胞位于左侧25%基质凝胶（BD基质高浓度）中。8-12天后，肿瘤达到100-150mm三，只给小鼠单次注射PBS（未经处理的小鼠），非放射性（冷）175Lu-LCP，游离放射性177氯甲烷三，或放射性177Lu-LCP。携带UMUC3/3T3肿瘤的小鼠接受200μCi/小鼠的剂量，携带H460肿瘤的鼠接受250μCi/鼠的剂量。每2天测量一次小鼠体重，直到未经治疗的小鼠达到人类终点。用数字卡尺测量肿瘤体积，并计算为（长x宽x深）/2。n=5–8。学生对用于统计分析的最终AUC进行t检验。
2.6肿瘤积聚
对患有s.c.H460或UMUC3/3T3肿瘤的裸鼠进行一次250μCi或200μCi的治疗177Lu-LCP或适当的控制。The lipid bilayer of the177用荧光小分子DiI标记Lu LCP颗粒，以允许在肿瘤中测量LCP。注射24小时后，处死小鼠，解剖肿瘤并将其切成两半。其中一半在OCT中冷冻，切片并安装以进行DiI-Lu-LCP成像，另一半固定在4%福尔马林中，嵌入石蜡中，切片以进行CD-31染色（1:100稀释兔初级抗体，Abcam#ab28364；1:100稀释抗兔647荧光次级抗体，Cell Signaling#4414）和DAPI复染。
2.7细胞毒性研究
200μCi治疗后1天、2天和4天177处死Lu-LCP或对照组、UMUC3/3T3荷瘤裸鼠，对其肿瘤进行解剖、固定和石蜡切片。相邻切片进行p-H2AX免疫荧光染色（1:100稀释的兔单克隆初级抗体，细胞信号#9718；1:100稀释抗兔647荧光次级抗体，细胞信息#4414）和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（DeadEnd™荧光TUNEL系统，Promega），带DAPI复染。
2.8微环境研究
用上述相同细胞数的UMUC3/3T3-GFP（荧光）肿瘤接种裸鼠。当肿瘤达到~400mm时三，小鼠用200μCi荧光标记的DiI处理-177Lu-LCP或控件。2天后，处死小鼠，解剖其肿瘤并在OCT中冷冻，方法是在4%福尔马林中固定2小时，然后在4°C的30%蔗糖溶液中培养过夜。冰冻肿瘤切片，DAPI复染成像，测量GFP和DiI分布。使用Matlab量化DiI分布。
单独的裸鼠接种UMUC3/3T3（非荧光）肿瘤。当肿瘤达到~300mm时三，小鼠接受200μCi的177Lu-LCP或控件。治疗4天后，对肿瘤进行解剖、固定，并用石蜡切片。相邻切片进行三色染色并用DAPI复染进行α-SMA免疫荧光染色（1:100稀释兔单克隆原代抗体，Abcam#ab5694；1:100稀释抗兔647荧光次级抗体，Cell Signaling#4414）。使用北卡罗来纳大学查佩尔山转化病理实验室的Aperio Scanscope对染色切片进行数字扫描。使用Imagescope和ImageJ软件进行定量分析。
2.9：毒性研究
裸鼠和CD-1小鼠接受250μCi177Lu-LCP或适当的对照组，在治疗12天后处死。解剖血液和器官。测量血清AST、ALT、BUN和肌酐水平，并用H&E染色器官，以测量组织形态学的任何变化。测量全血白细胞计数（WBC）、红细胞压积（HCT）、平均细胞体积（MCV）、红血球计数（RBC）、血红蛋白计数（HGB）和血小板计数（PLT）的变化。
结果
3.1:Lu-LCP的制造和表征
LCP纳米粒子平台优先封装177Lu在制造过程中在其固体无定形磷酸钙芯中（方案如). 只是微量的177由于镥与磷酸盐（k）的溶解度低得多，因此可以有效地包裹Lu服务提供商= 2×10−25) [15]与钙与磷酸盐的溶解度（k服务提供商= 1×10−7). 的制造协议177修改了Lu-LCP[6,11]从以前的出版物中最大化177Lu包封率（EE）约为70%，大部分损失发生在清洗和纯化过程中。使用蔗糖梯度离心法将颗粒从多余的空脂质体中分离出来后，通过动态光散射测量颗粒的直径为36±9 nm，多分散指数为0.27±0.05，zeta电位为-6.7±3.5 mV(补充表S1). 通过透射电子显微镜证实了颗粒大小(). 虽然手机输入不是必需的177由于茴香胺已被证明是一种有效的靶向配体，可对抗上皮性癌如UMUC3和H460中过度表达的sigma受体，因此Lu-LCP可达到治疗效果[12,13]由于受体介导的内吞作用将纳米粒子吸入细胞内并更接近核DNA，因此DSPE-PEG-Anisamide仅用于第2.1节所述的所有Lu-LCP制剂中，以提供最大的治疗效果统计机会。
177Lu-LCP配方。A） 描述一般配方程序的示意图。B） 最终TEM图像177Lu-LCP。C） 最终TEM图像177使用醋酸铀酰阴性染色的Lu-LCP。比例尺表示100 nm。
3.2：装载能力
优先加载177卢允许177制备的Lu-LCP具有非常高的放射性同位素浓度，因此允许在仍然主要由磷酸钙组成的颗粒中有非常高的药物负载。和表明等效批次LCP核心的药物装载窗口跨越数个数量级，而不影响177Lu封装效率高，不需要更改任何其他输入参数。此外，LCP形态在Lu:Ca输入比为1:1000时保持不变()根据EDS的测量结果，在其上方，Lu开始成为LCP的结构组成部分()，这将异质性引入配方。当Lu:Ca增加到1:1时，Lu迫使LCP中的几乎所有Ca形成LuPO的核心4但由于其固有的毒性，每个颗粒的重金属总剂量是不理想的。这些数据表明，保持理想封装和形态的最大Lu:Ca输入比为1:1000。在这个输入比下177Lu-enough处理100多个胶束时，可以将其封装在一个只有3.2 mL总油相的批次中。考虑到其他类型的LCP制剂在小白鼠研究中以120ml或以上的批量合成并不罕见，人们可以理解Lu-LCP是如何避免通常与纳米粒子相关的放大并发症的。此外全部的镥-约70 pmol/只小鼠，或6×10−4mg/kg-i用于达到治疗效果。这种低总剂量对减少重金属介导的毒性非常重要。综合来看，高载药窗口和低总质量的镥177Lu-LCP最大限度地减少了批次大小和毒性，同时允许每批次治疗大量动物。
177增加镥水平时的Lu-LCP封装效率。177Lu EE大约从1:100 Lu:Ca开始下降，n=2–3。
177不同Lu:Ca输入下的Lu-LCP形态。A–F）TEM图像177不同Lu输入下的Lu-LCP。G） 输出Lu百分比177基于Lu:Ca输入的Lu-LCP，通过能量色散X射线光谱（EDS）计算*未检测到Lu；可忽略的小LCP群体
表1
177Lu-LCP输入和输出活度基于20 Ci/mg镥的比活度，这是PerkinElmer输送的最低标准。Ca总是以PO的5倍摩尔过量给出4.稳定LCP配方的最高水平为1:1000 Lu:Ca。微量177Lu补充了非放射性物质175达到适当的Lu:Ca比值。
| Lu：钙输入（摩尔） | 人事军官4输入（摩尔） | 总Lu输入（摩尔） | 输入放射性*（mCi） | 177卢EE | 输出放射性（mCi） |
|---|
| 1:1×107 | 2.0×10−6 | 1.0×10−12 | 0.0035 | 0.68 | 0.0024 |
| 1:100,000 | ” | 1.0×10−10 | 0.354 | 0.70 | 0.25 |
| 1:1000 | ” | 1.0×10−8 | 35.4 | 0.69 | 24.4 |
| 1:100 | ” | 1.0×10−7 | 354 | 0.61 | 217 |
| 1:9 | ” | 1.1×10−6 | 3933 | 0.22 | 865 |
| 1:1 | ” | 1.0×10−5 | 35400 | 0.19 | 6549 |
3.3：药代动力学和生物分布
药物动力学和生物分布177在荷瘤裸鼠中测定Lu-LCP。两室模型[14]用于计算清除半衰期，分配半衰期t为0.52 h1/2α、 消除半衰期为7.28小时，t1/2β、 如所示.还免费进行了药代动力学分析177氯化铝三注射后30分钟内，血液清除率接近80%(图S1). 因此可以得出结论，小鼠的循环信号177Lu-LCP确实来自完整的粒子。生物分布177Lu-LCP和免费177荷瘤小鼠体内的Lu被给予.177Lu-LCP在肿瘤中显示出显著的蓄积，在纳米颗粒清除器官（肝脏和脾脏）中也有蓄积，因为它太大而无法清除肾脏。相反，免费177Lu是一种很小的离子，可以通过肾脏清除，但也可以选择性地积聚在骨骼中，镧系元素就是众所周知的[16]. 免费177Lu也显示出一些肾脏积聚，这可能发生在元素的快速肾脏清除过程中().
177Lu-LCP药代动力学和生物分布。A） 静脉注射的PK曲线177Lu-LCP适用于两室模型；n=5。B） 静脉注射177Lu-LCP或免费177氯甲烷三; n=3-4。H460肿瘤和UMUC3/3T3（U/T）肿瘤在不同的小鼠中皮下接种*免费BD177未在H460荷瘤小鼠中测试Lu。
3.4：SPECT和切伦科夫成像
除了允许使用伽马闪烁的简单检测方法外，177Lu也可用作SPECT对比剂，允许测量177Lu在活小鼠体内的生物分布和肿瘤蓄积。显示了177注射24小时后的Lu-LCP，包括可见的177卢在肿瘤中。相反，免费177氯甲烷三不会在肿瘤中积聚，因此使用SPECT/CT成像无法看到肿瘤积聚().
注射乌司他丁后24小时裸鼠左侧皮下UMUC3/3T3肿瘤SPECT/CT图像177Lu-LCP（图5A-E）或自由177Lu（图5F–H）。小鼠狭缝准直器用于全身成像：A）左矢状，B）冠状，C）中矢状，F）中矢形和G）冠状。在D）、E）和H）中使用针孔准直器获得更高分辨率的轴向和左矢状视图。177Lu-LCP在肿瘤、肝脏和脾脏中积累，而游离177Lu积聚在骨骼和肾脏中，但不在肿瘤中。
有趣的是，177Lu还允许通过β-发射成像，β-发射是诱导其治疗效果的相同衰变产物（电子）。当β粒子在其平均路径长度约250μm的范围内穿过组织时，它们会从介质中以可见光谱中的能量诱发光子发射。这种所谓的切伦科夫光是用体内光学成像系统()，也显示肿瘤摄取177Lu-LCP并证实SPECT/CT成像期间获得的结果。切伦科夫成像是一种特别有趣的成像方式，因为它为SPECT提供了一种更便宜、更方便的替代方法，而SPECT在该领域并不普遍使用。尽管其空间分辨率和穿透深度不如SPECT或PET高，但切伦科夫成像使用较便宜的硬件，如果放射性同位素和剂量足够，则只需要几秒钟的采集时间。
左翼皮下携带UMUC3/3T3肿瘤裸鼠的Cerenkov发光图像。注射2.5 mCi后24小时小鼠的发光图像（A）和普通照片（B）177Lu-LCP。注射2.5 mCi-free 24小时后小鼠的发光图像（C）和普通照片（D）177氯甲烷三.演示光学图像177Lu无导线心脏起搏器游离时在肝脏、脾脏和肿瘤中积聚177氯甲烷三主要积聚在脊椎。数据由IVIS光学系统采集。
成像完成后，解剖小鼠器官177使用伽玛闪烁读取Lu信号。这些值如所示补充表S2.
3.5条：在体内肿瘤生长抑制
评估单一治疗的有效性177卢，一剂177将Lu-LCP静脉注射到两种不同的皮下异种移植瘤模型中。其中一个模型是我们实验室先前开发的具有侵袭性的富含基质的人类膀胱癌模型。该模型使用UMUC3膀胱癌细胞和NIH-3T3成纤维细胞生成肿瘤，该肿瘤与患者膀胱癌相比，更类似于UMUC3肿瘤[17]. 如所示，单次200μCi剂量177与非放射性治疗的肿瘤相比，Lu-LCP显示出持续且显著的肿瘤生长抑制175Lu-LCP和肿瘤仅免费接收177氯甲烷三.177Lu-LCP还测试了攻击性和抗辐射性[18]H460人非小细胞肺癌模型；增加250μCi的剂量177如图所示，Lu-LCP具有统计学意义上的肿瘤生长抑制作用。增加的剂量仍然很低，足以避免小鼠体重的变化(图S2)研究过程中的累积剂量没有显著提高肝/肾毒性标志物().
体内两种皮下异种移植瘤模型的肿瘤生长抑制。非放射性175Lu被加载到LCP NP中，作为车辆控制。每只小鼠在第0天静脉注射一剂（箭头所示）。A） 补充小鼠3T3成纤维细胞的人类UMUC3膀胱癌。B） 人类H460非小细胞肺癌。初始肿瘤大小~100–150 mm三; n=5–8；†p<0.03，p<5e-5，*p<0.015。
表2
的毒性177用250μCi治疗12天后测量小鼠体内的Lu177检测累积毒性的Lu-LCP或对照：A）健康但免疫功能受损的裸鼠的血清蛋白值；B） 健康CD-1小鼠的血清蛋白值；C） 对健康CD-1小鼠进行全血分析，测量白细胞计数（WBC）、红细胞压积（HCT）、平均细胞体积（MCV）、红血球计数（RBC）、血红蛋白计数（HGB）和血小板计数（PLT）。177Lu-LCP治疗不会出现明显的累积肾/肝毒性，但会导致白细胞和血小板减少。
| A） 裸小鼠 | 尿素氮（mg/dL） | 肌酐（mg/dL） | AST（U/L） | 高度（U/L） |
|---|
| 未经处理 | 23 ± 0.5 | 0.1 ± 0 | 99 ± 13 | 37±2 |
| 175卢-LCP | 23 ± 1.0 | 0.1 ± 0 | 102 ± 2 | 34 ± 5 |
| 250μCi自由177卢 | 20 ± 1.7 | 0.1 ± 0 | 88 ± 16 | 41 ± 1 |
| 250μCi177卢-LCP | 24 ± 1.9 | 0.1 ± 0 | 73 ± 4 | 40 ± 4 |
| 正常范围 | 8–33 | 0.2–0.9 | 54–298 | 17–77 |
| B） CD-1小鼠 | 尿素氮（mg/dL） | 肌酐（mg/dL） | AST（U/L） | 高度（U/L） |
|---|
| 未经处理 | 20 ± 0.3 | 0.1 ± 0 | 69 ± 14 | 33 ± 1 |
| 175卢-LCP | 21±1.3 | 0.2 ± 0.03 | 91 ± 12 | 35 ± 2 |
| 250μCi自由177卢 | 15 ± 0.7 | 0.1 ± 0 | 109±15 | 41 ± 3 |
| 250μCi177卢-LCP | 15 ± 0.5 | 0.1 ± 0 | 125 ± 9 | 45 ± 5 |
| 正常范围 | 8–33 | 0.2–0.9 | 54–298 | 17–77 |
| C） CD-1小鼠 | 白细胞计数（10三/μl） | HCT（%） | MCV（飞行） | 红细胞（106/μl） | 血红蛋白（克/分升） | 板（10三/μl） |
|---|
| 未经处理 | 4.5 ± 0.2 | 52.6 ± 0.2 | 48.9 ± 0.2 | 10.7 ± 0.1 | 16.3 ± 0.1 | 892 ± 36 |
| 175卢-LCP | 5.2±0.7 | 50.6 ± 1.1 | 51.0 ± 1.4 | 10.0 ± 0.5 | 15.7 ± 0.3 | 679 ± 54 |
| 250μCi自由177卢 | 2.3±0.4 | 47.6 ± 1.7 | 53.8 ± 3.8 | 8.9 ± 0.4 | 14.6 ± 0.3 | 926 ± 34 |
| 250μCi177卢-LCP | 0.3 ± 0.1 | 38.8 ± 2.2 | 50.5 ± 1.6 | 7.7±0.4 | 12.0 ± 0.6 | 217 ± 24 |
| 正常范围 | 2.6 – 10.1 | 32.8 – 48.0 | 42.3 – 55.9 | 6.5 – 10.1 | 10.1 – 16.1 | 780 – 1540 |
3.6：肿瘤积聚
比较177在H460和UMUC3/3T3肿瘤中的Lu-LCP，荧光小分子DiI被纳入纳米颗粒的外叶中。DiI已广泛用于脂质体制剂和细胞膜标记物，众所周知，它忠实地存在于脂质双层的疏水部分[19,20]. 注射DiI-标记物24小时后处死荷瘤小鼠177对Lu-LCP和肿瘤切片进行DiI摄取成像。图S3A表明与H460肺癌肿瘤相比，膀胱癌肿瘤对颗粒的摄取更均匀。这可能是因为膀胱癌肿瘤比H460肿瘤含有更多的CD-31阳性区域(图S3B)，对应于更多的脉管系统。这也可以解释177图中所示的UMUC3/3T3肿瘤中的Lu-LCP因此，选择UMUC3/3T3膀胱癌肿瘤模型进行更详细的机理分析。
3.7：肿瘤生长抑制机制：细胞毒性研究
虽然许多化疗和使用外照射的治疗需要多剂量才能产生治疗效果，但只有一剂177Lu-LCP为肿瘤提供持续治疗177Lu缓慢衰变，导致肿瘤生长持续抑制数天。我们希望研究这种持续效应发生的机制，并假设177Lu会持续诱导双链DNA断裂。为了研究这一现象，我们进一步研究了富含基质的膀胱癌模型。用200μCi的177Lu-LCP或适当的控制。p-H2AX的免疫荧光染色，这是一种对DNA双链断裂作出反应的磷酸化蛋白[21]，表明蛋白质的最大诱导发生在治疗后两天，并且即使在治疗后四天仍保持升高(). 这种DNA损伤通过DNA的凋亡碎片导致细胞死亡，通过TUNEL分析测定，这在治疗后四天最易诱发(). 这表明177Lu-LCP在约48小时后引起最大DNA损伤，这种损伤随后很快转化为凋亡细胞死亡。177Lu LCP诱导的最大H2AX磷酸化和细胞死亡显著高于游离的177Lu（p<0.05），这两种治疗之间细胞毒性作用模式的差异可能是由于药物动力学/动力学的差异177Lu很快从循环中清除，并可能在更早、更短暂的时间内沉积到肿瘤中，并且与肿瘤内分布不同177Lu-LCP。
细胞毒性177体内Lu-LCP：用200μCi的177Lu-LCP或对照组在给药后1、2或4天被杀。图面板A显示带有或不带有DAPI（蓝色）的UMUC3/3T3肿瘤切片中的p-H2AX-阳性细胞（红色）。图面板B显示了含有和不含DAPI（蓝色）的肿瘤切片中的TUNEL阳性细胞（绿色）。图面板B中的截面取自图面板A中显示的相邻截面。对TUNEL或p-H2AX阳性细胞的五个代表性字段进行了量化。图面板A和B中显示的图像表示量化程度第三高的字段。平均值如图C所示：两天后p-H2AX最高上调（红色）177Lu-LCP处理，而最高TUNEL诱导（绿色）发生在4天后177Lu-LCP治疗*p<0.007**与对照组相比p<0.0005。比例尺=100μm。
3.8：肿瘤生长抑制机制：微环境研究
还观察到肿瘤微环境的变化：显示在用177与未经治疗和对照治疗的相同大小的肿瘤中存在的有组织成纤维细胞结构相比，Lu-LCP（参见). 这些图像清楚地显示，未经治疗的肿瘤中的成纤维细胞可以组织成一个明确的形态，形成肿瘤巢，而经治疗的癌症中的成细胞细胞177Lu-LCP是分散的，没有这个成熟的组织。治疗四天后，紊乱的成纤维细胞结构持续存在()，伴随着肿瘤中胶原结构的变化，未经治疗的肿瘤中的大片胶原被更短、更弯曲的胶原纤维取代(). 众所周知，未经治疗的肿瘤中存在的有组织的成纤维细胞结构和更有序、线性化和捆绑的胶原纤维与更成熟和恶性的表型相关，而具有短、短、短的成纤维组织结构紊乱，与治疗肿瘤的胶原纤维一样，弯曲的胶原纤维表明肿瘤微环境在结构和功能上不太适合生长和进展[22–26].
UMUC3/3T3-GFP（绿色）肿瘤切片，肿瘤巢轮廓为白色。A）未经治疗的肿瘤。B）行t=2天后用冷DiI治疗-175Lu-LCP（红色）。C）行t=2天后用热DiI治疗-177Lu LCP（红色）。D行）冷DiI治疗后2天的高倍图像-175Lu-LCP（红色）。E）热DiI治疗后2天的高倍图像-177Lu-LCP（红色）；无组织的成纤维细胞结构不允许肿瘤巢的形成。每行显示每组的代表性照片，包括几个肿瘤和肿瘤切片。比例尺=A–C行300μm，D–E行50μm。
UMUC3/3T3肿瘤切片微环境结构t=4天后177Lu-LCP:A–D）UMUC3/3T3肿瘤切片中成纤维细胞标记物α-SMA（绿色）的染色。图A和图C显示了α-SMA在未经治疗的肿瘤和用177Lu-LCP；比例尺=200μm。白色虚线框在图B和D中放大；比例尺=20μm。E–H）未经治疗的肿瘤中的三色染色（E）或t=治疗后4天（F）。右下角的插入物G–H经过处理，显示出胶原蛋白染色的更为孤立的视图。箭头显示区域在插入中的位置。比例尺=50μm。
我们还希望测量Lu LCP在肿瘤内的定位。与必须进入靶细胞才能发挥治疗效果的传统化疗不同，内照射可以在距离放射源数个细胞长度的距离处损伤细胞。β-颗粒来自177例如，Lu的最大能量约为500 keV，组织中的平均路径长度为200–300μm[27]最大路径长度约为该值的4倍[28].177然后，Lu-LCP可能能够为不吸收颗粒的细胞提供治疗效果，这一点特别重要，因为一般情况下纳米颗粒的肿瘤内传递具有异质性。我们认为肿瘤中的大多数细胞在术后会受到β粒子损伤177Lu-LCP分布，但希望测量177Lu-LCP是为了计算细胞和粒子之间的这种重要空间关系。所述实验中使用的LCP的脂质膜和用荧光DiI标记，用蔗糖梯度离心法纯化多余的DiI，以测量颗粒在整个肿瘤中的分散度。然后分析不同肿瘤中几个区域的肿瘤切片，以量化细胞和纳米粒子之间的距离。显示，近100%的现场细胞距离最近的Lu-LCP只有50μm，很好地处于β粒子的平均路径长度内，即使考虑的唯一纳米粒子是那些存在于二维平面-Lu-LCP中的纳米粒子，它们位于z方向，只会增加给定细胞范围内的粒子。这证实了这一说法，即虽然并非所有肿瘤细胞都吸收了颗粒，但所有肿瘤细胞均易受所输送的治疗有效载荷的影响。
t=2天时DiI分布的定量：A）给予DiI的UMUC3/3T3-GFP肿瘤-177Lu-LCP；标尺=500μm；B） 从面板A隔离DiI信号；C） 热图显示每个细胞与其最近的Lu-LCP的距离，其中黑色和蓝色区域显示细胞和粒子之间的近距离区域；D） Lu-LCP相对细胞距离的量化；n=1.75×1068段细胞；n=4个截面177Lu-LCP和175Lu-LCP。
用250μCi治疗12天后，健康裸鼠器官固定、切片并用苏木精和伊红染色177用于测试累积毒性的Lu-LCP或对照。一些去细胞区域（箭头所示）在用177Lu-LCP。比例尺=150μm。
3.9：毒性研究
评估177在小鼠中使用Lu-LCP，我们用单剂量250μCi的177Lu无导线心脏起搏器，这是本研究中使用的最高剂量。治疗12天后处死小鼠，以评估辐射的累积效应。在12天的研究结束时，对小鼠器官进行解剖和切片，测量肾脏和肝脏毒性的血清标志物（ALT、AST、BUN和肌酐），并分析免疫活性CD-1小鼠的全血白细胞计数（WBC）、红细胞压积（HCT）、平均细胞体积（MCV）、红血球计数（RBC）的变化血红蛋白计数（HGB）和血小板计数（PLT）。将这些结果与适当的对照组和这些值的正常范围进行比较。H&E染色后裸鼠肾脏、肝脏、心脏、肺、皮肤和小肠切片的形态学与正常组织无差异()或在CD-1小鼠中(图S4). 在裸鼠和CD-1小鼠中，肾和肝毒性的血清标志物也保持在正常范围内()治疗后。数据确实显示了这种治疗的一些耐受性良好的副作用，包括脾脏形态的差异以及白细胞和血小板计数下降超出正常范围。血液学副作用在癌症治疗期间很常见，使用免疫增强剂等很容易处理，但本研究中未使用。这些副作用都没有导致小鼠体重下降(图S2).
讨论
在本文中，我们描述了一种新的全身内放射治疗方法，将我们的LCP平台的抗癌应用扩展到包括具有高比药量的热纳米颗粒。优先吸收177Lu into LCP允许大量177在不改变LCP形态或封装效率的情况下，将Lu封装在一小批颗粒中。因此，由于可以在同一台台式机上为小鼠或人类制造治疗剂量，因此消除了在该领域普遍存在的纳米颗粒放大的困难。
不应低估将放射性同位素装入无导线心脏起搏器的治疗优势。177Lu的γ辐射允许带电体内SPECT显像测量肿瘤堆积177Lu-LCP为未来原位肿瘤的治疗铺平了道路，这将是一种更具临床相关性的“诊断”程序。β衰变来自177Lu还通过DNA双链断裂导致显著的肿瘤抑制，同时诱导Cerenkov辐射成像。由于治疗性β-发射也是成像对比剂，切伦科夫成像是一个很好的临床应用示例。与SPECT相比，切伦科夫成像正确估计了177Lu-LCP只需很少的时间和成本。这为一些应用程序提供了机会，例如通过快速连续拍摄许多图像来动态查看生物分布和清除的早期阶段。因为LCP中Lu的高负载量广泛适用于其他几种多阳离子放射性金属，例如β-发射器和有效的切伦科夫试剂90Y、 切伦科夫成像作为一种有趣而有用的热学应用值得讨论。
作为我们肿瘤抑制数据的后续行动，我们有兴趣评估这种治疗对肿瘤微环境的任何显著影响，我们通过测量肿瘤中的成纤维细胞和胶原结构来评估这些变化。肿瘤微环境的变化可以通过深入研究β-辐射如何导致双链DNA断裂来解释，双链DNA在治疗肿瘤中升高。通常，β-辐射被归类为低线性能量转移（LET）；也就是说，β粒子在沿其路径行进时，每单位长度沉积一小部分能量[28]. 在大多数情况下，DNA损伤不是通过DNA链和β粒子本身之间的直接相互作用发生的。对于低LET发射器，如177Lu，众所周知，大多数DNA损伤是由释放的β-粒子与水分子相互作用并使其沿路径激化时产生的活性氧物种（ROS）增加引起的。然后，诱导的活性氧损伤DNA，并在“间接辐射效应”中引起单链和双链断裂[28].
众所周知，氧化应激会导致细胞和细胞外环境的许多变化，尤其是在癌症等快速重塑的组织中，肌动蛋白和胶原蛋白只是易受氧化损伤的一些蛋白质[29–33]. 肌动蛋白是细胞的重要结构成分，也是3T3成纤维细胞间粘附连接的结构参与者[34]. 肌动蛋白上的半胱氨酸残基容易受到氧化损伤，这种损伤可以阻止聚合，导致解聚，并影响细胞中肌动蛋白的组织，可能限制肿瘤中成纤维细胞的组织。胶原蛋白的稳定性也受到氧化损伤的影响，因为胶原蛋白α带的断裂可以将胶原蛋白的降解温度降低到体温以下，并阻止胶原蛋白原纤维的形成[30,31]. 这些结果表明，累积ROS损伤可能会导致整体上观察到的变化体内胶原和成纤维细胞结构如图所示和,禁止动态形成捆绑的胶原和有组织的成纤维细胞结构，这些结构与在更晚期和侵袭性肿瘤中发现的耐药肿瘤巢穴的形成有关。
通过以下途径抑制肿瘤生长177Lu-LCP可能通过利用癌症中观察到的不可控生长和过度微环境重塑而发生。持续低剂量的辐射会破坏肿瘤细胞DNA，而肿瘤细胞DNA具有较少的活性修复机制，比健康细胞分裂得更快，同时抑制微环境向恶性肿瘤的发展。这样可以在保持受试者健康的剂量下持续进行癌症治疗。
这种放射性同位素装载方法的优点之一是它广泛应用于许多三价放射性金属，例如其他治疗性放射性核素，如90Y或192我，他们是这个学科未来工作的理想人选。考虑到许多小分子药物之前已经被封装在LCP中，因此使用同一LCP颗粒中的放射治疗和放射增敏化学治疗的联合治疗也应该是可能的。
未来的工作还应调查全身给予放射治疗性LCP是否是最有效的给药方法。应使用宏观和微观剂量计算来确定小鼠的吸收剂量，以及纳米颗粒的分布如何需要与外部光束的剂量不同的计算。在一个潜在的本地交付场景中，高负载177Lu-LCP，192Ir-LCP，或90Y-LCP可以直接注射到前列腺肿瘤中，创建一种纳米气管治疗方法，在这种方法中，修饰颗粒会在前列腺局部稳定扩散，但不会进入体循环。
结论
放射性核素加载到177Lu-LCP可以增加几个数量级，而不会影响177Lu包封效率或LCP形态，生成具有高放射性同位素浓度的纳米颗粒，克服纳米治疗典型的放大障碍，并将重金属毒性降至最低。选择177Lu作为模型放射性核素体内通过DNA损伤和微环境重塑进行抗癌治疗，并允许活体动物SPECT/CT和切伦科夫成像。随着LCP介导的放射性核素治疗研究的继续，可能会考虑将其他核素与化疗药物结合用于几种不同的治疗方法。
补充材料
1
图S1：177Lu-LCP和Free177氯-氯三药代动力学。数据表示为平均值±SEM。n=5177Lu-LCP和n=3免费177氯甲烷三.
2
图S2：用于肿瘤生长抑制实验的H460荷瘤小鼠体重的相对变化，如。实验期间，小鼠体重没有明显减轻或增加。
三
图S3:A）注射DiI后24小时-177Lu-LCP、UMUC3/3T3肿瘤显示DiI-标记NP（红色）的肿瘤聚集更均匀。B） 未经治疗的UMUC3/3T3肿瘤比H460肿瘤具有更多的血管，表现为CD-31阳性区域更多（橙色）。
4
图S4：用250μCi治疗12天后，用苏木精和伊红固定、切片和染色的健康CD-1小鼠器官177用于测试累积毒性的Lu-LCP或对照。比例尺=150μm。
5
表S1：177Lu-LCP表征。蔗糖梯度纯化后，三次测量直径、zeta电位和PDI。
6
表S2：生物分布177图中所示小鼠中的Lu–在SPECT和切伦科夫测量后，于t=24小时处死小鼠，并采集器官。左栏显示免费给予小鼠的器官积累177氯化铝三右栏显示给药小鼠的器官积累177Lu-LCP。使用伽玛闪烁测量器官生物分布。
致谢
ABS得到了国家科学基金会研究生研究奖学金项目的支持。我们感谢北卡罗来纳大学生物医学成像研究中心的小动物成像设施，特别是工作人员凯文·古利和约瑟夫·梅里尔提供SPECT/CT和切伦科夫成像服务。成像核心部分由NCI Grant#P30-CA016086-35-37提供支持。这项工作得到了NIH拨款CA149363、CA151652和CA149387的支持。
缩写
| AA公司 | 茴香胺 |
| 多巴 | 1,2-二油酰-锡-甘油-3-磷酸 |
| DOPC公司 | 1,2-二油酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱 |
| DSPE-PEG2000型 | N-（羰基-甲氧基聚乙二醇2000）-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐 |
| EDS公司 | 能量色散X射线光谱学 |
| 电气工程师 | 封装效率 |
| K（K）服务提供商 | 溶解度积常数 |
| LCP公司 | 脂质-磷酸钙 |
| 卢 | 镥 |
| SPECT技术 | 单光子发射计算机断层成像 |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 |
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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